高F值南極磷蝦小分子肽的制備優(yōu)化及其對(duì)HepG2細(xì)胞影響研究

鄢珊瑤，遲海，馮廣朋，房文紅，張淑平，黃艷青*

1(上海理工大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院，上海，200093)2(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200090)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是一種主要分布在南冰洋的浮游生物，其總生物量超過8億t，體內(nèi)富含高質(zhì)量蛋白和活性物質(zhì)，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值[1-3]。目前南極磷蝦產(chǎn)品主要有南極磷蝦粉、生物活性肽和南極磷蝦油等[4-5]。南極磷蝦粉作為銷售量最高的南極磷蝦產(chǎn)品，經(jīng)乙醇提取南極磷蝦油后形成脫脂南極磷蝦粉，通常被廠家作為飼料蛋白源直接售賣給飼料企業(yè)[6]。隨著南極磷蝦漁業(yè)及生產(chǎn)加工技術(shù)的發(fā)展和社會(huì)對(duì)高附加值南極磷蝦產(chǎn)品需求的增加，充分利用南極磷蝦資源開發(fā)海洋保健食品、藥物和生物制品將是南極磷蝦產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要方向之一，也是海洋生物資源有效利用亟待解決的問題。

以獲取南極磷蝦生物活性肽為目的，利用蛋白酶水解脫脂南極磷蝦粉是提高其附加值的一種有效方法。近年來，相關(guān)研究表明一些蛋白酶解物具有影響細(xì)胞生長代謝、生物合成及蛋白表達(dá)的功能[7]。其主要原因是蛋白酶解液中的寡肽不僅為細(xì)胞生長提供易分解的氮源，還能夠提供多種營養(yǎng)成分、貼壁因子及生長因子類似物等，且不同類型蛋白酶解物對(duì)細(xì)胞生長和提高靶向蛋白產(chǎn)量具有協(xié)同作用[8]。

經(jīng)脫芳和分離純化處理后的蛋白酶解物可制備出高F值寡肽，這類寡肽一般是由3～9個(gè)氨基酸殘基所組成的寡肽混合物，其相對(duì)分子質(zhì)量在0.2～0.6 kDa，且支鏈氨基酸(branched chain amino acid, BCAA)，即亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸,與芳香族氨基酸(aromatic amino acid, AAA)，即苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的物質(zhì)的量比值大于20[9]。高F值寡肽具有輔助治療肝性腦病、改善營養(yǎng)狀態(tài)、降低血氨、抗疲勞、解酒等功能[10-13]。

本研究以萃取南極磷蝦油后的脫脂南極磷蝦粉為原料，通過堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶二次酶解工藝提升脫脂南極磷蝦粉的酶解效率，并利用活性炭吸附技術(shù)脫除芳香族氨基酸，制備南極磷蝦高F值小分子肽(Antarctic krill peptides with high-Fischer ratio, HF-AKP)。并以人肝癌細(xì)胞株HepG2為研究對(duì)象，探討HF-AKP對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞生長、凋亡周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。旨在為提升脫脂南極磷蝦粉的附加值，為高F值南極磷蝦生物活性肽的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用提供理論和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與試劑

脫脂南極磷蝦粉由威海市宇王集團(tuán)有限公司提供(總蛋白含量為74.2%，水分含量為4.9%)；Alcalase?2.4 L堿性蛋白酶(1.2×105U/g)、Flavourzyme?500MG復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(2.9×104U/g)，諾維信公司；甲醛、NaOH、HCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；活性炭(200目)，上海鑫匯活性炭有限公司；Cell Counting Kit-8試劑盒(C0037)、PI細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1052)、蛋白裂解液(P0012S)，碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、HepG2細(xì)胞、人Bcl-2檢測試劑盒(ELISA)、Bax檢測試劑盒(ELISA)、人核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)試劑盒(ELISA)，上海圓創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Kjeltec TM 2200凱氏定氮儀，丹麥福斯公司；CF16RXII高速冷凍離心機(jī)，日本日立集團(tuán)；Power wave XS酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；PHSJ-3F pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Minimate TFF system切向流超濾裝置，美國PALL公司；VIVAFLOW 50 R超濾膜包，德國賽利多斯公司；8000細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技；FACSVerse流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HF-AKP的制備

