餐廚垃圾中油脂高效降解菌酯香微桿菌(Microbacterium esteraromaticum)的分離及其應(yīng)用

易蒲紅，李芩萍，趙彩虹，丁曉艷，王寧，朱廷恒*，李季,

1(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310000)2(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有機循環(huán)研究院(蘇州)， 江蘇 蘇州，215128)3(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京，100089)

餐廚垃圾是世界上最豐富的有機廢棄物，是城市生活垃圾的主要部分。我國新鮮餐廚垃圾含水率高達70%～90%，干其含油率高達20%～30%[1]，在進行資源化利用時通常需要進行預(yù)處理，主要包括破碎、過濾以及不同程度的清洗，產(chǎn)生大量的油脂廢水。餐廚垃圾油脂廢水中含動植物油和脂肪，在水體表層形成油膜阻礙O2傳遞[2-3]。餐廚垃圾油脂廢水直接通過下水道排放會危害水體生態(tài)系統(tǒng)，造成嚴重的環(huán)境威脅[4-5]。此外，油脂也是城市污水中需要預(yù)先處理的重要污染物之一[6]。

油脂廢水的主要處理方式有物理法、機械法、化學(xué)法和生物法等[7]。物理法、機械法等只能去除部分的浮油和分散油，而水體中的乳化油和溶解油的處理難度較大?；瘜W(xué)法雖能較好地處理乳化油，但對生態(tài)環(huán)境不友好且難以降解[8]。而生物法是微生物通過分泌脂肪酶類對油脂進行生物氧化；處理工藝簡單、成本低，且不會造成二次污染，是深度處理有機物的重要手段之一[9-10]。因此，尋找和篩選高效的油脂降解菌是進行餐廚垃圾油脂廢水生物處理過程中的關(guān)鍵。本研究使用大豆油為模式底物，從不同餐廚垃圾樣本中篩選出1株能在中溫條件下高效降解油脂的酯香微桿菌，命名為JY34，為餐廚垃圾中油脂廢水的處理提供了理論基礎(chǔ)，并拓寬了該類菌的應(yīng)用場景。

1 材料與試劑

1.1 材料與培養(yǎng)基

用于分離油脂降解菌的樣品來源于江蘇蘇州多個餐廚垃圾處理點，取樣后于4 ℃冷藏備用。餐廚垃圾由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有機循環(huán)研究院食堂提供。

食用大豆油、1.6%中性紅溶液、甘油三丁酸酯、對硝基苯酚、對硝基苯酚棕櫚酸酯、Taqpremix，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

富集培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 5.0，大豆油20.0，pH自然。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH自然。

油脂中性紅培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，花生油10.0 g，牛肉膏5.0 g，瓊脂20.0 g, 蒸餾水定容至1 000 mL，1.6%中性紅水溶液1 mL，pH 7.2。

三丁酸甘油酯培養(yǎng)基(g/L)：特殊蛋白胨5.0，酵母提取物3.0，瓊脂20.0，甘油三丁酸酯10.0，pH自然。

大豆油無機鹽培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO45.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 2.0，NaH2PO42.0，大豆油 10.0，pH自然。

脂肪種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，(NH4)2SO45.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，大豆油10.0，pH自然。

脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20.0，葡萄糖5.0，(NH4)2SO41.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，大豆油10.0，pH自然。

各培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5418 R冷凍離心機，艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司；XSP-BM-8CAP顯微鏡，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；NanoDrop-2000核酸檢測儀、Bio-Rad PCR儀，賽默飛世爾科技公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BioTek多功能微孔板檢測儀，北京伯騰儀器有限公司提供。

1.3 油脂降解菌的篩選

1.3.1 菌種的馴化與分離

稱取10 g冷藏樣品與300 mL富集培養(yǎng)基混合均勻，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，在第4天補充1%(體積分數(shù)，下同)大豆油加以馴化。第1次培養(yǎng)結(jié)束后，靜置后取上層液體10 mL加入到新的富集培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d，并于第4天補充2%大豆油。每周依次按1%梯度補加大豆油，馴化1個月后進行分離。將最后轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)液稀釋涂布在LB固體平板上，于30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。在相同條件下，選取生長速度快、菌落形態(tài)差異顯著的單菌落進行編號。

