高效液相色譜法測定熟黨參中5-羥甲基糠醛的含量

呂立銘，高 娟，李大煒，申 茹，毛一中

(惠州衛(wèi)生職業(yè)技術學院，廣東 惠州 516025)

0 引言

黨參來源于桔梗科植物黨參[Codonopsis pilosμla(Franch.)Nannf.]、素花黨參[Codonopsis pilosμla Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen]或川黨參[Codonopsis tangshen Oliv.]的干燥根，其性味甘平，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津功效，臨床上常用于治療脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短、津傷口渴、內熱消渴證[1]。黨參主要成分為聚炔類[2-3]、生物堿類[4-5]、糖類[6-7]、萜類[8-9]、木質素類[10-12]、黃酮類[13-14]等，其炮制方法主要有米炒[1]、麩炒[15]、蜜炙[16]、土炒[17]等，此外，還有部分地方采用清蒸方法來炮制[18-19]。黨參經(jīng)過清蒸加工成熟黨參后，口感變甜，顏色變黑，原因推測為5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量增加。據(jù)研究報道，5-HMF具有多種藥理活性，譬如抗氧化活性[20-21]、改善血液流變學[22-23]、抗心肌缺血作用[24-25]、降血糖作用[26-27]、抗腫瘤細胞增殖活性[25，28]等，但含量超過一定限度，就會對人體產(chǎn)生危害。過量的5-HMF會損害人體橫紋肌、內臟、基因和神經(jīng)等，對眼睛、皮膚、上呼吸道及黏膜有刺激作用[29-32]。然而，關于熟黨參中5-HMF的含量測定研究尚未見報道。筆者通過高效液相色譜法，創(chuàng)建了熟黨參中5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量測定方法，希望能為今后黨參的炮制研究和質量控制提供思路和方法。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國)，Capcell pak C18色譜柱(資生堂公司，日本，型號4.6 mm×250 mm，5 μm)；旋轉蒸發(fā)儀RE-3000A(上海越眾儀器設備有限公司，中國)，電子天平FA2004N(上海菁海儀器有限公司，中國)，超聲清洗機PS-40A(深圳市科潔超聲科技有限公司，中國)，BPG-9204A電熱式鼓風干燥箱(上海百典儀器設備有限公司，中國)；立式萬用電爐(上海浦東榮豐科學儀器有限公司，中國)；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠，中國)。

試藥：黨參(產(chǎn)地：山西晉城市陵川縣六泉鄉(xiāng)廟懷村)藥材經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術學院中藥教研室祁銀德教授鑒定，為桔梗科植物黨參[Codonopsis pilosμla(Franch.)Nannf.]的干燥根，符合2020年版《中國藥典》一部規(guī)定)，5-HMF對照品(GC≥98%，批號：20170519，上海金穗生物科技有限公司，中國)，乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，中國)，甲醇(分析純，西隴科學股份有限公司，中國)，超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido Capcell pak C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：V乙腈∶V水=(5：95)，檢測波長：280 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：常溫(25 ℃)。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

準確稱取5-HMF對照品2.8 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻.配成濃度為0.028 mg/mL對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

準確稱取黨參飲片500 g，置于蒸制容器內，隔水蒸2 h至有香甜味時取出，干燥，得到熟黨參樣品[18]。準確稱取熟黨參樣品粉末(過二號篩)0.50 g，置于100 mL錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，超聲30 min，再靜置，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，而后搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取中間部分續(xù)濾液作為供試品溶液，備用[33-34]。

2.3 線性關系考察

準確吸取對照品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別進樣0.5 μl、1μl、2μl、4μl、8μl、10 μl。以對照品溶液進樣量(x)為橫坐標，峰面積積分值(y)為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=5323.8x-6.6486，(R2=0.9999)。結果表明，5-HMF進樣量在0.014 μg～0.28 μg范圍內線性關系良好(見表1，圖1、2)。

