溶源性發(fā)酵乳桿菌噬菌體的誘導(dǎo)及滅活方法

郭蛇，許銘，張燦，朱含芳，陳霞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

發(fā)酵乳桿菌是一類具有耐酸、耐膽鹽、降解不易消化糖類等優(yōu)良特性的專性異型發(fā)酵乳酸菌，普遍存在于自然發(fā)酵制品以及人類和動(dòng)物的腸道中[1-4]。發(fā)酵制品的生產(chǎn)和感官特性主要依賴于發(fā)酵劑的穩(wěn)定性，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵劑若被噬菌體侵染，則可能影響食品風(fēng)味和口感。目前，噬菌體污染已被認(rèn)為是乳制品行業(yè)發(fā)酵失敗的主要原因[5]。

噬菌體具有很強(qiáng)的感染力，發(fā)酵劑被噬菌體污染后活力下降，可能出現(xiàn)發(fā)酵緩慢，pH值不正常等情況。除烈性噬菌體外，溶原性噬菌體污染也是引起發(fā)酵失敗的原因之一，它由特定的基因來引導(dǎo)整合至細(xì)菌染色體，并作為原噬菌體保持休眠狀態(tài)，在特定物理或化學(xué)條件下，部分溶原性噬菌體可被誘導(dǎo)為烈性噬菌體，從而影響發(fā)酵的進(jìn)行[6-8]。在發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程中，噬菌體有多種污染途徑，發(fā)酵劑菌株可以通過進(jìn)化出噬菌體抗性系統(tǒng)來自然地防止噬菌體的入侵[9]，在材料和工業(yè)設(shè)施上使用物理化學(xué)方法也可以防止噬菌體污染，如熱處理、使用化學(xué)殺菌劑等[10]。

本研究以發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)IMAU32579為研究對象，通過紫外線和絲裂霉素C對其進(jìn)行誘導(dǎo)，并評(píng)估熱處理及常見化學(xué)殺菌劑對誘導(dǎo)出的噬菌體的滅活效果，為工業(yè)生產(chǎn)中噬菌體防治措施的建立提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)IMAU32579保藏于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基(g/L)：植物蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，葡萄糖20，檸檬酸鈉2，無水乙酸鈉5，MnSO40.054，MgSO40.2，吐溫-80 1 mL，121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

MRS半固體培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中加入7 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

RSM(100 mL)：10 g脫脂乳，115 ℃滅菌15 min后立即取出，迅速急冷。

TMG：10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgSO4、1 g明膠，加水至1 L、pH調(diào)至7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑與儀器

絲裂霉素C，羅恩試劑公司；乙醇、異丙醇、NaClO，天津鑫伯特化工有限公司。

UV-1700紫外可見分光光度計(jì)，日本島津株式會(huì)社分析儀器部；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-2F超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Eppendorf 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國 Hambury 公司;JEM-1200透射電子顯微鏡，日本JEOL公司 。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化

將發(fā)酵乳桿菌IMAU32579以2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，得到第一代菌。將第一代菌液傳代兩次后，得到第三代培養(yǎng)菌株，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌株的誘導(dǎo)

1.2.2.1 紫外線誘導(dǎo)

在超凈工作臺(tái)中，將5 mL菌液(OD600≈0.4)注入培養(yǎng)皿中緩慢搖動(dòng)使其平鋪后，打開培養(yǎng)皿蓋，置于紫外燈(254 nm)下，使菌液液面與紫外燈距離為10～15 cm，分別照射10、20、30、40、50 s，以未照射菌液為對照。37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h取樣測定OD600值，重復(fù)3次。將誘導(dǎo)液8 000×g，5 min離心過濾，即獲得可能的噬菌體裂解液，采用雙層平板法檢測是否存在噬菌斑。

1.2.2.2 絲裂霉素C誘導(dǎo)

在處于遲滯期(OD600≈0.2)的菌液中添加絲裂霉素C使其終質(zhì)量濃度分別達(dá)到1.8、1.9、2.0、2.1、2.2 μg/mL，以不添加絲裂霉素C的空白組作為對照。37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h測定其OD600值，重復(fù)3次。將誘導(dǎo)液8 000 ×g，5 min離心過濾，即獲得可能的噬菌體裂解液，采用雙層平板法檢測是否存在噬菌斑。