脫脂南極磷蝦粉(浸泡，粉碎) → 堿性蛋白酶[料液比1∶17.5(g∶mL)，加酶量5.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，溫度55 ℃，酶解6 h]→復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(加酶量4.0%，酶解3 h，溫度50 ℃)→沸水滅活12 min→離心(5 000 r/min，15 min)→上清超濾納濾(<5 kDa，Antarctic krill peptides，AKP)→活性炭(7.0%，1.5 h)吸附→離心(8 000 r/min，5 min)→HF-AKP

1.3.2 水解度(degree of hydrolysis，DH)的測定

DH測定參考李明杰等[14]的方法，按照公式(1)計(jì)算。公式(1)中酶解上清液中的氨基酸態(tài)氮含量參照GB/T 5009.39—2003《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》甲醛電位滴定法測定，總氮含量參照GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法測定。

(1)

1.3.3 堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化

試管內(nèi)加入2.0 g脫脂南極磷蝦粉，以料液比1∶15.0(g∶mL)、加酶量5.0%、酶解溫度50 ℃、時(shí)間3 h(pH=7.0)為起始最優(yōu)條件，進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。本研究中，以DH為檢測指標(biāo)，堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化選取料液比(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)和酶解時(shí)間(D)為單因素指標(biāo)(表1)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取各因素最優(yōu)水平，對(duì)堿性蛋白酶酶解的L9(34)正交試驗(yàn)(表2)進(jìn)行優(yōu)化。

表1 堿性蛋白酶酶解條件單因素水平表Table 1 Factors and levels of single hydrolysis conditions for Alacalase

表2 堿性蛋白酶酶解條件L9(34)正交因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal hydrolysis conditions for Alacalase

1.3.4 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶二次酶解條件及優(yōu)化

在堿性蛋白酶最優(yōu)條件酶解基礎(chǔ)上，以加酶量3.0%，時(shí)間3 h為起始最優(yōu)條件，進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(溫度50 ℃，pH=7.0)。以DH為指標(biāo)，篩選復(fù)合風(fēng)味蛋白酶二次酶解的最佳加酶量和酶解時(shí)間，各因素對(duì)應(yīng)水平見表3。

表3 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解條件單因素水平表Table 3 Factors and levels of single hydrolysis conditions for Flavourzyme

1.3.5 氨基酸組成及F值測定

參照GB/T 5009.124—2003《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》分析HF-AKP的氨基酸組成。根據(jù)公式(2)計(jì)算F值。

(2)

式中：MVal，纈氨酸摩爾濃度；MIle，亮氨酸摩爾濃度；MLeu，異亮氨酸摩爾濃度；MTyr，酪氨酸摩爾濃度；MPhe，苯丙氨酸摩爾濃度；MTrp，色氨酸摩爾濃度。

1.3.6 HF-AKP對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響

參照陳永強(qiáng)等[15]的方法，對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。用CCK-8法測定HF-AKP對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響，參考陳永強(qiáng)等[15]的方法并稍作修改：將生長到對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞稀釋至5.0×104cells/mL，接種100.0 μL到96孔板，在37 ℃、5.0%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h和48 h。將HF-AKP加入到培養(yǎng)后的HepG2細(xì)胞使終質(zhì)量濃度分別達(dá)到40.9、81.8、163.6 mg/L，補(bǔ)足體積至200.0 μL，此為實(shí)驗(yàn)組；加入100.0 μL的PBS和終質(zhì)量濃度為20.0 mg/L的5-FU分別為空白和陽性對(duì)照組。將HepG2細(xì)胞放置于37 ℃，5.0% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后加入20.0 μL的CCK-8在相同條件下避光孵育3 h，在450 nm下測定同一時(shí)間點(diǎn)吸光度。由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，HF-AKP對(duì)HepG2細(xì)胞生長有抑制作用，因此，按公式(3)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

(3)

1.3.7 PI/RNase單染檢測凋亡周期

調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105cells/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃，5.0% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸取HF-AKP和5-FU加入到完全培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度分別為163.6和20.0 mg/L，補(bǔ)足每個(gè)孔的培養(yǎng)基至總體積為200.0 μL，另設(shè)置陰性對(duì)照組培養(yǎng)。后續(xù)參照李娜等[16]的方法操作，用流式細(xì)胞儀檢測HF-AKP和5-FU對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡周期的影響。

1.3.8 ELISA檢測NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)水平

細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.3.7，離心收集各組細(xì)胞的上清液，根據(jù)試劑盒說明書檢測細(xì)胞上清液中NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白的含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行測定，用平均值±方差來表示。采用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)各組間數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后采用SPSS進(jìn)行Duncan多重比較，P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 堿性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

