鼻咽癌患者中EB病毒抗體研究概述

吳文娟，王新明，許東勤，鄭凱，丁瑞賢

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016 ）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）作為一種鼻咽黏膜處的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)均會(huì)發(fā)生，但是70%的鼻咽癌患者出現(xiàn)在中國，因此，又稱“中國癌”。在中國，鼻咽癌主要發(fā)生在廣東、廣西、福建等中南部沿海地區(qū)，且男性陽性率高于女性，鼻咽癌患者主要為中年人，少數(shù)為年輕人［1］。在北非、加拿大等地，NPC 的發(fā)病率也很高［2］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的分類（2003 年版）標(biāo)準(zhǔn)，NPC 包括以下幾類：角化型鱗狀細(xì)胞癌（a 類）、非角化型鱗狀細(xì)胞癌（b類）和基底細(xì)胞樣鱗狀細(xì)胞癌［3］。我國中南部地區(qū)主要為非角化的鼻咽癌，并與EB 病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染有很大關(guān)系。引發(fā)NPC 的原因有遺傳易感性、飲食原因和EBV 感染等。1980 年，第一次發(fā)現(xiàn)EBV 感染與NPC 之間的聯(lián)系，在鼻咽癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)了高滴度的EBV 抗體，其中包括EB 病毒衣殼抗原（viral capsid antigen,VCA）抗體和早期抗原（early antigen,EA）抗體，后來，采用原位雜交證實(shí)了NPC 細(xì)胞中的EBV 基因組［4］。鼻咽癌惡性率高，早期可發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。許多患者在出現(xiàn)明顯癥狀后，已經(jīng)處于晚期階段，因此鼻咽癌的早診早治非常重要。

EBV 屬于人類皰疹病毒 4 型（human herpesvirus 4,HHV-4），是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤病毒，EBV 為雙鏈DNA 病毒，基因全長172 kb［5］。序列分析研究發(fā)現(xiàn)，EB 病毒DNA 有84 個(gè)開發(fā)閱讀框，在病毒復(fù)制周期中大約編碼110 個(gè)基因，主要表達(dá)EA、VCA、核心抗原（nucleus antigen,NA）等60 多種蛋白［6-10］。機(jī)體會(huì)針對這些抗原產(chǎn)生特異性抗體，EBV 原發(fā)感染首先出現(xiàn)的是VCA-IgM抗體，大約3～15 d VCA-IgG 抗體出現(xiàn)，恢復(fù)期會(huì)產(chǎn)生NA-IgG 抗體；急性感染期EA-IgG 抗體產(chǎn)生，如果VCA-IgA 和EA-IgA 抗體陽性表明EBV 抗原的持續(xù)刺激，主要用于EBV 相關(guān)疾病的診斷，比如鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、慢性活動(dòng)性EBV 感染等［11-14］。關(guān)于鼻咽癌專家共識(shí)和指南中提到的EBV 抗體筆者進(jìn)行了總結(jié)，如表1 所示。專家共識(shí)和指南中均指出EBV 抗體可用于鼻咽癌的診斷或者監(jiān)測，但是至于鼻咽癌患者不同臨床分期以及治療過程中的EBV 抗體出現(xiàn)順序以及陽性率情況目前還沒有明確的研究，這就導(dǎo)致EBV 抗體在監(jiān)測鼻咽癌臨床分期和治療后監(jiān)測應(yīng)用中缺乏一定的理論依據(jù)。

表1 鼻咽癌指南或?qū)＜夜沧R(shí)關(guān)于EBV 抗體的推薦意見

基于以上鼻咽癌專家共識(shí)和指南，并結(jié)合專家學(xué)者的研究成果，選擇EBV VCA-IgA、VCAIgM、EA-IgA、EA-IgG、NA1-IgA 5 種抗體進(jìn)行鼻咽癌患者中EBV 抗體的研究。選擇鄭州安圖生物工程股份有限公司在研的EB 病毒早期抗原IgA 抗體檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）、EB 病毒早期抗原IgG 抗體檢測試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）、EB 病毒核抗原IgA 抗體檢測試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）、EB 病毒衣殼抗原IgA 抗體檢測試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）、EB 病毒衣殼抗原IgM 抗體檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法），通過臨床樣本檢測分析鼻咽癌患者中各抗體陽性率情況，為后期EBV 抗體檢測在鼻咽癌臨床中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 本臨床試驗(yàn)選擇臨床確診為鼻咽癌患者的血清或血漿樣本2 068 份進(jìn)行檢測，樣本來自廣東省（鼻咽癌高發(fā)區(qū)）不同地區(qū)。

