膠原蛋白肽聯(lián)合大米肽促進皮膚健康改善功能的評價

秦修遠，魏穎*，林毅，朱艷，谷瑞增，潘興昌

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100027)2(北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100027) 3(廣東健力寶股份有限公司，廣東 佛山，528100)4(合肥工業(yè)大學，安徽 合肥，230000)

海洋魚皮中蛋白質(zhì)含量豐富，且以膠原蛋白為主。以海洋魚皮為原料經(jīng)過現(xiàn)代生物酶解工藝加工制備的膠原蛋白肽不僅有蛋白質(zhì)的營養(yǎng)特性，而且也具有一定的生理活性，特別是在美容護膚方面具有抗氧化、促進傷口愈合、免疫調(diào)節(jié)等功能[1-4]。大米肽(rice peptides, RP)是以大米蛋白為原料，經(jīng)過酶解技術獲得的小分子低聚肽類原料。課題組前期已經(jīng)針對RP的美白作用進行了考察，RP中含有能夠在mRNA和蛋白水平上調(diào)控基因信號通路以抑制酪氨酸酶蛋白表達的特征結(jié)構，能夠?qū)ζつw美白起促進作用[5-6]。

大量的研究證明了具有生理活性的低聚肽復合能夠協(xié)同增效[7-9]。然而，膠原蛋白肽(collagen peptides, CP)與RP復合后對皮膚健康的作用影響尚無研究。因此，本文選取CP與RP，以不同比例復合，對其在體外保濕、體外抗氧化、體外抑制酪氨酸酶的能力進行了研究，并基于小鼠黑素瘤細胞B16，對2種肽及其復合物對細胞內(nèi)氧化平衡及酪氨酸酶的影響進行了評價，旨在確定CP及RP在影響皮膚保濕、皮膚美白和抗衰老方面等的作用比例，為其作用機制研究及在美容方面的潛在應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料

CP、RP，北京中食海氏生物技術有限公司；酪氨酸酶(T3824-25KU)、熒光素鈉(sodium fluorescein, FL)、(S)-6-甲氧基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧酸[(S)-6-methoxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox]，Sigma；2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-azobis 2-methylpropionamidine dihydrochloride，AAPH)、左旋多巴(levodopa,L-DOPA)，Aldrich；PBS緩沖液、DMEM培養(yǎng)基，Thermo Fisher公司；胎牛血清、青鏈霉素溶液，Gibco；氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)Assay試劑盒，Abcam；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒，碧云天；CCK-8試劑盒，日本同仁化學研究所；硫酸銨、甘油，北京化工廠。

1.1.2 主要儀器

Spectra MR多功能酶標儀，Dynex；AC2-6S1 ESCO生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；240i直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher；SpectraMax i3x熒光酶標儀,美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑配制

Trolox儲備液：Trolox配制成10 mmol/L的水溶液，使用時梯度稀釋。L-DOPA母液：將0.02 gL-DOPA溶于10 mL的PBS溶液中，分裝并儲存于-20 ℃。使用時按照設定的濃度梯度稀釋。酪氨酸酶母液：將1 mL PBS溶液加入至酪氨酸酶試劑瓶中，充分振蕩溶解，分裝并儲存于-20 ℃。使用時按照設定的濃度梯度稀釋，并置于冰上操作。

1.2.2 體外評價

1.2.2.1 保濕功能評價

參考王昌濤等[10]保濕劑性能體外評價法，并略有改動。利用硫酸銨飽和溶液來控制干燥器內(nèi)相對濕度(relative humidity, RH)保持在81%。以2 cm×2 cm的3M膠帶粘貼在表面皿上模擬皮膚。將配制好的CP及RP溶液分別取200 μL滴加至貼有3 M膠帶的表面皿上，置于干燥器內(nèi)，分別于0和4 h稱取質(zhì)量，保濕率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中：m0，貼有3 M膠帶的表面皿質(zhì)量，m1，放置樣品初始表面皿質(zhì)量(0 h)，m2，放置4、8 h后表面皿質(zhì)量。

