采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)解析不同陳釀時(shí)間古井貢酒揮發(fā)性組分特征

凌與聽，陳雙,2,3，徐巖,2,3，范文來,2,3*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

中國白酒以高粱等谷物為原料，由多種微生物培養(yǎng)、開放式固態(tài)發(fā)酵、陳釀貯存等工藝生產(chǎn)而成，組分復(fù)雜且風(fēng)味獨(dú)特[1]。濃香型白酒作為我國三大香型白酒之一，以“窖香濃郁、綿甜甘洌”名揚(yáng)海內(nèi)外，已成為白酒市場占有率最大的主體酒種[2]。陳釀是濃香型白酒生產(chǎn)過程中不可或缺的工序，白酒在貯存過程除了發(fā)生酯的水解、酸醇的酯化及氧化還原等化學(xué)反應(yīng)，還有氫鍵締合等物理變化，使風(fēng)味和口感趨于協(xié)調(diào)[3]。

陳釀對(duì)提高基酒的品質(zhì)非常重要，相關(guān)研究也受到極大關(guān)注。早期對(duì)濃香型白酒陳釀風(fēng)味的相關(guān)研究停留在對(duì)貯存過程中總酸、總酯、還原糖等[4-6]指標(biāo)變化的探索。隨后，氣相色譜等風(fēng)味化學(xué)手段被投入到濃香型白酒陳釀研究中[7-10]，探究了陳釀過程中揮發(fā)性化合物的變化。已有學(xué)者對(duì)洋河大曲白酒[11-12]、劍南春酒[13]、五糧液酒[14]及沂蒙老區(qū)白酒[15]等濃香型白酒進(jìn)行了不同年份酒樣的香氣組分分析，實(shí)現(xiàn)了化合物從定性到定量逐步升華的過程，研究表明貯存過程中整體呈現(xiàn)“酸增酯減”的變化規(guī)律。曹玉發(fā)等[10]從3個(gè)不同年份濃香型白酒樣品中檢出57種共有的揮發(fā)性化合物，其中己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、正己醇、乙醛被認(rèn)為是濃香型白酒中重要的香氣化合物，其含量均隨陳釀時(shí)間的增加而增加。濃香型白酒風(fēng)味組成體系極具豐富性，文獻(xiàn)已鑒定出濃香型白酒中有超過1 000種揮發(fā)性化合物，其中超過200種具有風(fēng)味貢獻(xiàn)[16]。相比于骨架成分，對(duì)陳釀過程中微量風(fēng)味組分變化的研究相對(duì)較少。全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)通過2種極性不同的氣相色譜柱實(shí)行正交分離，相比一維氣相色譜具備高峰容量、高靈敏度和有序色譜的優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榻馕霭拙浦械暮Ａ繐]發(fā)性組分提供有效分離能力，特別是對(duì)于微量組分的檢測[17]。

基于對(duì)陳釀濃香型白酒“量微香大”化合物的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，本研究采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(headspace solid phase microextraction comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, HS-SPME-GC×GC-TOFMS)技術(shù)，以不同等級(jí)不同陳釀時(shí)間的古井貢酒為研究對(duì)象，進(jìn)行了香氣組分差異特征解析，系統(tǒng)地分析了等級(jí)差異和陳釀時(shí)間差異對(duì)揮發(fā)性組分的影響，以剖析古井貢酒陳釀風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律，為風(fēng)味導(dǎo)向的不同陳釀時(shí)間濃香型白酒品質(zhì)控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

原酒樣品由安徽古井貢酒股份有限公司提供，共計(jì)42個(gè)樣品，酒精度為60%(乙醇體積分?jǐn)?shù))，具體信息如表1所示。由6位具備國家二級(jí)品酒師以上資格的專業(yè)評(píng)酒員進(jìn)行了原酒樣品香氣品質(zhì)的分級(jí)，按照香氣的優(yōu)劣將各個(gè)樣品分為了A、B、C 三類。每個(gè)評(píng)酒員在相對(duì)獨(dú)立的條件下，對(duì)酒樣進(jìn)行等級(jí)評(píng)定。

表1 三個(gè)等級(jí)不同年份古井貢酒樣品信息Table 1 Information of Gujinggong Baijiu samples with three grades and different aging times

1.1.2 主要試劑

NaCl(分析純)，中國國藥上?；瘜W(xué)試劑公司；無水乙醇、C5～C30直鏈正構(gòu)烷烴及試驗(yàn)時(shí)所用標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 主要儀器