1.1.2 樣本的采集與保存 樣品采集、處理后在室溫下存放不能超過48 h；若48 h 內(nèi)未進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)將樣品置于2℃～8℃冷藏，分離后的樣品可在2℃～8℃保存7 d；如需長時(shí)間儲(chǔ)存或運(yùn)輸，應(yīng)先提取血清或血漿，置于-20℃保存12 個(gè)月，避免反復(fù)凍融。冷凍保存的樣品恢復(fù)至室溫，輕輕搖勻，離心除去不溶性物質(zhì)。

1.1.3 試劑 鄭州安圖生物工程股份有限公司在研的EB 病毒早期抗原IgA 抗體檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）、EB 病毒早期抗原IgG 抗體檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）、EB 病毒核抗原IgA抗體檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）、EB 病毒衣殼抗原IgA 抗體檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）、EB 病毒衣殼抗原IgM 抗體檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）。歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）有限公司的抗EB 病毒衣殼抗原抗體IgM 檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）Anti-EBV-CA ELISA（IgM）、抗EB 病毒早期抗原IgA 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）Anti-EBV-EA-D ELISA（IgA）；鄭州安圖生物工程股份有限公司在產(chǎn)的EB 病毒早期抗原IgG 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）、EB 病毒殼抗原IgA 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）、EB 病毒核抗原IgA 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）。

1.1.4 主要儀器 安圖AutoLumo A2000 Plus 化學(xué)發(fā)光檢測儀、安圖LUMO 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。

1.2 方法

采用盲法分別用鄭州安圖生物工程股份有限公司在研的EBV5 項(xiàng)試劑及已上市試劑對收集的2 068 份鼻咽癌患者樣本進(jìn)行平行檢測。然后通過SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)目與上市產(chǎn)品的符合率以及單項(xiàng)目、多項(xiàng)目陽性率情況。

采用交叉四格表的方法計(jì)算考核試劑與對比試劑檢測結(jié)果的陽性符合率、陰性符合率和總符合率及其95%置信區(qū)間，并進(jìn)行Kappa 一致性分析，見表2。

表2 交叉四格表法計(jì)算考核試劑與對比試劑的符合率

陽性符合率=a/(a+c)×100%

陰性符合率=d/(b+d)×100%

總符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%

采用交叉四格表的方法計(jì)算考核試劑血清或血漿檢測結(jié)果的陽性符合率、陰性符合率和總符合率及其95% 置信區(qū)間，并進(jìn)行Kappa 一致性分析。

2 結(jié)果

2.1 EBV 抗體檢測試劑盒符合率結(jié)果統(tǒng)計(jì)

檢測VCA-IgA 抗體，安圖磁微粒與已上市安圖酶免結(jié)果陽性符合率為99.90%（1 034/1 035），陰性符合率為99.90%（1 032/1 033），總符合率為99.90%。因此，安圖磁微粒與已上市安圖酶免在結(jié)果判定上有良好的一致性（Kappa=1）。見表3。

表3 VCA-IgA 抗體檢測試劑盒比對結(jié)果（例）

檢測VCA-IgM 抗體，安圖磁微粒與已上市歐蒙酶免結(jié)果陽性符合率為100%（1/1），陰性符合率為100%（2 067/2 067），總符合率為100%。因此，安圖磁微粒與已上市歐蒙酶免在結(jié)果判定上有良好的一致性（Kappa=1）。見表4。

表4 VCA-IgM 抗體檢測試劑盒比對結(jié)果（例）

檢測EA-IgA 抗體，安圖磁微粒與已上市歐蒙酶免結(jié)果陽性符合率為99.85%（679/680），陰性符合率為99.42%（1 380/1 388），總符合率為99.56%，因此，安圖磁微粒與已上市歐蒙酶免在結(jié)果判定上有良好的一致性（Kappa=1）。見表5。

表5 EA-IgA 抗體檢測試劑盒比對結(jié)果（例）

檢測EA-IgG 抗體，安圖磁微粒與已上市安圖酶免結(jié)果陽性符合率為100%（1 486/1 486），陰性符合率為99.66%（580/582），總符合率為99.90%，因此，安圖磁微粒與已上市安圖酶免在結(jié)果判定上有良好的一致性（Kappa=1）。見表6。

表6 EA-IgG 抗體檢測試劑盒比對結(jié)果（例）

檢測NA1-IgA 抗體，安圖磁微粒與已上市安圖酶免結(jié)果陽性符合率為100%（1 030/1 030），陰性符合率為99.61%（1 034/1 038），總符合率為99.81%，因此，安圖磁微粒與已上市安圖酶免在結(jié)果判定上有良好的一致性（Kappa=1）。見表7。