1.3.2 初篩

單菌落轉(zhuǎn)接于油脂中性紅培養(yǎng)基平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，每天定時觀察菌落顏色變化。挑選變紅的菌株制成菌液滴加5 μL于三丁酸甘油酯固體平板上，于30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。選擇同一培養(yǎng)條件下生長速度快，透明圈較大的菌株為初步篩選的油脂降解菌，并轉(zhuǎn)接至斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 復(fù)篩

從斜面挑取初篩的解油菌分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)14～16 h，獲得種子液，通過血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整菌液濃度至1×107CFU/mL。菌液按2%(體積分數(shù)，下同)的接種量接種至50 mL培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床發(fā)酵3 d后測定油脂降解率。

1.3.4 油脂降解率的測定

大豆油標準曲線的測定：精確稱取10.0 g大豆油，溶于100 mL容量瓶中，用石油醚定容至標線，制備成含100 mg/mL大豆油標準溶液母液。隨后分別吸取母液配制成0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、3.2、4 mg/mL大豆油標準溶液。采用紫外分光光度法[11]在225 nm波長下，以石油醚作為空白溶液，分別測量上述系列質(zhì)量濃度的大豆油標準溶液的吸光值來繪制標準曲線。發(fā)酵液油脂通過石油醚萃取，充分搖勻后靜置30 min，取上層液體適當(dāng)稀釋后測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算剩余油脂的濃度，根據(jù)公式(1)計算油脂降解率：

(1)

1.4 油脂降解菌的鑒定

1.4.1 菌落和細胞形態(tài)觀察

取斜面保藏菌種在LB平板上劃線，于30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)變化，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.4.2 目的菌株16S rDNA的基因測序分析

挑取單菌落進行菌落PCR。擴增體系(50 μL)：DNA模板2 μL，引物27F 0.6 μL，1492R 0.6 μL，PCR Premix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 1 min，退火54 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程有限公司進行測序，將所得序列在GenBank用BLAST進行檢索比對，篩選出與該序列相似性較高的16S rDNA序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，尋找與其同源性最近的菌種。

1.5 油脂降解條件的研究

將活化后的菌株JY34接入50 mL LB培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)14～16 h。獲得種子液后，將菌濃度調(diào)節(jié)至1×107CFU/ mL備用。

溫度考察：設(shè)置培養(yǎng)溫度為20、30、40、50、60 ℃，按照2%的接種量分別接種1 mL菌液于含1.5%大豆油的50 mL無機鹽培養(yǎng)基中(pH 7.0)，180 r/min發(fā)酵3 d后測定不同溫度條件下的油脂降解率。pH考察：設(shè)置pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在相同條件下進行發(fā)酵后測定不同pH條件下的油脂降解率。接種量考察：設(shè)置接種量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，測定不同接種量條件下的油脂降解率。底物濃度考察：設(shè)置大豆油添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，測定不同含油量條件下的油脂降解率。

1.6 油脂降解菌脂肪酶發(fā)酵測定

1.6.1 酶活力定義及標準曲線的測定

在30 ℃，pH 7.0條件下，樣品水解對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-nitrophenyl palmitate，p-NPP)，每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚(p-nitrophenol，p-NP)所需的酶量為1個酶活力單位(U)。反應(yīng)體系及計算公式參照梁秋艷[12]的方法。

1.6.2 發(fā)酵粗酶液脂肪酶活力測定

將種子液按2%的接種量接種至裝有50 mL脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后收集發(fā)酵液。經(jīng)8 000 r/min離心10 min后取上清液5 mL于離心管中，立即置于冰上待測。根據(jù)公式(2)計算實測吸光度值：

ΔA=A-A0

(2)

式中：A，樣品吸光度值；A0，空白對照組吸光度值。

1.7 油脂降解菌在油脂廢水中的發(fā)酵測定

稱取餐廚垃圾濕重2 kg，用2 L水分4次進行反復(fù)沖洗，獲得餐廚垃圾油脂廢水。將油脂廢水均勻取樣100 mL于三角瓶中，設(shè)置空白對照組和處理組，每個處理組重復(fù)3次。對照組不加菌，處理組接入JY34菌液4 mL，于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 d后測定0、3、6 d的油脂降解率。

