幽門螺桿菌悉尼標準菌株傳代培養(yǎng)方法研究

樊玉娟，李福興，王 黎，程明璟，肖 敏，熊苗苗，趙衛(wèi)東

（大理大學臨床醫(yī)學院，云南大理 671000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）于1984年由Marshall和Warren首次從胃黏膜組織成功分離〔1〕。近40年，隨著對H.pylori研究的深入，發(fā)現(xiàn)H.pylori感染是嚴重胃炎相關疾病的重要危險因素，包括消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤以及胃癌〔2〕。據(jù)流行病學統(tǒng)計，在中國，約70%的人感染H.pylori，其中15%~20%的感染者出現(xiàn)臨床癥狀；在發(fā)展中國家，70%~90%的人在10歲前攜帶H.pylori；但在發(fā)達國家，H.pylori感染的流行率從25%~50%不等〔3〕。世界衛(wèi)生組織將H.pylori列為胃癌的一類致癌因子〔3〕。雖然目前臨床已有多種檢測H.pylori的方法，但H.pylori培養(yǎng)仍是診斷其感染的金標準。由于H.pylori的培養(yǎng)條件高、對環(huán)境要求極其嚴苛，并且不能與其他細菌在同一實驗室培養(yǎng)，故目前國內(nèi)外常采用的培養(yǎng)H.pylori的方法成本較高。幽門螺桿菌悉尼標準菌株（SS1菌株）是最常見的H.pylori菌株之一，目前主要用于動物模型的建立以及細胞模型的感染〔4〕。本文通過對SS1菌株進行傳代培養(yǎng)，旨在尋找一種廉價、簡單、有效、快捷的H.pylori培養(yǎng)方法。

1 材料

幽門螺桿菌悉尼標準菌株（SS1菌株）購買于廣州微生物所（GDMCC 1.1820）；哥倫比亞血平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；胎牛血清（天杭生物科技股份有限公司）；腦心浸潤液（青島海博生物技術有限公司）；厭氧產(chǎn)氣包（青島海博生物技術有限公司）；密封厭氧袋（青島海博生物技術有限公司）；MGCC-31 2.5 L密封培養(yǎng)罐（三菱瓦斯化學株式會社）；CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；MVS-38立式壓力蒸汽滅菌器（日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社）；禾信康元CMI-1600飛行時間質(zhì)譜儀（廣州禾信儀器股份有限公司）；一次性接種環(huán)（唐人康醫(yī)療器械有限公司）；OLYMPUS CX21FS1顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

2 方法

2.1 前期準備 將SS1菌株甘油凍存液1 mL迅速解凍，分裝于5支凍存管中，200 μL/支，放入-80℃冰箱。配制腦心浸潤液：稱取3.85 g腦心浸潤液肉湯，溶解于100 mL去離子水中，緩慢、充分攪拌至完全溶解。準備50 mL甘油倒入玻璃瓶中，將甘油和自配的腦心浸潤液高溫高壓滅菌30 min。甘油和自配腦心浸潤液按照1∶4的體積比配制成液體培養(yǎng)基，分裝在經(jīng)高溫滅菌的10 mL離心管中，備用。

2.2H.pylori培養(yǎng)方法

2.2.1 方法一 向哥倫比亞血平板（10個）中加入50 μL腦心浸潤液，取出SS1菌株凍存液，37℃水浴解凍，使用無菌一次性接種環(huán)（10 μL）分別沾取5次菌液（共50 μL），均勻地將SS1菌株接種在哥倫比亞血平板上，隨后放入裝有厭氧產(chǎn)氣包的密封厭氧袋中，每個袋子中置入1個已完成接種的哥倫比亞血平板，密封后放入CO2培養(yǎng)箱，觀察3~14 d。

2.2.2 方法二 向哥倫比亞血平板（5個）中加入50 μL腦心浸潤液和50 μL解凍菌液，使用無菌一次性接種環(huán)均勻涂布。在密封培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，需要檢查密封培養(yǎng)罐的密封性是否良好，然后在密封培養(yǎng)罐對應的凹槽中倒入滅菌后的去離子水，并放置1個厭氧產(chǎn)氣包，最后放入已完成接種的哥倫比亞血平板，密封后放入CO2培養(yǎng)箱中，觀察3~14 d〔5〕。