從圖1-a可知，隨著料液比(g∶mL，下同)的增加，DH顯著增加(圖1-a)。當(dāng)料液比繼續(xù)增加到1∶20.0時(shí)，DH達(dá)到最大值(9.9±0.1)%，但其與在料液比為1∶15.0、1∶17.5時(shí)的DH無顯著差異(P>0.05)?？紤]到反應(yīng)體系中水相過多會(huì)對(duì)后續(xù)酶解液濃縮及真空干燥步驟造成較大影響，因此選擇1∶12.5、1∶15.0、1∶17.5作為正交試驗(yàn)料液比因素的三水平。同時(shí)，隨著加酶量的增加，總體DH也顯著增加(P<0.05)，在加酶量6.0%處達(dá)到最大值(10.1±0.4)%(圖1-b)?？紤]到蛋白酶制劑的經(jīng)濟(jì)成本和DH增值的大小，選擇4.0%、5.0%、6.0%為正交試驗(yàn)加酶量因素的三水平。隨著溫度和時(shí)間的增加，DH顯著增加(P<0.05)(圖1-c和圖1-d)。在60 ℃時(shí)，DH達(dá)到最大值(9.2±0.1)%；但溫度由55 ℃增加到60 ℃時(shí)，DH增長不顯著(P>0.05)。在6 h達(dá)到最大值(10.2±0.3)%，5～6 h的DH變化無顯著差異(P>0.05)?？紤]到能量損耗和工藝時(shí)長等因素，選擇酶解溫度45、50、55 ℃和酶解時(shí)間4、5、6 h作為后續(xù)正交試驗(yàn)的單因素水平。

a-料液比；b-加酶量；c-溫度；d-時(shí)間圖1 堿性蛋白酶的單因素酶解工藝參數(shù)優(yōu)化Fig.1 Optimization of single factor enzymatic hydrolysis conditions for Alacalase注：不同字母表示具有顯著差異(P<0.05,下同)

堿性蛋白酶在不同因素條件下酶解工藝條件優(yōu)化結(jié)果見表4和表5。

表4 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test L9(34) for Alacalase

表5 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)L9(34)方差分析結(jié)果Table 5 Results of orthogonal test L9(34) variance analysis for Alacalase

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)因素均對(duì)酶解效率有顯著影響，其F值均小于F臨界值(P<0.05)。4個(gè)因素條件對(duì)南極磷蝦粉DH影響程度依次是A>D>B=C。因此，實(shí)驗(yàn)確立堿性蛋白酶酶解最優(yōu)條件為A3B2C3D3，即料液比為1∶17.5，加酶量5.0%，溫度55 ℃，時(shí)間6 h。此條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)，DH值為(10.7±0.2)%。

2.1.2 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶二次酶解及優(yōu)化

目前國內(nèi)外制備海洋動(dòng)物蛋白源高F值寡肽多采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行二次酶解，從而提高酶解產(chǎn)物得率[17]。此外復(fù)合風(fēng)味蛋白酶具有水解肽鏈端疏水氨基酸的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)去除酶解液中苦味的目的。本課題組前期研究結(jié)果表明，利用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶獲得的酶解液風(fēng)味最佳，并且可以減少苦味氨基酸含量[18]。

圖2-a結(jié)果顯示，DH隨復(fù)合風(fēng)味蛋白酶量的增加而顯著增加(P<0.05)。在加酶量4.0%時(shí)DH達(dá)到最大值(17.3±0.2)%。根據(jù)DH的大小，選擇復(fù)合風(fēng)味蛋白酶最佳加酶量為4.0%。同時(shí)，DH隨著復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解時(shí)間的延長而增大(圖2-b)，在酶解5 h達(dá)到最大DH值(18.2±0.6)%，但酶解時(shí)間從3 h增加到5 h，DH無顯著差異(P>0.05)。綜合考慮，選擇復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的最佳條件為加酶量4.0%，酶解3 h。

a-加酶量；b-時(shí)間圖2 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解條件參數(shù)優(yōu)化Fig.2 Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for Flavourzyme

2.2 AKP(<5 kDa)的吸附脫芳處理

目前酶解液脫芳多采用活性炭吸附法[19-20]，活性炭具有很高的吸附效率，對(duì)疏水性化合物的親和力極高，在支鏈氨基酸和芳香族氨基酸同時(shí)存在的情況下，會(huì)優(yōu)先吸附芳香族氨基酸[21]。因此，本研究中將二次酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜(5 kDa)和納濾膜(500 Da)過濾，得到脫脂南極磷蝦小分子肽混合物(<5 kDa，AKP)，再通過一定量的活性炭對(duì)芳香族氨基酸進(jìn)行吸附，得到HF-AKP。