Pegasus?4D全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國LECO公司；Rx-17 Si毛細(xì)管柱(0.8 m×0.25 mm×0.36 μm)，美國Restek公司；7890B氣相色譜儀、DB-FFAP毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；MPS-2型多功能自動(dòng)進(jìn)樣器，德國Gerstel公司；SPME三相萃取頭(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；SB-25-12D超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HS-SPME前處理

樣品參照本團(tuán)隊(duì)前期建立并優(yōu)化的方法進(jìn)行處理[18]。將經(jīng)超純水系統(tǒng)處理過的水煮沸后冷卻至室溫，作為試驗(yàn)用水。稀釋白酒樣品至乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%，在20 mL頂空瓶中加入5 mL稀釋后的酒樣和1.5 g NaCl至飽和，加入20 μL混合內(nèi)標(biāo)(正己醇d-13，色譜純，終質(zhì)量濃度50 μg/L；愈創(chuàng)木酚d-3，色譜純，終質(zhì)量濃度20 μg/L；叔戊酸，色譜純，終質(zhì)量濃度1 197 μg/L)后迅速用帶有PTFE硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。由MPS-2型多功能進(jìn)樣器進(jìn)樣，相同條件下進(jìn)行3次。

樣品在45 ℃條件下平衡5 min，進(jìn)行攪拌萃取45 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為400 r/min。提取完成，以不分流模式在250 ℃的GC進(jìn)樣口解吸附5 min，進(jìn)行GC×GC-TOFMS檢測分析。

1.2.2 GC×GC-TOFMS 儀器條件設(shè)置

GC×GC條件：載氣He(>99.999 5%)，恒流模式，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃。采用分流比為1∶1的分流模式進(jìn)樣。一維色譜柱升溫程序[19]：起始溫度45 ℃，保持3 min后，以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min后，以6 ℃/min升溫至200 ℃，隨后以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。二維柱溫保持比一維高5 ℃。調(diào)制補(bǔ)償溫度20 ℃。調(diào)制周期4 s(熱脈沖時(shí)間0.8 s)。

TOF/MS條件：無溶劑延遲。EI電離源的電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度240 ℃。采集質(zhì)量數(shù)范圍35～400 u，采集頻率100 spectrum/s。

1.2.3 GC×GC-TOFMS 數(shù)據(jù)處理方法

定性方法：二維實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由LECO公司Chroma TOF?工作站采集并進(jìn)行處理，最大一維保留時(shí)間偏差為12 s，二維保留時(shí)間偏差為0.2 s，設(shè)定信噪比(S/N)>100的色譜峰被自動(dòng)識(shí)別[20]。與本團(tuán)隊(duì)前期建立的白酒揮發(fā)性風(fēng)味數(shù)據(jù)庫(包含近3 000種揮發(fā)性組分)進(jìn)行質(zhì)譜比對(duì)[21]，解卷積后生成包含化合物名稱、保留指數(shù)(retention index，RI)、定量離子、一維保留時(shí)間、二維保留時(shí)間、可能性、相似度、反相似度和峰面積等信息的“峰表”。然后去除含鹵素及硅元素的化合物，在此基礎(chǔ)上篩選質(zhì)譜正相似度和反相似度均大于700，且可能性>4 000的化合物；其次，利用相同色譜條件下C5～C30正構(gòu)烷烴分析結(jié)果建立RI值計(jì)算方法，將鑒定化合物的RI值與NIST網(wǎng)站中報(bào)道的相同色譜柱下的RI值進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，篩選RI<50的物質(zhì)作為具有可信度的鑒定結(jié)果[22]。

半定量方法：原始數(shù)據(jù)經(jīng)Chroma TOF?工作站中的statistical compare功能對(duì)齊色譜峰后，自動(dòng)確定定量離子并得到同一化合物在不同酒樣中的峰面積。通過多級(jí)篩選策略確認(rèn)進(jìn)行半定量的組分后，計(jì)算待測化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度乘積，將數(shù)值根據(jù)稀釋倍數(shù)擴(kuò)大得到化合物的相對(duì)含量。其中，正己醇d-13作為沸點(diǎn)較低組分的內(nèi)標(biāo)，愈創(chuàng)木酚d-3作為高沸點(diǎn)化合物內(nèi)標(biāo)，叔戊酸作為酸類化合物內(nèi)標(biāo)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SIMCA 14.0進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)，采用XLSTAT進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS鑒定不同陳釀時(shí)間古井貢酒揮發(fā)性風(fēng)味組分