1.2.2.2 體外抗氧化活性評價

采用ORAC法評價樣本的總抗氧化活性，具體方法參考文獻，并有改動[11-12]。

標準曲線的繪制：Trolox配制成250、100、50、25、12.5、6.25、0 μmol/L水溶液。于96孔板中設置空白對照組、AAPH對照組，Trolox組，各組均加入30 μL FL溶液；取PBS 270 μL于空白對照組中，60 μL于模型對照組中，30 μL于Trolox組中，之后取梯度Trolox溶液30 μL加入Trolox組；分別取AAPH溶液210 μL加入模型對照組及Trolox組。振蕩使混合均勻，設置酶標儀激發(fā)波長為491 nm，掃描波長為512 nm，采集時間間隔3.5 ms，采集次數(shù)40次。以Trolox濃度為橫坐標、OD值為縱坐標繪制曲線，計算熒光半數(shù)衰減時間。再以Trolox濃度為橫坐標，各組Trolox濃度梯度對應的熒光半數(shù)衰減時間為縱坐標，繪制基于Trolox的ORAC標準曲線。

CP及RP的ORAC值測定：CP及RP以PBS為溶劑，分別配制成溶液，如表1所示。根據(jù)上述方法，設置空白對照組、模型對照組及實驗組，計算各樣本的ORAC值。

表1 待測樣品體外實驗配制方法Table 1 Preparation method of samples to be tested in vitro

1.2.2.3 體外抑制酪氨酸酶活性評價

參考文獻[13-14]所述實驗方法并有所改動。經(jīng)預實驗確定L-DOPA溶液、酪氨酸酶溶液的工作體系的終濃度及孵育時間。以配制好的CP、RP及CP和RP一定比例復配的混合液與酪氨酸酶溶液配制成酶系混合物，共同孵育30 min，孵育溫度為37 ℃。同時以配制好的CP、RP及CP和RP一定比例復配的混合液與L-DOPA配制成底物混合物，共同孵育30 min，孵育溫度為37 ℃。取950 μL底物混合物加入6孔板，取50 μL酶系混合物加入到底物混合物中，振蕩3 s后立即檢測混合體系在波長490 nm下的1 min內(nèi)吸光值變化。每組數(shù)據(jù)設置3次平行實驗。

1.2.3 細胞水平評價

1.2.3.1 B16細胞培養(yǎng)

小鼠黑素瘤細胞B16，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。利用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青鏈霉素溶液)在37 ℃、5% CO2及充分飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。當細胞融合至培養(yǎng)瓶80%時，可進行細胞傳代，一般培養(yǎng)3 d后可傳代。傳代方法為：棄去舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1次，利用適量質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化(通常75 mL培養(yǎng)瓶加入1 mL胰蛋白酶消化)，制備成細胞懸液，按照1∶3傳代。當細胞到達對數(shù)生長期時，可利用細胞計數(shù)板計數(shù)。用不含胎牛血清的空白DMEM高糖培養(yǎng)基將細胞調(diào)整至適當濃度，接種于細胞板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每一次實驗應采用同一傳代細胞。

1.2.3.2 CCK-8法檢測CP和RP的B16細胞毒性

在96孔板中加入濃度為2×104個/mL的細胞懸液，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，在每孔中加入10 μL待測樣品或空白DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，常規(guī)培養(yǎng)2 h后，檢測波長450 nm處的吸光值。CCK-8法檢測細胞活性的計算如公式(2)所示：

(2)

1.2.3.3 抗氧化活性評價

SOD活性檢測：使用25 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)B16細胞，設置對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細胞)、實驗組(含有樣品的DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細胞)，培養(yǎng)24 h。采用SOD試劑盒，按照上述方法將25 mL培養(yǎng)瓶中的細胞制備成細胞裂解液加入到96孔板中，每孔100 μL。按照試劑盒說明書檢測B16細胞中的SOD酶活性。每組數(shù)據(jù)設置3組平行實驗。

DCFH-DA法測定活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)：將細胞按照2×104個/mL的密度接種于不透明的96孔黑板中，設置對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細胞)、實驗組(含有樣品的DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細胞)，培養(yǎng)24 h。之后向每孔中加入10 μmol/L DCFH-DA探針，常規(guī)培養(yǎng)20 min，用PBS漂洗2次，熒光酶標儀檢測細胞在激發(fā)/發(fā)射波長為485 nm/530 nm下的熒光強度。

1.2.3.4 細胞內(nèi)酪氨酸酶活性評價

采用前述方法制備經(jīng)待測樣品培養(yǎng)的細胞裂解液，取上清液加入到96孔板中，每孔100 μL，再加入80 μLL-DOPA，常規(guī)孵育30 min，在490 nm下檢測各孔吸光值。