1.2.3 噬菌體增殖

將已活化的宿主菌以2%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600≈0.5，加入噬菌體裂解液，37 ℃培養(yǎng)3～4 h直至菌液澄清。8 000×g離心5 min后收集上清液得到噬菌體懸浮液，經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾得到噬菌體裂解液。置于4 ℃冰箱備用。

1.2.4 噬菌體的濃縮和檢測

將RNase A、DNase I加入溶源性發(fā)酵乳桿菌裂解液中至終質(zhì)量濃度1 μg/mL，37 ℃靜置30 min。然后加入終濃度為0.5 mol/L的NaCl和100 g/L的聚乙二醇8000冰浴4 ℃過夜后取出，12 000×g離心20 min后得到的沉淀重新溶解于SM緩沖液中。將經(jīng)過濃縮之后的噬菌體裂解液進(jìn)行雙層平板法計(jì)數(shù)。

1.2.5 噬菌體形態(tài)觀察

取效價(jià)達(dá)到108PFU/mL噬菌體原液用作電鏡觀察。取微量噬菌體懸液滴加于復(fù)膜銅網(wǎng)上，滴1滴2%磷鎢酸(pH 7.0)，靜置滴染30 s后，用濾紙吸去未干的染液，放置在室溫下自然干燥，然后使用透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)。

1.2.6 不同溫度對噬菌體的滅活效果

配制MRS、RSM、TMG培養(yǎng)基，分別分裝900 μL于1.5 mL EP管中。將100 μL噬菌體裂解液分別加入上述培養(yǎng)基中混合搖勻，分別進(jìn)行63、72 ℃水浴培養(yǎng)，將不同時(shí)間間隔下(0、1、2、3、4、5 min)的噬菌體裂解液取出，以10倍梯度稀釋噬菌體裂解液，采用雙層平板法對不同培養(yǎng)條件下的噬菌體計(jì)數(shù)，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算其滅活效果。

城鎮(zhèn)住房民生狀況可以用以下三個(gè)指標(biāo)來反映。人均住房面積、房價(jià)收入比、住房消費(fèi)占總消費(fèi)比三個(gè)指標(biāo)分別從住房使用價(jià)值、住房支出負(fù)擔(dān)、整個(gè)消費(fèi)結(jié)構(gòu)三個(gè)方面體現(xiàn)了住房民生的狀況。

1.2.7 化學(xué)殺菌劑對噬菌體的滅活效果

1.2.7.1 乙醇對噬菌體的滅活效果

分裝900 μL不同體積分?jǐn)?shù)(10%、20%、30%、50%、75%、100%)乙醇溶液于1.5 mL EP管中，然后分別加入100 μL噬菌體裂解液，混合均勻，37 ℃培養(yǎng)，于不同時(shí)間間隔下(0、15、30、45、60 min)取出，采用雙層平板法對不同濃度乙醇處理下的噬菌體計(jì)數(shù)，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算其滅活效果。

1.2.7.2 異丙醇對噬菌體的滅活效果

分裝900 μL不同體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、100%)異丙醇溶液于1.5 mL EP管中，然后分別加入100 μL噬菌體裂解液，按1.2.7.1的方法計(jì)算其滅活效果。

1.2.7.3 NaClO對噬菌體的滅活效果

分裝900 μL不同質(zhì)量濃度(100、200、400、800 mg/L)NaClO溶液于1.5 mL EP管中，然后分別加入100 μL噬菌體裂解液，按1.2.7.1的方法計(jì)算其滅活效果。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有獨(dú)立試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。數(shù)據(jù)均采用Origin 2018軟件作圖分析。使用SPSS軟件，采用單向方差分析，比較數(shù)據(jù)間顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳桿菌的誘導(dǎo)