為了更全面地解析古井貢酒中的揮發(fā)性組分特征，選擇了不同陳釀時(shí)間的酒樣進(jìn)行分析，包括2004年A類酒、2012年A類酒、2018年A類酒。采用HS-SPME前處理與GC×GC-TOFMS相結(jié)合的分析方法，得到了其中揮發(fā)性組分的分析圖譜。根據(jù)多級(jí)鑒定策略，對(duì)不同陳釀時(shí)間白酒中的揮發(fā)性組分進(jìn)行解析，并對(duì)其中鑒定出的組分取并集，最終得到855種揮發(fā)性化合物。然后進(jìn)行化合物香氣描述的檢索，發(fā)現(xiàn)262種具有典型香氣特征的化合物，為古井貢酒中潛在的香氣活性組分。

如圖1所示，鑒定出酯類、醇類、酸類、醛酮類、呋喃類、含氮類、含硫類、酚類、萜烯類、內(nèi)酯類、芳香族等11類化合物，主要提供果香、窖香、花香、烘烤香、酸味、焦糊味等香氣。除文獻(xiàn)中報(bào)道的60種古井貢酒主要風(fēng)味組分[23]，還有一些微量的香氣化合物。

圖1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS定性古井貢酒 揮發(fā)性香氣組分Fig.1 Qualitative volatile compounds of Gujinggong Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

呋喃類物質(zhì),如2-乙酰呋喃、2-乙?；?5-甲基呋喃等，在酒體中呈現(xiàn)明顯的烘烤香。含硫化合物,如3-甲硫基丙醛,給古井貢酒帶來煮土豆香氣。含氮化合物，如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪等閾值不高，可提供烤杏仁味[24]。還包括芳樟醇、橙花醇等萜烯類物質(zhì)，呈現(xiàn)植物芳香氣息。芳樟醇在體積分?jǐn)?shù)46%酒精水溶液中的閾值為13.1 μg/L，對(duì)風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[25]。

為比較不同年份古井貢原酒之間成分種類上的異同點(diǎn)，采用直觀的維恩圖分析，結(jié)果如圖2所示。2004年的老酒中特征組分有65種，中等年份2012年的酒樣中特征組分有57種，2018年的新酒中特征組分有46種。其中，老酒特征組分呋喃類化合物有4種，中等年份酒樣特征組分中呋喃類化合物有5種，包括2-丁酰呋喃、2,3-二氫呋喃等，而新酒特征組分中沒有呋喃類化合物。特征的萜烯類化合物在老酒中有4種，中等年份酒樣中有2種，新酒中僅1種。隨著陳釀時(shí)間增加，萜烯類化合物數(shù)量增多，為酒體增添了花香、草木香。陳釀時(shí)間較短的酒樣中未檢出特有內(nèi)酯類化合物，老酒中檢出特有的內(nèi)酯類化合物2種。其中γ-壬內(nèi)酯呈現(xiàn)椰香、甜香，可為老酒帶來重要風(fēng)味貢獻(xiàn)。研究結(jié)果從化合物數(shù)量的角度說明了呋喃類化合物、萜烯類化合物、內(nèi)酯類化合物在時(shí)間維度上具有一定規(guī)律性，這與曹玉發(fā)等[10]的結(jié)論一致。有香氣貢獻(xiàn)的特征化合物數(shù)量較多可以解釋老酒香氣的豐富性，表明微量風(fēng)味組分種類的增加可能是年份原漿風(fēng)味品質(zhì)提升的重要因素。

圖2 不同年份古井貢酒中揮發(fā)性化合物韋恩圖Fig.2 Venn diagram of volatile compounds in Gujinggong Baijiu with different aging times

2.2 采用 HS-SPME-GC×GC-TOFMS 半定量不同陳釀時(shí)間古井貢酒揮發(fā)性風(fēng)味組分

根據(jù)多級(jí)鑒定策略，首先對(duì)A級(jí)酒，7個(gè)年份，共37個(gè)樣品完成定性，再遵循同一年份不同平行之間物質(zhì)80%出現(xiàn)原則處理數(shù)據(jù)。對(duì)在不同年份酒中檢測到的473種揮發(fā)性化合物進(jìn)行半定量分析。各類物質(zhì)在不同年份古井貢原酒中的含量差異非常明顯，在陳釀過程中整體呈現(xiàn)酸增酯減的趨勢。微量揮發(fā)性風(fēng)味組分是隨陳釀時(shí)間變化最顯著的組分；呋喃類、芳香族、酚類、有機(jī)酸類以及萜烯類風(fēng)味化合物隨陳釀時(shí)間逐漸增加對(duì)于增加年份原漿香氣的豐富性具有重要貢獻(xiàn)。