由表6可知，AKP經(jīng)活性炭處理后，芳香族氨基酸中酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)的含量分別從(34.0±1.2)、(43.7±2.5)、(6.7±0.1) μmol/mL降低到(0.9±0.2)、(1.1±0.0)、0.0 μmol/mL，支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的摩爾比(F值)由2.4±0.2上升至87.2±0.7，且HF-AKP中苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)含量為(0.37±0.1)%，這兩個(gè)數(shù)值(F值>20.0，Phe+Tyr含量<2.0%)說明HF-AKP符合高F值小分子肽的要求[22]。

表6 脫脂南極磷蝦酶解液(<5 kDa)脫芳 前后氨基酸組成分析 單位:μmol/mL

目前報(bào)道的高F值產(chǎn)品F值多在20～40，如金槍魚高F值寡肽F值為30.3[17]；羅非魚高F值寡肽的F值為23.1[23]；高F值櫛孔扇貝酶解液的F值為34.7[21]；帶魚高F值寡肽的F值為28.1[9]；LAN等[24]利用南極磷蝦粉兩步酶解法制取高F值寡肽的F值為21.1。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)處理所得到的HF-AKP的F值均高于上述文獻(xiàn)結(jié)果。

2.3 HF-AKP對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響

HF-AKP和5-FU對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響見圖3。20.0 mg/L 5-FU作用于HepG2細(xì)胞24 h時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率為(53.8±0.4)%，而作用48 h時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率為(58.6±0.2)%；24 h時(shí)，HF-AKP實(shí)驗(yàn)組(40.9、81.8、163.6 mg/L)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率分別為(23.7±0.2)%、(40.1±0.4)%和(64.1±0.2)%，而48 h時(shí)HF-AKP實(shí)驗(yàn)組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率分別為(25.4±0.3)%、(43.0±0.3)%、(67.9±0.4)%。與空白對(duì)照組相比，5-FU(20.0 mg/L)和HF-AKP(40.9、81.8、163.6 mg/L)對(duì)HepG2細(xì)胞生長均有明顯的抑制作用(P<0.01)，細(xì)胞增殖抑制率和HF-AKP的濃度正相關(guān)，且高濃度的HF-AKP(163.6 mg/L)的抑制效果優(yōu)于陽性對(duì)照(5-FU，20.0 mg/L)。

隨著HF-AKP濃度升高及作用時(shí)間延長，細(xì)胞增殖抑制率上升，說明HF-AKP以劑量和時(shí)間正向依賴性抑制HepG2細(xì)胞的生長。陽性對(duì)照組(5-FU)和HF-AKP實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖抑制率在24 h和48 h時(shí)的差異雖然有顯著差異(P<0.01)，但是從數(shù)值上看，細(xì)胞抑制率增加不高，故后期在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子ELISA檢測試驗(yàn)中均選擇樣品處理肝癌細(xì)胞24 h，HF-AKP的質(zhì)量濃度選定163.6 mg/L。

a-處理24 h；b-處理48 h圖3 CCK-8法測定樣品對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖抑制情況Fig.3 Inhibition of the proliferation of HepG2 liver cancer cells by CCK-8 methods注：5-FU為陽性對(duì)照(20 mg/L 5-FU);HF-AKP1為40.9 mg/L HF-AKP；HF-AKP2為 81.8 mg/L HF-AKP；HF-AKP3為 163.6 mg/L HF-AKP(下同)

2.4 PI/RNase單染檢測HepG2細(xì)胞凋亡周期

5-FU和HF-AKP對(duì)HepG2細(xì)胞生長周期的影響見圖4。與空白對(duì)照組相比，HF-AKP組(163.6 mg/L)和陽性對(duì)照組(5-FU，20.0 mg/L)處理HepG2細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例上升，分別從(46.0±2.4)%增加到(71.2±1.5)%和(62.0±0.8)%，而S期細(xì)胞則從(50.6±1.1)%分別減少到(26.2±3.1)%和(35.1±0.6)%。可見5-FU和HF-AKP均可使HepG2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，且HF-AKP阻滯效果更佳。

a-對(duì)照；b-5-FU；c-HF-AKP3；d-細(xì)胞周期分布圖4 樣品對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響及樣品處理HepG2細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期分布圖Fig.4 Effects of samples on the cell cycle distribution in HepG2 cells and the cell cycle distribution of HepG2 cells after exposure to samples for 24 h