表1 5-HMF線性關系考察表

圖1 5-HMF對照品高效液相色譜圖

2.4 精密度試驗

準確吸取對照品溶液10 μl，按“2.1”項色譜條件，連續(xù)進樣測定6次，分別測定5-HMF峰面積積分值，計算相對標準偏差，對照品溶液峰面積積分值的平均值為1487.13，RSD值為0.58%(n=6)。結果表明儀器精密度良好(見表2)。

圖2 5-HMF標準曲線圖

表2 5-HMF精密度試驗結果表

2.5 重復性試驗

準確稱取同一批次熟黨參粉末(過二號篩)0.50 g，按“2.2.2”項供試品溶液制備方法，制備供試品溶液6份，按“2.1”項色譜條件，分別準確吸取10 μl進樣測定，測得樣品中5-HMF的平均含量為 4.89 mg/g，RSD值為1.76%(n=6)。結果表明該方法重現(xiàn)性良好(見表3)。

表3 5-HMF重復性試驗結果表

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在制備后0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h，各進樣10 μl，測得5-HMF峰面積積分值的平均值為 256.58，RSD值為1.12%(n=6)。結果表明供試品溶液在制備后24 h內具有良好的穩(wěn)定性(見表4)。

表4 5-HMF穩(wěn)定性試驗結果表

2.7 加樣回收率試驗

按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備9份供試品溶液，分別加入一定量的5-HMF對照品，按“2.1”項色譜條件，進樣10 μL，測定5-HMF峰面積積分值，按外標法計算樣品中5-HMF的含量，得到平均加樣回收率為98.91%，RSD值為1.22%，結果表明該方法準確可靠(見表5)。

表 5 5-HMF加樣回收率試驗結果表

2.8 樣品含量測定

取收集到的不同批次熟黨參樣品6份，按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項色譜條件，分別進樣10 μl，計算5-HMF峰面積積分值，以峰面積積分值按外標法計算樣品中5-HMF的含量(見表6、圖3)。

表6 不同批次熟黨參中5-HMF的含量(n=3)

圖3 熟黨參高效液相色譜圖

3 討論

關于5-HMF安全性評價經(jīng)歷了相當長的時間，其危害也逐漸被發(fā)現(xiàn)。5-HMF具有多種藥理活性，只有在較高的濃度下才顯示弱毒性，在特定條件下，也可以引起人體某些指標發(fā)生一定的變化，但并沒有造成嚴重危害。也就是說，在常規(guī)的攝入量范圍內，5-HMF并不存在嚴重的安全風險[31-32]。

根據(jù)文獻研究發(fā)現(xiàn)，5-HMF的主要來源有兩條途徑，一是由氨基酸和還原糖發(fā)生美拉德反應生成，二是在酸性環(huán)境中，由糖的受熱分解產(chǎn)生，且含量隨著時間的積累和溫度的升高而增加[34-36]。對于富含糖類成分的中藥，在炮制加工和儲存等過程中，都會不可避免地發(fā)生美拉德反應和糖的熱降解反應(還原糖的分解及蔗糖的焦化)而產(chǎn)生5-HMF[36]。中藥炮制加工是一個復雜的成分變化過程，2020年版《中國藥典》對于米炒黨參炮制品的質量要求只要求了性狀檢查，黨參炔苷薄層色譜定性檢查，水分、總灰分、二氧化硫限量檢查和浸出物含量檢查，缺乏具體的藥效成分來進行定量鑒別。鑒于黨參成分復雜，勢必造成黨參炮制品質量難于控制[36]。

黨參是中醫(yī)傳統(tǒng)的補益類中藥，也是我國常用的藥食同源食材，其在炮制和貯存的過程中，5-HMF含量會隨著溫度的升高和時間的積累而增加。特別是在蒸制過程中，在水分和熱量的作用下，黨參的顏色加深，5-HMF的含量大幅度增加。鑒于5-HMF對人體具有潛在的危害，很有必要對熟黨參中5-HMF的含量進行監(jiān)測。本研究采用 HPLC 法測定不同批次熟黨參藥材中5-HMF的含量，操作簡單快捷，結果準確可靠，測定方法的精密度、重復性、穩(wěn)定性、回收率良好，可以作為熟黨參中5-HMF的測定方法，能夠為今后黨參的安全性研究提供參考。