由于化合物本身呈香性質(zhì)及其香氣閾值的限制，并非所有揮發(fā)性化合物均對(duì)白酒的香氣具有貢獻(xiàn)，因此有必要采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的手段篩選出具有香氣貢獻(xiàn)的陳釀規(guī)律性物質(zhì)。對(duì)在不同年份酒中多次出現(xiàn)的新酒特征化合物和陳酒特征化合物，利用PLS-DA模型對(duì)上述7個(gè)年份樣品進(jìn)行了分離，結(jié)果如圖3-a所示，R2Y=0.973，Q2=0.852，該模型擬合準(zhǔn)確性好。此外進(jìn)行了200次的置換檢驗(yàn)，通過檢驗(yàn)圖(圖3-b)可以看出直線斜率大，且Q2回歸線的截距為負(fù)值，表明該模型未過擬合。

a-PLS-DA得分圖；b-200次置換檢驗(yàn)圖圖3 不同年份古井貢酒揮發(fā)性組分含量PLS-DA圖Fig.3 PLS-DA plots of volatile compounds in Gujinggong Baijiu with different aging times

PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法。變量投影重要度(variable importance for the projection，VIP)表征了每個(gè)變量對(duì)每組樣本分類判別的貢獻(xiàn)程度，通常以VIP>1作為標(biāo)準(zhǔn)來幫助篩選有意義的化合物。分析結(jié)果表明，有50個(gè)化合物的VIP>1，被認(rèn)為是造成不同陳釀時(shí)間酒樣差異的重要指標(biāo)。

圖4展現(xiàn)了50個(gè)化合物在不同陳釀時(shí)間酒樣中的含量變化，根據(jù)在新陳酒中的含量差異將化合物分為2組。A組是新酒酒樣中含量較高的化合物，包括2-糠呋喃、苯甲酸戊酯、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-甲基-1-丁醇、β-環(huán)檸檬醛、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯等。這些化合物大多具有風(fēng)味貢獻(xiàn)，可能造成不同陳釀時(shí)間古井貢酒風(fēng)味差異。B組化合物是陳酒酒樣中含量較高的化合物，種類更為豐富，其中丙酸丙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、2-戊酰呋喃等呈現(xiàn)果香、花香、焙烤香等令人愉悅的香氣特征，可能是構(gòu)成陳酒香氣的重要風(fēng)味物質(zhì)。

其中酯類化合物作為濃香型白酒主體香氣物質(zhì)，主要呈現(xiàn)果香、窖香的感官特征[2]。在貯存過程中，大部分酯類化合物含量隨時(shí)間增加而降低，包括乙酸異戊酯、乙酰丙酸乙酯等，而丙酸丙酯等在陳酒中含量更高(圖5-a)。

醇類化合物作為酯類物質(zhì)的重要前體之一，對(duì)白酒的香氣也具有一定貢獻(xiàn)。如圖5-b，2-癸醇等高級(jí)醇的含量呈現(xiàn)上升趨勢。高級(jí)醇在發(fā)酵過程中主要由微生物通過分解代謝和合成代謝途徑生成，能使白酒的口感更協(xié)調(diào)和飽滿，賦予白酒特殊的香氣。

芳香族化合物為白酒提供花香、果香，是白酒中重要的香氣化合物。如圖5-c，乙酸苯乙酯、苯甲酸戊酯等芳香族化合物隨著陳釀過程含量降低。而苯乙酸丙酯的含量在陳釀過程中呈現(xiàn)上升趨勢。

如圖5-d所示，酸類化合物如苯甲酸、2-甲基乙酸等在陳釀過程中含量逐漸上升。這可能是由于酯類物質(zhì)水解或醛酮類物質(zhì)氧化，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的酸。

呋喃類化合物是糖降解和美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物[27]。如圖5-e所示，順-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇和2-戊酰呋喃含量在陳釀過程中是逐漸增加的，變化非常明顯。

醛酮類化合物主要由發(fā)酵過程中的微生物代謝產(chǎn)生, 也可能由陳釀過程中醇類化合物的光氧化降解、熱氧化降解或空氣氧化產(chǎn)生[26]。大部分醛酮類物質(zhì)在陳釀過程中含量逐漸升高，但如圖5-f所示，(E,E)-2,4-壬二烯醛的含量隨著陳釀時(shí)間增加呈現(xiàn)下降趨勢。