2.2.3 方法三 向哥倫比亞血平板（5個）中加入50 μL腦心浸潤液和50 μL解凍菌液，使用無菌一次性接種環(huán)均勻涂布。在方法二的基礎上使用燭缸法消耗密封培養(yǎng)罐中的氧氣，即在密封培養(yǎng)罐中加入1支點燃的蠟燭，蓋上蓋子，待蠟燭熄滅后放入CO2培養(yǎng)箱中，觀察3~14 d〔6〕。

2.2.4 方法四 向哥倫比亞血平板（5個）中加入50 μL腦心浸潤液和50 μL解凍菌液，使用無菌一次性接種環(huán)均勻涂布。培養(yǎng)條件同方法三，與之不同的是需要每天在密封培養(yǎng)罐中點燃1次蠟燭。

2.3 復蘇實驗 使用無菌一次性接種環(huán)緩慢刮拭哥倫比亞血平板上的菌落，將菌落溶于液體培養(yǎng)基，并分裝于1 mL凍存管中，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。復蘇當天，隨機取出1支凍存管，37℃水浴解凍，并接種于哥倫比亞血平板中，使用方法四進行培養(yǎng)，觀察3~14 d。

2.4H.pylori菌株鑒定（1）菌落形態(tài)：觀察哥倫比亞血平板中的菌落形態(tài)是否典型。（2）革蘭染色：滴1滴0.9%氯化鈉溶液于干凈載玻片上，用無菌一次性接種環(huán)刮取少許菌落在0.9%氯化鈉溶液中涂開，制成厚薄適宜的細菌涂片。涂片用火焰固定，待涂片冷卻后，滴加結(jié)晶紫進行初染，染色1 min，清水洗凈涂片；滴加碘液進行媒染，染色1 min，清水洗凈涂片；滴加丙酮乙醇進行脫色，直至無藍紫色液體流出，清水洗凈涂片；滴加稀釋復紅進行復染，染色30 s，清水洗凈涂片，干燥后使用油鏡觀察染成紫紅色的待測菌涂片。（3）質(zhì)譜檢測：將H.pylori菌液直接涂布至靶板，用甲酸破壞細菌細胞壁，添加適量儀器配套基質(zhì)，干燥后放入靶倉，進行檢測。根據(jù)細菌質(zhì)核比（m/z），計算機軟件分析得到最匹配菌株。

3 結(jié)果

3.1H.pylori菌株培養(yǎng)及鑒定 采用上述4種方法均能成功培養(yǎng)出H.pylori菌株。從哥倫比亞血平板中均觀察到大小不一、半透明狀、圓形菌落，此為H.pylori菌株肉眼觀察的典型形態(tài)。見圖1A。為進一步驗證是否為H.pylori菌株，將其做成細菌涂片，并進行革蘭染色。鏡下可見革蘭染色陰性，細菌形態(tài)呈S形、弧形彎曲、海鷗狀〔7〕。見圖1B。在復蘇實驗中觀察到相同菌落，證明本實驗中凍存菌株的方法是可行的。

圖1 H.pylori菌株鑒定

3.2H.pylori菌株質(zhì)譜檢測結(jié)果 飛行時間質(zhì)譜儀是一種新型的微生物鑒定儀器，與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有靈敏度高、特異性強、分析速度快的優(yōu)勢。相關研究表明，當細菌最高峰位處于m/z值6 900~7 000時，該菌株即為H.pylori〔8〕。本實驗中，細菌最高峰位m/z值為6 964.1，與文獻〔10〕報道一致，確定該菌株為H.pylori。見圖2。

圖2 H.pylori質(zhì)譜檢測結(jié)果

3.3 不同培養(yǎng)方法生長速度比較4種方法均能成功培養(yǎng)出H.pylori菌株，通過測定哥倫比亞血平板上的菌落數(shù)，對4種培養(yǎng)方法的生長速度進行比較。結(jié)果顯示，在達到同等菌落數(shù)量的情況下，方法四用時顯著少于其他3種方法，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 4種培養(yǎng)方法生長速度比較（d，±s）