表7 NA1-IgA 抗體檢測試劑盒比對結(jié)果（例）

試驗(yàn)結(jié)果表明，在鼻咽癌患者中，71.95%的患者EA-IgG 抗體陽性，50.00% 的患者VCA-IgA抗體陽性，50.00% 的患者NA-IgA 抗體陽性，33.22%的患者EA-IgG 抗體陽性，但2 068 份患者樣本中，僅1 名鼻咽癌患者VCA-IgM 抗體陽性，陽性率僅為0.05%。說明在不同鼻咽癌患者中，抗體的陽性率表現(xiàn)不一致，這可能與鼻咽癌患者的臨床周期以及自身抗體免疫系統(tǒng)有關(guān)。見表8。

表8 EBV 抗體陽性率結(jié)果統(tǒng)計(jì) ［n=2 068,n(%)］

試驗(yàn)結(jié)果表明，在鼻咽癌患者中，4 種EBV抗體（EA-IgA、EA-IgG、NA1-IgA、VCA-IgA）均是陽性的患者占比25.15%，占比量最高，其次是EA-IgG 單抗體陽性患者，占比為13.39%，3 種EBV 抗體陽性的患者，占比為17.07%。見表9。

表9 EBV 抗體陽性率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（n=2 068）

3 討論

潛伏性EBV 感染的切換和建立是一個(gè)進(jìn)入NPC 發(fā)病機(jī)制的重要步驟。在潛伏感染期間，病毒基因的表達(dá)概況是細(xì)胞環(huán)境依賴性的。至少有三種類型的EBV 潛伏感染模式被公認(rèn)，涉及不同疾病和感染細(xì)胞類型。那么不同基因的表達(dá)也就意味著，在不同的感染時(shí)期及感染模式下表達(dá)的病毒蛋白不一致，那么，在不同疾病不同周期需要檢測不同的EBV 抗體。由于鼻咽癌發(fā)生的部位在鼻咽部，它位于鼻腔的后方，是不容易被發(fā)現(xiàn)的部位。鼻咽癌早期并沒有顯著的癥狀，且早期出現(xiàn)的頭疼、鼻塞等癥狀，不容易引起患者的重視，就很容易錯(cuò)過最佳的治療時(shí)期。因此，對于鼻咽癌患者來說，提高生存率的關(guān)鍵在于早期診斷、早期治療。EBV 血清學(xué)診斷無疑是鼻咽癌早期篩查、診斷的一個(gè)高效途徑。目前常用于鼻咽癌的EBV 抗體標(biāo)志物有：VCA-IgA、EA-IgA、EAIgG、NA1-IgA、VCA-IgM 等。

從上述研究結(jié)果可知，在鼻咽癌患者中，EBV 抗體VCA-IgA、EA-IgA、EA-IgG、NA1-IgA、VCA-IgM 的陽性率分別為50.00%、33.22%、71.95%、50.00%、0.05%，VCA-IgM 抗體陽性率較低，與鼻咽癌之間的相關(guān)性較小，主要是因?yàn)楸茄拾V泛用于急性感染的診斷，但其抗體在體內(nèi)消失較快，因此臨床診斷必須結(jié)合其他指標(biāo)，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。除此之外，筆者可知研究中的另外4 個(gè)EBV 抗體與鼻咽癌的相關(guān)性較高。鄧日輝等［19］（2022 年）也針對這4 個(gè)EBV 標(biāo)志物與鼻咽癌的關(guān)系進(jìn)行了研究，評(píng)價(jià)了EB 病毒4 種抗體聯(lián)合檢測在鼻咽癌篩查中的臨床價(jià)值，通過收集205 例已確診為鼻咽癌患者研究表明，EBV抗體VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG、NA1-IgA 陽性檢出率分別為70.73%、41.46%、44.39%、58.05%。黃玲［20］（2020 年）研究表明EA-IgA、VCA-IgA 和Rta-IgG 抗體單獨(dú)診斷鼻咽癌的靈敏度分別為57.20%、47.35%、75.38%，Rta-IgG（Rta蛋白為EA 蛋白的一種）陽性率達(dá)75.38%這與筆者的研究結(jié)果71.32%基本保持一致。

綜上所述，EBV 抗體VCA-IgA、EA-IgA、EAIgG、NA1-IgA 與鼻咽癌患者均有一定的相關(guān)性，聯(lián)合檢測做到了EBV 抗體全覆蓋，篩查更全面，彌補(bǔ)了單一指標(biāo)檢測的不足。鼻咽癌篩查時(shí)，可采用4 種抗體并聯(lián)檢測來提高鼻咽癌篩查的靈敏度，降低漏診率；采用串聯(lián)檢測來提高特異性，為鼻咽癌的篩查提供更高可靠性。