紫外線照射可使噬菌體由溶原途徑進(jìn)入裂解途徑，是較為經(jīng)典的誘導(dǎo)方法[11]。發(fā)酵乳桿菌菌懸液經(jīng)過紫外(254 nm)照射不同時(shí)間以及不同培養(yǎng)時(shí)間下OD600值的變化情況如圖1所示。發(fā)酵乳桿菌IMAU32579經(jīng)5個(gè)不同時(shí)間段的紫外照射后，5種誘導(dǎo)液自0 h開始菌體密度較對照菌開始下降，但對上述誘導(dǎo)液進(jìn)行雙層平板法檢測時(shí)，均未有噬菌斑出現(xiàn)。

圖1 發(fā)酵乳桿菌IMAU32579經(jīng)紫外線誘導(dǎo) 后的OD600值的變化Fig.1 Changes in the OD600 values of Lactobacillus fermentum IMAU32579 after UV induction

郭靜[12]將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌置于紫外燈(254 nm)下，照射40 s后，其誘導(dǎo)液的OD600值呈先下降后上升的趨勢，對誘導(dǎo)液進(jìn)行雙層平板檢測，發(fā)現(xiàn)有噬菌斑產(chǎn)生。楊敏[13]對30株水稻白葉枯病菌進(jìn)行紫外照射誘導(dǎo)，結(jié)果顯示僅成功誘導(dǎo)出2株噬菌體，28株未誘導(dǎo)出噬菌體，說明還有其他原因影響誘導(dǎo)能力。

有研究報(bào)道，前噬菌體具有一個(gè)緊密的抑制系統(tǒng)用來維持其穩(wěn)定的休眠狀態(tài)，雖可在某些外界刺激條件下被誘導(dǎo)，但是否可被成功誘導(dǎo)與菌株特性、前噬菌體穩(wěn)定性等多種因素有關(guān)[14]。本研究菌株經(jīng)紫外照射后，雖然其OD600值有所降低，但并未成功誘導(dǎo)出噬菌體。推測OD600值下降的原因可能是由于紫外照射而引起的菌株生長抑制。

2.1.2 絲裂霉素C對發(fā)酵乳桿菌的誘導(dǎo)

絲裂霉素C是從頭狀鏈霉菌培養(yǎng)液中分離提取的一種抗生素，能夠使細(xì)胞DNA解聚，阻止DNA的復(fù)制，是一種常見的噬菌體誘導(dǎo)劑[15]。PEI等[16]使用0.7 μg/mL絲裂霉素C誘導(dǎo)142株乳酸菌，結(jié)果表明，在添加誘導(dǎo)劑后8 h內(nèi)，所有受試菌中有8株菌株裂解，產(chǎn)生噬菌體。因此，本研究使用絲裂霉素C為誘導(dǎo)劑，對發(fā)酵乳桿菌IMAU3257進(jìn)行誘導(dǎo)。

由圖2可知，經(jīng)不同濃度絲裂霉素C誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)液在培養(yǎng)1 h后，OD600值雖低于對照組，但仍呈上升趨勢。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，菌株生長受到抑制，OD600值下降，推測可能有噬菌體存在。對上述誘導(dǎo)液進(jìn)行雙層平板法檢測后發(fā)現(xiàn)，絲裂霉素C質(zhì)量濃度為1.9 μg/mL，培養(yǎng)時(shí)間為6 h時(shí)，有噬菌斑產(chǎn)生，說明成功誘導(dǎo)出噬菌體。

圖2 發(fā)酵乳桿菌IMAU32579經(jīng)絲裂霉素C誘導(dǎo) 后的OD600值的變化Fig.2 Changes in the OD600 values of L.fermentum IMAU32579 after mitomycin C induction

2.2 噬菌體的形態(tài)

經(jīng)1.9 μg/mL絲裂霉素C誘導(dǎo)后，雙層平板上觀察到清晰透明的噬菌斑(圖3-a)，將該噬菌體命名為LFP-VB1。利用透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)，結(jié)果如圖3-b所示。由圖3-b可知，噬菌體LFP-VB1的頭部直徑為(62.86±2.01) nm，尾部為非收縮性尾，長(259.26±2.00) nm，寬(12.52±2.01) nm。依照國際病毒分類委員會(huì)分類標(biāo)準(zhǔn)[17]，該噬菌體屬于尾噬菌體目(Caudovirales)、長尾噬菌體科(Siphoviridae)。

a-噬菌斑圖；b-電鏡圖圖3 噬菌體LFP-VB1的噬菌斑及電鏡圖Fig.3 Phage plaque and electron micrograph of phage LFP-VB1