表1 4種培養(yǎng)方法生長速度比較（d，±s）

注：方法四與方法一比較*P<0.05；方法四與方法二比較#P<0.05；方法四與方法三比較△P<0.05。

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4 討論

H.pylori是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌，革蘭染色陰性，有動力，在胃黏膜上皮細胞表面常呈典型的螺旋狀或弧形，與本實驗革蘭染色鏡下觀察的菌落形態(tài)相一致。肉眼觀察呈灰白色、半透明、顆粒狀菌株，與哥倫比亞血平板中呈現(xiàn)的菌落形態(tài)相一致。H.pylori菌株的培養(yǎng)條件相對較為嚴格，通常需要在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且需要在培養(yǎng)基中添加一定的營養(yǎng)物。研究報道表明，腦心浸潤液和胎牛血清可以作為首選的培養(yǎng)基營養(yǎng)物，對H.pylori的生長起著重要的促進作用〔9-10〕。同時，H.pylori的生長與環(huán)境中的氣體有著密切的關系，因此，還需要嚴格把控氣體濃度〔9-10〕。正常情況下，空氣中O2占21%、CO2占0.03%，H.pylori的標準培養(yǎng)環(huán)境是在三氣培養(yǎng)箱（O2：2%~8%，CO2：10%~15%，N2：85%）中進行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)箱可以嚴格控制O2和CO2濃度，從而為H.pylori的生長提供適宜環(huán)境，但是三氣培養(yǎng)箱價格高昂，使其應用受限。有研究者采用燭缸法培養(yǎng)H.pylori，此方法成本較低，可有效進行H.pylori菌株的傳代培養(yǎng)，但操作較為復雜〔6〕。

H.pylori對培養(yǎng)環(huán)境的要求極為嚴格，特別是低氧環(huán)境，在本研究中，方法一僅使用了裝有厭氧產(chǎn)氣包的密封厭氧袋，袋內(nèi)氣體由厭氧產(chǎn)氣包產(chǎn)生，它可以消耗袋內(nèi)的O2產(chǎn)生CO2，但濕度不夠，由于袋內(nèi)氣體達到適宜比例的速度較慢，導致傳代時間長；方法二是在密封培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，罐中相應凹槽內(nèi)放入去離子水，培養(yǎng)罐內(nèi)氣體主要由厭氧產(chǎn)氣包產(chǎn)生，它可以消耗罐內(nèi)的O2產(chǎn)生CO2，由于僅存在厭氧產(chǎn)氣包，罐內(nèi)氣體達到適宜比例的速度仍較慢，故菌株培養(yǎng)時間也比較長，但優(yōu)于方法一；方法三是在密封培養(yǎng)罐內(nèi)點燃蠟燭，蠟燭燃燒可以消耗O2產(chǎn)生CO2和水，這樣可以保持低氧環(huán)境和適宜比例的CO2，使得罐內(nèi)氣體快速達到H.pylori生長的最適比例，但隨著細菌生長繁殖消耗掉一定量的CO2，使得氣體比例不斷發(fā)生變化，因此，H.pylori生長并未達到最理想的效果；方法四是在方法三的基礎上增加蠟燭點燃次數(shù)，即每天都打開密封培養(yǎng)罐的蓋子點燃1次蠟燭，這樣可以使罐內(nèi)持續(xù)保持H.pylori生長的最適氣體環(huán)境，因此，H.pylori生長效果較好。但本實驗也有相對局限性，首先由于不具備合適的培養(yǎng)箱，為了選擇較為合適的培養(yǎng)環(huán)境，只選擇了CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，而未在普通空氣培養(yǎng)箱中進行實驗，在未來的研究中，將進一步探索使用普通空氣培養(yǎng)箱的培養(yǎng)方法。

綜上所述，通過比較SS1菌株的傳代培養(yǎng)方法，找到一種操作簡便、價格低廉的H.pylori培養(yǎng)方法，可有效節(jié)約H.pylori感染的研究成本，具有較強的應用前景，值得推廣。