圖4 不同年份古井貢酒間具有重要差異的化合物熱圖分析Fig.4 Heat map of the volatile compounds in Gujinggong Baijiu with different aging times

萜烯及其衍生物廣泛存在于天然產(chǎn)物之中，具有獨(dú)特的植物香氣。如圖5-g，土味素和喇叭茶醇隨著陳釀時(shí)間增加其含量逐漸增加。β-環(huán)檸檬醛在新酒中含量卻普遍高于陳酒。

在含氮含硫化合物中，吡嗪類物質(zhì)主要為酒體帶來焙烤香氣。如圖5-h，2,3-二甲基-5-乙基吡嗪在陳釀過程中含量逐漸降低，這與曹玉發(fā)等[10]的結(jié)論一致。而3-甲硫基丙酸乙酯等含硫化合物隨著陳釀時(shí)間增加，含量呈上升趨勢。

2.3 不同等級(jí)不同陳釀時(shí)間古井貢酒揮發(fā)性風(fēng)味組分差異分析

陳釀對(duì)提高白酒風(fēng)味品質(zhì)的意義不言而喻，而什么樣的酒更適合陳釀目前還缺乏依據(jù)。釀造原酒風(fēng)味質(zhì)量的波動(dòng)使企業(yè)對(duì)白酒實(shí)行了分級(jí)管理，本研究對(duì)不同等級(jí)白酒經(jīng)過貯存后組分產(chǎn)生的變化進(jìn)行了探究。根據(jù)揮發(fā)性組分GC×GC-TOF/MS定性方法，對(duì)不同陳釀時(shí)間白酒中的揮發(fā)性組分進(jìn)行解析，將同一等級(jí)不同年份樣品的定性結(jié)果匯總。其中A類酒中的化合物種類最多，在2004年、2012年、2018年樣品中分別鑒定出464、420和383種揮發(fā)性組分；其次是B類酒，在2004年、2012年、2018年樣品中分別含有364、410和405種揮發(fā)性組分；C類酒中的化合物種類最少，在2004年、2012年、2018年樣品中分別含有409、366和353種揮發(fā)性組分。A類酒在貯存前感官品質(zhì)最優(yōu)，陳釀后化合物種類也最為豐富。

通過化學(xué)計(jì)量學(xué)，進(jìn)一步分析不同等級(jí)酒陳釀后產(chǎn)生的風(fēng)味差異。根據(jù)揮發(fā)性組分GC×GC-TOF/MS半定量方法，對(duì)A、B、C 三個(gè)等級(jí)不同年份酒中揮發(fā)性化合物含量進(jìn)行了解析，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行了無監(jiān)督的PCA。如圖6所示,2個(gè)主成分因子累計(jì)可解釋數(shù)據(jù)的51.24%。通過PCA可以很好地分離這9個(gè)不同等級(jí)不同陳釀時(shí)間的樣品，樣品按照等級(jí)形成明顯聚集，說明陳釀時(shí)間不同帶來的影響并不明顯，等級(jí)差異成為了聚類的主要因素。結(jié)果表明，不同等級(jí)間酒樣的差異大于不同年份的差異。故優(yōu)質(zhì)基酒的選擇才是成就高品質(zhì)年份原漿的重要保障。

3 結(jié)論

本研究以42個(gè)不同等級(jí)不同陳釀時(shí)間的古井貢酒樣為研究對(duì)象，采用HS-SPME的前處理方法結(jié)合GC×GC-TOFMS對(duì)揮發(fā)性組分差異特征進(jìn)行了全面解析。共鑒定出潛在香氣活性組分262種，通過對(duì)不同陳釀時(shí)間古井貢酒香氣組分含量的多元統(tǒng)計(jì)分析篩選出50種與年份相關(guān)的標(biāo)記物，其中大部分物質(zhì)屬于白酒中“量微香大”的揮發(fā)性化合物，包括呋喃類、含氮、含硫、內(nèi)酯類和萜烯類香氣化合物，可能是造成新陳酒香氣差異的原因之一。探究等級(jí)和年份差異對(duì)揮發(fā)性組分的影響，結(jié)果表明陳釀時(shí)間不同帶來的影響并不明顯，不同等級(jí)間酒樣的差異大于不同年份的差異。本研究更深入地認(rèn)識(shí)了陳釀古井貢酒的微量香氣化合物，豐富了濃香型白酒陳釀風(fēng)味化學(xué)理論體系，對(duì)不同陳釀時(shí)間濃香型白酒品質(zhì)研究具有重要意義。