1.8 數(shù)據(jù)分析

每組處理設(shè)3個平行，采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，采用Origin 2021和MEGA 7.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油脂降解菌的篩選

2.1.1 油脂降解菌初篩

在油脂中性紅固體平板上培養(yǎng)3 d后菌落明顯變紅的菌株共10株，表明這10株菌具有油脂降解功能，依次編號為1～10。隨后將這10株菌再經(jīng)過三丁酸甘油酯平板驗證后，結(jié)果表明生長較好且水解圈較大的有5株菌，分別是編號為2、5、6、7、9的菌株(表1)。

表1 十株解油菌在三丁酸甘油酯平板上的水解及生長能力Table 1 Hydrolysis and growth ability of ten oil-degrading bacteria on glycerol tributyrate plate

2.1.2 大豆油標準曲線的繪制

通過測定得到大豆油溶液的標準曲線為y=2.193 2x-0.500 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，表明0～4.0 mg/mL范圍內(nèi)油脂質(zhì)量濃度與OD225呈良好的線性相關(guān)性，利用該方法可以準確地測定油脂質(zhì)量濃度。

2.1.3 油脂降解菌復(fù)篩

對初篩的5株菌進行了大豆油無機鹽培養(yǎng)基發(fā)酵，結(jié)果表明編號為5、6、7的菌株OD600達到1.3以上，油脂降解率達到了60%以上；其中7號菌株油脂降解效果最好，降解率為92.6%(圖1)，命名為JY34。該菌分離于餐廚垃圾處理點的油污樣品中，表明菌株JY34對油脂有較好的環(huán)境適應(yīng)性。

圖1 五株初篩菌的油脂降解率及OD600值Fig.1 Lipid degradation rate and growth OD600 of five bacterial strains obtained by preliminary screening

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌落與細胞形態(tài)

JY34的菌落呈圓形、邊緣平整、中心凸起，表面濕潤、光滑，前期為白色，2 d后逐漸變黃，最后呈亮黃色、不透明，黏濕、易挑起；通過結(jié)晶紫簡單染色后在100×光學(xué)顯微鏡下呈短桿狀細胞(圖2)。

a-菌落形態(tài) b-細胞形態(tài)圖2 解油菌JY34的菌落及細胞形態(tài)Fig.2 Colony and cell morphology of lipid-degrading bacteria JY34

2.2.2 16S rDNA序列鑒定

將菌株的16S rDNA的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得單一DNA條帶，分子質(zhì)量在1 400～2 000 bp，如圖3-a所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后得出該16S rDNA的長度為1 429 bp。將該序列上傳至GenBank后用BLAST進行檢索比對，篩選出相似性較高的16S rDNA序列后用MEGA 7.0進行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列的系統(tǒng)發(fā)生分析選擇Neighbor-Joining法，可靠性檢驗采用Bootstrap法進行1 000次重復(fù)。結(jié)果表明，與目標菌株進化關(guān)系最近的菌種為酯香微桿菌(Microbacteriumesteraromaticum)，兩者一致性高達98.73%。

a-16S rDNA擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖；b-系統(tǒng)發(fā)育樹圖3 解油菌JY34的16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物 電泳及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16S rDNA gel electrophoretic map and phylogenetic tree of lipid-degrading bacteria JY34

2.3 不同發(fā)酵條件對菌株JY34油脂降解率的影響

2.3.1 發(fā)酵溫度對油脂降解率的影響

由圖4可知，在20～30 ℃時，隨溫度升高油脂降解率從48.39%提高至68.92%；在30～60 ℃，隨溫度的升高油脂降解率大幅降低，從68.92%降至1.97%。這是因為菌株JY34是中溫細菌，其生長的最適溫度在30 ℃左右且不耐高溫，所以在40 ℃時其解油能力相較于在30 ℃時降低了40.82%。當(dāng)溫度升至50～60 ℃時，菌株細胞膜上的蛋白質(zhì)不耐高溫而逐漸失活，幾乎難以存活，故解油能力差。非寒冷季節(jié)，餐廚垃圾油脂廢水水溫約為20～30 ℃，而菌株JY34在20 ℃時油脂降解率能達到48.39%，說明該菌株在常溫條件下的適應(yīng)能力較好。