2.3 不同溫度對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

熱處理是最常用的傳統(tǒng)滅活微生物的方法，其作用機(jī)理是利用加熱使微生物的蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生不可逆變性，致使其失活。

如圖4所示，噬菌體LFP-VB1對高溫極敏感。當(dāng)溫度為63 ℃時(shí)，用3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的噬菌體，在處理4 min均可失活；72 ℃時(shí)，噬菌體對數(shù)級(jí)下降速率較63 ℃更快，但同樣在4 min時(shí)完全失活。

TRUCCO等[18]測定了德氏乳桿菌溫和噬菌體(Cb1/204和Cb1/342)在不同溫度和不同培養(yǎng)基(RSM和MRS)下的活性，結(jié)果顯示,溫度為63 ℃時(shí)，噬菌體Cb1/204和Cb1/342在MRS完全失活所需要的時(shí)間為10 min和20 min，在RSM培養(yǎng)基中處理30 min后仍無法全部滅活；在72 ℃處理后顯示，兩種溫和噬菌體快速失活。林澤永等[19]使用63 ℃和72 ℃處理短乳桿菌烈性噬菌體，噬菌體分別在處理10 min和5 min時(shí)，完全滅活。

上述研究結(jié)果顯示，發(fā)酵乳桿菌噬菌體LFP-VB1不具有耐熱性，63 ℃處理4 min即可完全失活。因此，可通過熱處理控制噬菌體LFP-VB1的污染。

圖4 在63 ℃和72 ℃不同培養(yǎng)基對噬菌體 LFP-VB1的滅活作用Fig.4 Effect of different culture medium at 63 ℃ and 72 ℃ on the inactivation of phage LFP-VB1

2.4 不同化學(xué)殺菌劑對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

2.4.1 乙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

乙醇是一種安全有效的化學(xué)殺菌劑，可通過破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，進(jìn)而使噬菌體衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終達(dá)到滅活效果[20-21]。將發(fā)酵乳桿菌噬菌體LFP-VB1置于不同濃度乙醇溶液中處理60 min后的滅活效果如圖5所示。

圖5 不同濃度乙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果Fig.5 Effect of ethanol concentration on the inactivation of phage LFP-VB1

由圖5可知，10%和20%的乙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果較差；30%乙醇處理60 min后，噬菌體LFP-VB1的效價(jià)下降1.58個(gè)對數(shù)級(jí)；體積分?jǐn)?shù)為75%和100%的乙醇在處理前15 min對噬菌體的滅活效果較強(qiáng)，分別使其下降3.02和2.93個(gè)對數(shù)級(jí)，隨著處理時(shí)間增加，滅活效果減弱，處理60 min后，噬菌體分別下降4.71和4.21個(gè)對數(shù)級(jí)，100%乙醇的滅活效果在60 min后低于75%乙醇，原因可能是乙醇濃度過高導(dǎo)致噬菌體表面蛋白質(zhì)迅速凝固，形成一層膜，阻止乙醇溶液向噬菌體內(nèi)部流入，使其滅活效果受到影響[22]。

CAPRA等[23]評(píng)價(jià)了不同濃度乙醇對乳酸菌噬菌體PL-1和J-1的滅活效果，結(jié)果顯示，10%和50%的乙醇對噬菌體活性幾乎沒有影響(T99>45 min)，75%和100%的乙醇是滅活噬菌體PL-1和J-1的最有效溶液，T99值的范圍為5.5～10.3 min。林澤永等[19]評(píng)價(jià)了不同濃度乙醇對短乳桿菌噬菌體φB23的滅活效果，結(jié)果表明用75%的乙醇溶液處理10 min時(shí)，可使噬菌體完全失活；當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，噬菌體效價(jià)下降較慢，處理20 min后完全滅活；當(dāng)采用30%的乙醇處理，30 min內(nèi)不能使其失活[19]。本研究中，不同濃度的乙醇對噬菌體LFP-VB1的活性影響較小，60 min內(nèi)處理后，均不能使其完全失活，說明噬菌體LFP-VB1對乙醇的耐受性較高。