1.2.3.5 細胞內(nèi)黑色素含量的測定

使用25 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)B16細胞，設置對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細胞+0.3 μmol/L α-MSH)、實驗組(含有樣品的DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細胞+0.3 μmol/L α-MSH)，培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)瓶中的液體，使用胰蛋白酶消化后，收集細胞于離心管中，加入100 μL 1 mol/L NaOH溶液混勻，于80 ℃水浴30 min后，在405 nm下檢測各管中樣品的吸光值。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS v20軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析，若t檢驗，P<0.05，則證明有顯著性差異，P<0.01，則證明有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外保濕功能評價

皮膚的柔軟和光滑是由水分決定的，僅1%的含水量變化就能顯著改變皮膚的彈性和滲透性[15]，因此保濕功能是評價美容功能的重要指標。以護膚品體外保濕評價常用的5%甘油為陽性對照[16]，由圖1可知，與純水組相比，5%甘油處理后的保濕率顯著提升。在設定的實驗條件下，CP單獨使用的保濕效果與5%甘油無顯著性差異，且要好于RP單獨使用；而CP與RP復配組的結(jié)果顯示，CP與RP的比例設置為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1時，與RP單獨使用組有顯著性差異，與5%甘油無顯著性差異。

圖1 CP與RP體外保濕結(jié)果Fig.1 Results of moisturizing for CP and RP in vivo注：*表示與RP組有顯著性差異(P<0.05)

2.2 體外抗氧化結(jié)果

氧化致皮膚衰老是指活性氧簇隨著年齡增長或應激反應無法及時清除而大量累積，與細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)結(jié)合造成不可修復損傷的過程[17-18]。因此，抗氧化能力是考察美容功能的重要指標。經(jīng)Excel軟件處理得到Trolox相對熒光強度隨時間衰減的凈面積作為縱坐標，以Trolox標準溶液的濃度作為橫坐標，繪制Trolox系列標準溶液標準曲線，標準曲線方程為y=0.133 4x+0.085 2，相關系數(shù)為R2=0.999 7，如圖2所示。

圖2 Trolox標準曲線Fig.2 Trolox standard curve

不同濃度的CP、RP及CP和RP一定比例復配的混合液對氧自由基的吸收能力(ORAC)實驗結(jié)果如圖3所示。體外過氧自由基吸收能力(ORAC)測定的結(jié)果以Trolox當量表示，與RP相比，CP對于過氧自由基的吸收能力更強，具有更好的抗氧化性。當CP與RP以一定比例復合后，抗氧化能力隨CP含量的增強呈梯度劑量效應。當CP與RP的混合比例在4∶1和5∶1時，ORAC值與比例為3∶1的結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，但與比例為2∶1組的結(jié)果有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 CP、RP及其復合物體外抗氧化(ORAC)結(jié)果Fig.3 Antioxidant (ORAC) results of CP, RP and their complexes in vitro注：#表示與CP∶RP=2∶1組有顯著性差異(P<0.05)

2.3 體外抑制酪氨酸酶實驗結(jié)果

酪氨酸酶活性測定法具有測定時間短、操作簡便、所需費用低的特點，適用于對美白劑進行快速篩選[19]。CP、RP及2種原料復配對酪氨酸酶的抑制活性結(jié)果如圖4所示。

圖4 CP、RP及其復合物體外抑制酪氨酸酶實驗結(jié)果Fig.4 Results of inhibition of tyrosinase by CP, RP and their complexes in vitro注：#，與CP組相比，差異顯著(P<0.05)，##差異 極顯著(P<0.01)；*，與RP組相比差異顯著(P<0.05)， **，差異極顯著(P<0.01)(下同)

在單獨使用時，RP比CP的酪氨酸酶抑制活性更強且差異極顯著，但當二者復配時呈現(xiàn)出了不同的結(jié)果。CP與RP以1∶1的比例復配時，酪氨酸酶抑制活性與RP單獨使用無顯著差異(P>0.05)，但與CP單獨使用差異顯著(P<0.05)，此外，隨著CP與RP比例的升高至1∶4和1∶5時，酪氨酸酶活性抑制率與CP呈極顯著差異(P<0.01)。當CP與RP以2∶1比例復配時，對酪氨酸酶的抑制率效果最好，且高于其他復配比例組合的結(jié)果，與RP、CP單獨使用組的結(jié)果差異極顯著(P<0.01)。說明RP與CP的復配對酪氨酸酶的抑制活性并非簡單疊加，而是協(xié)同增效。因此，結(jié)合體外抗氧化實驗結(jié)果，選擇CP∶RP=1∶1、2∶1和3∶1進行下一步細胞實驗的探討。