圖4 菌株JY34在不同溫度條件下的油脂降解率Fig.4 Lipid degradation rate of strain JY34 under different temperatures

2.3.2 pH對油脂降解率的影響

為考察菌株JY34對油脂廢水pH的適應(yīng)能力，研究了不同pH條件下JY34的油脂降解能力。圖5表明，pH從5.0升高至7.0時，油脂降解率從17.58%提高至58.53%；當(dāng)pH從7.0升高至9.0時，油脂降解率從58.53%降至36.68%。這說明菌株JY34在近中性及中性條件時代謝活性高，解油能力較強。

圖5 菌株JY34在不同pH條件下的油脂降解率Fig.5 Lipid degradation rate of strain JY34 under different pH conditions

餐廚垃圾過濾、清洗后制造的油脂廢水的pH值在6.0～7.0，而一般的解油細菌通常在堿性條件下才能較好地發(fā)揮解油功能[13]，故對于餐廚垃圾油脂廢水處理適用性不強。而菌株JY34在pH 6.0～7.0左右時降解率高達50%～73.76%，故該菌株能夠較好地降解餐廚垃圾處理廢水中的油脂。此外，在pH 5.0時，降解率達到17.58%，在pH 8.0～9.0時，降解率達36.68%～49.70%，說明該菌株耐堿能力較強，也能較好地用于堿性油脂廢水的處理。

2.3.3 接種量對油脂降解率的影響

接種量大小是影響菌種發(fā)酵密度的關(guān)鍵因素，接種量太大容易使菌體密度過高，導(dǎo)致發(fā)酵供氧不足，影響細胞生長，進而導(dǎo)致解油能力下降；接種量太小，培養(yǎng)時間延長，短時間內(nèi)產(chǎn)酶量下降，油脂降解率大幅降低。為了考察菌株JY34用于油脂廢水處理中合適的接種量，研究了以不同接種量接入大豆油無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基對油脂降解率的影響。圖6表明，菌株JY34接種量從1.0%提高至2.0%時，油脂降解率從3.73%提高到了67.59%；當(dāng)接種量從2.0%提高至3.0%時，油脂降解率均降低。這說明，當(dāng)接種量<2.0%時，菌體細胞數(shù)太少，不足以克服含油環(huán)境，降解效果差。相較于1.0%和1.5%的接種量，接入2.0%處理油脂降解率分別提高了63.86%、53.55%。當(dāng)接種量>2.0%時，油脂降解率減小，說明接入菌體過多，影響了細胞對O2的攝取，導(dǎo)致細胞代謝活性差。而接種量為2.5%和3.0%的處理相較于1.0%和1.5%的處理，其油脂降解率均大幅提高，這表明接種量不宜低于2%，以避免菌株JY34難以達到適宜的細胞密度來發(fā)揮解油能力。

圖6 菌株JY34在不同接種量條件下的油脂降解率Fig.6 Lipid degradation rate of strain JY34 under different inoculation conditions

2.3.4 含油量對油脂降解率的影響

含油量大小是影響菌株發(fā)酵降解油脂的重要因素，油脂含量過大，會降低溶氧量，導(dǎo)致菌體細胞攝氧不足；油脂含量較小時，有利于油脂被降解完全。為了考察菌株JY34在不同油脂含量廢水處理中的降解能力，研究了不同含油量的大豆油無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基對油脂降解率的影響。圖7表明，菌株JY34能夠較好地處理油脂含量為1%～1.5%的油脂廢水。當(dāng)油脂添加量從1.0%提高至3.0%時，油脂降解率從98.78%不斷降低至21.44%；這是因為隨著含油量的增加，溶氧量越來越少，阻礙細胞代謝，不能正常分泌脂肪酶，導(dǎo)致解油能力弱。在實際應(yīng)用中，餐廚垃圾的脫油、脫鹽都將使用大量水，降低了油脂的相對濃度，故菌株JY34在餐廚垃圾油脂廢水中的降解能力會相對增強。此外，菌株JY34還可以應(yīng)用于餐廚垃圾好氧堆肥過程中。在餐廚堆肥中接入具有油脂降解能力的微生物菌種，能促進堆肥過程中有機物質(zhì)的降解[14]；并且堆肥初期堆體溫度通常較低、pH值近中性，非常適合菌株JY34生長代謝[15]。