2.4.2 異丙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

將發(fā)酵乳桿菌噬菌體LFP-VB1置于不同濃度異丙醇溶液中處理60 min后的滅活效果如圖6所示。

圖6 不同濃度異丙醇對噬菌體LFP-VB1的滅活效果Fig.6 Effect of isopropanol concentration on the inactivation of phage LFP-VB1

由圖6可知，用10%、20%、50%、100%異丙醇處理15 min，噬菌體效價(jià)分別下降0.98、1.17、1.33和0.58個(gè)對數(shù)級(jí)，隨著處理時(shí)間延長，滅活效果減弱，效價(jià)下降趨勢穩(wěn)定。30%異丙醇處理60 min滅活效果最佳，使噬菌體下降2.28個(gè)對數(shù)級(jí)。研究表明，100%的異丙醇處理5 min可使Lactobacillushelveticus噬菌體CNRZ832-B1和CNRZ0241完全失活[24]， 處理15 min可使嗜熱鏈球菌噬菌體031-D完全失活[25]。對于本研究來說，異丙醇溶液對噬菌體LFP-VB1的滅活效果較差，100%異丙醇作用60 min，仍不可使噬菌體完全滅活，說明與上述噬菌體相比，噬菌體LFP-VB1對異丙醇的抗性較強(qiáng)。

2.4.3 NaClO對噬菌體LFP-VB1的滅活效果

由圖7可知，100 mg/L NaClO處理60 min的滅活效果最差，僅使噬菌體下降1.83個(gè)對數(shù)級(jí)；隨著NaClO濃度及處理時(shí)間增加，其對噬菌體LFP-VB1的滅活作用增強(qiáng)。質(zhì)量濃度為800 mg/L，處理60 min，滅活效果最佳，但也未能使噬菌體LFP-VB1完全滅活，僅使其下降6.29個(gè)對數(shù)級(jí)。SUREZ等[7]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/L NaClO可使乳球菌噬菌體001和QF12在5 min內(nèi)完全滅活；噬菌體046和QP4經(jīng)100 mg/L NaClO處理后，T99值分別為32.7和8.8 min，300和200 mg/L的NaClO可使它們分別在45 min、30 min后完全失活，NaClO可有效滅活上述乳球菌噬菌體。另有研究表明，800 mg/L NaClO對噬菌體活力的影響最大，15 min時(shí)可使植物乳桿菌噬菌體B2完全失活，30 min時(shí)可使噬菌體B1、FAGK1、FAGK2完全失活；400 mg/L的NaClO效果略差，5 min內(nèi)使4種噬菌體達(dá)到99%滅活；200 mg/L的NaClO對噬菌體滅活效果不佳，達(dá)到99%滅活的時(shí)間均大于45 min[26]。對于本研究來說，NaClO濃度越高對噬菌體滅活效果越佳，但800 mg/L NaClO作用60 min后，仍不能使噬菌體完全失活，說明與上述噬菌體相比，噬菌體LFP-VB1對NaClO的抗性較強(qiáng)。

圖7 不同濃度NaClO對噬菌體LFP-VB1的滅活效果Fig.7 Effect of NaClO concentration on the inactivation of phage LFP-VB1

3 結(jié)論

本研究以發(fā)酵乳桿菌IMAU32579為研究對象，通過1.9 μg/mL絲裂霉素C成功誘導(dǎo)出發(fā)酵乳桿菌噬菌體。該噬菌體屬于長尾噬菌體科，命名為LFP-VB1。LFP-VB1對溫度較為敏感，63 ℃處理即可使其完全失活；對常見化學(xué)殺菌劑(乙醇、異丙醇、NaClO)不敏感，800 mg/L NaClO處理60 min也僅能使其下降6.29個(gè)對數(shù)級(jí)。本研究可為構(gòu)建噬菌體防治措施，提高相關(guān)產(chǎn)品穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)。