2.5 ELISA檢測NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)水平

肝細(xì)胞的凋亡及再生是人體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要措施，諸多研究表明，調(diào)亡因子作用的減弱和抗調(diào)亡因子作用的增強(qiáng)是肝癌的重要發(fā)病機(jī)制之一[25]。NF-κB是抗炎和凋亡基因表達(dá)過程中的一種關(guān)鍵的調(diào)控因子[26]，而Bcl-2和Bax是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的關(guān)鍵基因，有研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系亦是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[27]。因此在研究活性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長影響時(shí)，通常檢測Bax蛋白和Bcl-2蛋白這2個(gè)Bcl-2家族最具代表性的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表達(dá)量，同時(shí)也會(huì)檢測Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)量的比值來判斷活性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長的作用機(jī)制。

本研究中采用人核因子NF-κB、Bcl-2及Bax相關(guān)檢測試劑盒(ELISA)，檢測5-FU(20.0 mg/L)和HF-AKP(163.6 mg/L)作用于HepG2細(xì)胞24 h時(shí)，HepG2細(xì)胞上清液中NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果見表7。與對(duì)照組相比，5-FU(20.0 mg/L)和HF-AKP(163.6 mg/L)處理HepG2細(xì)胞24 h后，顯著抑制HepG2細(xì)胞上清液中NF-κB、Bcl-2蛋白的表達(dá)量(P<0.05)，5-FU(20.0 mg/L)和HF-AKP(163.6 mg/L)亦促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，但并不顯著(P>0.05)，另外5-FU和HF-AKP組的Bax/Bcl-2比值均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。由于Bax大量表達(dá)時(shí)會(huì)加速細(xì)胞凋亡，而Bcl-2占優(yōu)勢時(shí)細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖，所以推測HepG2細(xì)胞凋亡與Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值增加和NF-κB蛋白表達(dá)減少有關(guān)。

表7 樣品對(duì)HepG2細(xì)胞上清液中NF-κB、 Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)量的影響Table 7 Effect of samples on the expression of NF-κB, Bcl-2 and Bax protein in the supernatant of HepG2 cells

吳靖娜等[28]的研究表明，鮑內(nèi)臟肽粉對(duì)H2O2氧化損傷的HepG2細(xì)胞有一定增殖作用，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯，推測鮑內(nèi)臟肽粉對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。魏彬彬[29]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦肽的美拉德產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞的生長有顯著的促進(jìn)作用，且濃度越高，細(xì)胞增殖效果越明顯。本研究結(jié)果與上述結(jié)果截然相反，研究所制備的HF-AKP可顯著抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞生長，并在一定的范圍內(nèi)呈劑量、時(shí)間依賴性，HF-AKP能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，其凋亡機(jī)制可能與Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值增加，以及NF-κB蛋白表達(dá)減少有關(guān)，推測HF-AKP有一定抗腫瘤功效。

3 結(jié)論

研究以南極磷蝦油生產(chǎn)后的脫脂南極磷蝦粉為原料，采用雙酶分步水解制備蛋白酶解液。優(yōu)化后的最佳堿性蛋白酶酶解工藝為料液比1∶17.5，加酶量5.0%，時(shí)間6 h，溫度55 ℃；二次酶解復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的最優(yōu)工藝為加酶量4.0%，時(shí)間3 h。在優(yōu)化的酶解條件下，酶解液先經(jīng)超濾、納濾得到<5 kDa的南極磷蝦小分子肽，再采用活性炭靜態(tài)吸附脫除其中的游離芳香族氨基酸，制備得到F值為87.2±0.7的脫脂南極磷蝦高F值小分子肽。

CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡周期以及NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)量ELISA檢測結(jié)果均表明：HF-AKP可顯著抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的生長，并在一定的范圍內(nèi)呈劑量、時(shí)間依賴性，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。HF-AKP可將HepG2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。其凋亡機(jī)制可能與Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值增加，以及NF-κB蛋白表達(dá)減少有關(guān)，推測HF-AKP可能有一定抗腫瘤功效。由于目前對(duì)蛋白水解物影響動(dòng)物細(xì)胞生命活動(dòng)的作用機(jī)理尚未完全闡明，且蛋白水解物中的活性多肽的組成亦多種多樣，后期還需進(jìn)一步對(duì)本研究中所制備的HF-AKP中活性肽組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，并深入研究其對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響及調(diào)控機(jī)制。