圖7 菌株JY34在不同含油量條件下的油脂降解率Fig.7 Lipid degradation rate of strain JY34 under different oil content

2.4 菌株JY34產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵結(jié)果

2.4.1 脂肪酶酶活力標準曲線繪制

通過測定得到脂肪酶活力標準曲線為y=132.86x-8.537 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6，表明p-NP標準溶液與吸光度呈良好的線性相關(guān)性，利用該方法可以準確地測定脂肪酶酶活力。

2.4.2 脂肪酶酶活力大小

如圖8所示，菌株JY34發(fā)酵后的粗酶液在30、37、50 ℃下的酶活力分別為67.4、104.1、159.5 U/L，其中溫發(fā)酵后粗酶液的酶活力較低。

圖8 菌株JY34在不同溫度條件下的酶活力Fig.8 Enzyme activity of strain JY34 at different temperature

天然分離的野生菌種的脂肪酶活力經(jīng)優(yōu)化后相對較高，劉小玉等[16]分離的蠟狀芽孢桿菌的酶活力為3.35 U/mL，辛國芹[17]分離的解脂耶氏酵母的酶活力為4.8 U/mL，程爽等[18]分離的沙雷氏菌的酶活力為2.39 U/mL。此外，結(jié)果顯示JY34菌株的脂肪酶耐受溫度較廣；在30～50 ℃時，隨溫度的提高，脂肪酶活力不斷增加(圖8)。這表明菌株JY34雖是中溫菌，卻能產(chǎn)耐高溫脂肪酶，且酶活力在高溫時更大。利用這一點，可以達到中低溫發(fā)酵，高溫有效降解的效果。

2.5 菌株JY34在餐廚垃圾油脂廢水中的處理效果

餐廚垃圾油脂廢水的初始油脂含量為5.07%，pH值為6.55，電導(dǎo)率為2.33 mS/cm；將菌株JY34接入后發(fā)酵處理6 d，空白對照組在3 d、6 d的降解率分別為11.6%和44.62%，而處理組為47.49%和72.92%，分別是對照組的4.1倍和1.63倍(圖9)，差異顯著(P<0.05)。但是，發(fā)酵6 d后油脂降解率才達到70%以上，說明菌株活性不夠高。這可能是因為餐廚垃圾在過濾、清洗時用水較少，造成油脂濃度較高及廢水中含鹽量較高。過高的油濃度不利于細胞充分攝入O2，而過高的含鹽量會使微生物細胞由于外界滲透壓過高導(dǎo)致細胞脫水死亡。因此，將耐鹽能力納入篩選指標是必要的。

圖9 菌株JY34在餐廚油脂廢水中的油脂降解率Fig.9 Lipids degradation rate of strain JY34 in food wastewater containing lipids

3 結(jié)論與討論

將不同來源的樣品進行初篩和復(fù)篩后得到1株高效油脂降解菌JY34，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為Microbacteriumesteraromaticum。對菌株JY34油脂降解能力的考察結(jié)果表明，菌株JY34在30 ℃、pH 7.0，接種量2%，油脂含量1%時，油脂降解率高達98.78%。該菌為中溫菌，能在20～30 ℃下高效降解油脂廢水。其脂肪酶粗酶液在30、37、50 ℃反應(yīng)條件下的酶活力分別達到67.4、104.1、159.5 U/L，在高溫反應(yīng)時具有較大酶活力。

在餐廚垃圾油脂廢水的實際處理中，接入菌株JY34的處理在3 d、6 d的油脂降解率分別為47.49%和72.92%，是對照組的4.1倍和1.63倍；說明菌株JY34在餐廚垃圾油脂廢水中適應(yīng)性較好，解油能力較強。但發(fā)酵6 d后的油脂降解率才達到72.92%，說明菌株的生長代謝能力受到了一定抑制，可能是油脂廢水中的高濃度鹽離子和油脂等引起的。因而，在這類降解菌的篩選中，應(yīng)該將耐鹽能力納入篩選范圍，并進一步提高油脂濃度加以馴化，以獲得高耐受性菌株。