2.4 CCK-8法確定待測樣品的B16細胞毒性

采用CCK-8法對不同濃度的RP、CP及CP與RP的復配溶液進行了B16細胞毒性考察，結(jié)果如表2所示。綜合各實驗組的細胞存活率，樣品質(zhì)量濃度為200 μg/mL組與空白組無顯著性差異，因此選擇樣品質(zhì)量濃度為200 μg/mL作為細胞實驗的樣品添加濃度。

表2 CCK-8法測定細胞毒性結(jié)果Table 2 Cytotoxicity determination (CCK-8)

2.5 RP、CP及其復合物對B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

皮膚中黑色素的生成過程的關鍵限速酶是酪氨酸酶[20]，酪氨酸酶將酪氨酸催化生成多巴、多巴醌，再通過進一步的生化反應生成黑色素。為研究RP和CP及其復合物對B16細胞內(nèi)酪氨酸酶的影響檢測了B16細胞內(nèi)酪氨酸酶的活性。如圖5所示，與空白組相比，經(jīng)過RP、CP及其復合物處理的B16細胞內(nèi)酪氨酸酶的活性均有降低。CP與RP以2∶1的比例復合對細胞內(nèi)酪氨酸酶的活性抑制效果最佳，且與RP組、CP組差異極顯著(P<0.01)，當比例為3∶1時，與RP組差異顯著(P<0.05)。由此可知，對于抑制B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的最佳復配比例為CP∶RP=2∶1。

2.6 RP、CP及其復合物對B16細胞內(nèi)抗氧化水平的影響

細胞內(nèi)過量的的ROS能夠引起細胞內(nèi)氧化應激，消耗抗氧化物質(zhì)或?qū)е驴寡趸甘Щ睿T導黑色素細胞增殖和激活黑色素生成的關鍵酶，刺激黑色素生成[21]。SOD是廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，在維持機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用[22]。因此，細胞內(nèi)ROS和SOD水平能夠反應細胞內(nèi)氧化和抗氧化的水平。圖6和圖7的結(jié)果顯示，隨著RP、CP及其復合物的加入，細胞內(nèi)ROS水平降低，SOD活力升高。且當二者復合時，抗氧化效果更好。同時，CP與RP以2∶1的比例復合時，ROS相對含量與RP組、CP組差異極顯著(P<0.01)，SOD活力與RP組、CP組差異極顯著(P<0.01)，抗氧化水平最強。

圖6 CP、RP及其復合物對B16細胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.6 Effects of CP, RP and their complexes on ROS level in B16

圖7 CP、RP及其復合物對B16細胞內(nèi)SOD活力的影響Fig.7 Effects of CP, RP and their complexes on SOD activity in B16

3 結(jié)論

體外抗氧化實驗(ORAC)法檢測得到的最佳抗氧化復配肽的比例為CP∶RP=3∶1，這與B16細胞內(nèi)SOD酶活性和ROS含量檢測對應的復配肽比例CP∶RP=2∶1不一致，這可能與抗氧化物質(zhì)、自由基以及二者之間的作用機制的復雜性相關。事實上，沒有任何1種單一反應可以精確地反映所有自由基混合物中所有的抗氧化劑的抗氧化能力?？寡趸瘎┫到y(tǒng)包括酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，還包括一些大分子，如白蛋白、銅藍蛋白、鐵蛋白等，也包括一些小分子，如抗壞血酸、生育酚、泛素-10、還原型谷胱甘肽等。因此，難以單獨測量組織中每種抗氧化成分以及不同抗氧化成分之間的相互作用。因此，以ORAC等為代表的總抗氧化能力測定方法，由于其高特異性而被廣泛使用。然而，ORAC也具有一定缺陷，例如，CAO等[23]認為，ORAC法與TEAC法對抗氧化水平的檢測結(jié)果可能不具有相關性。

盡管CP與RP均具有一定的抗氧化性和保濕性能，且對于酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，但是CP在抗氧化和保濕方面具有更好的效果，而RP在抑制酪氨酸酶活性方面效果更佳。因此，為了尋求1款在促進皮膚健康方面功效更全面的原料，將CP和RP進行了復配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復配原料能夠在促進保濕、抗氧化和抑制酪氨酸酶活性方面能夠比單一原料使用協(xié)同增效。

CP與RP以2∶1的比例復配，能夠表現(xiàn)出比5%甘油更強的體外保濕效果；體外生化實驗中，具有比2種肽原料單獨使用或以其他比例復配更強的酪氨酸酶抑制活性；并在小鼠黑素瘤細胞B16的細胞實驗中，能夠清除細胞內(nèi)的氧自由基，提高細胞內(nèi)SOD酶的活力，顯著降低酪氨酸酶的活性。