植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠腸道菌群及抗氧化抗炎能力的研究

胡夢(mèng)瑩，徐浩原，韓金鵬，張連中，牛策，王志斌

1(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京，100029)2(北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院，北京，100023) 3(北京鴻測(cè)科技發(fā)展有限公司，北京，100176)

腸道菌群絕大多數(shù)屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)[1]，其中擬桿菌門主要包括擬桿菌屬﹑普氏菌屬和木桿菌屬，厚壁菌門主要包括梭狀芽孢桿菌屬﹑乳桿菌屬和瘤胃球菌屬以及產(chǎn)丁酸鹽的Eubacterium、Fecalibacterium和Roseburia[2]。

腸道菌群與免疫系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)，在維持宿主的健康中發(fā)揮著重要作用。腸道菌群(擬桿菌屬、乳桿菌屬等)可以誘導(dǎo)抗菌肽、免疫球蛋白A的表達(dá)，從而防御病原體[3]。腸道菌群也可以通過激活自身表位進(jìn)而驅(qū)動(dòng)Th1、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+、CD25+、Foxp3+)分化、B細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)無害抗原的耐受，參與宿主的免疫應(yīng)答和組織修復(fù)[4]。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物還可以與免疫系統(tǒng)相互作用，傳遞促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟和免疫功能正常發(fā)育的神經(jīng)信號(hào)[5]，還可以通過抑制組蛋白去乙?；?，并激活GPR41、GPR43、TLR4-TRIF信號(hào)通路以促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子lα(hypoxia inducible factor 1α，HIF1α)及芳香經(jīng)受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)、干擾素刺激基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子白介素(IL-6、IL-22、IL-18等)的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)腸道巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)病原體清除，維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和阻止自身免疫疾病的發(fā)展[6-7]。

腸道菌群的組成、結(jié)構(gòu)或分布等發(fā)生變化時(shí)，就會(huì)打亂宿主體內(nèi)平衡，影響宿主代謝，從而導(dǎo)致疾病。但是這種平衡狀態(tài)極易受外界環(huán)境和宿主自身因素的影響。目前，科學(xué)領(lǐng)域中最為認(rèn)可的、能夠快速且有效調(diào)節(jié)腸道菌群、修復(fù)腸道微生態(tài)的主要途徑為補(bǔ)充益生菌[8]。適當(dāng)劑量益生菌可協(xié)助恢復(fù)腸道屏障的完整性，并引起腸道微生物群結(jié)構(gòu)和功能的有利變化[9]。目前，研究較多的益生菌主要包括乳桿菌和雙歧桿菌屬。植物乳桿菌為乳桿菌屬，圓端直桿菌，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀，革蘭氏陽(yáng)性，無芽孢，兼性厭氧，通常最適溫度為30 ℃～35 ℃(T/CSWSL 005—2018 《飼料添加劑 植物乳桿菌》)，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)P-8是一株2005年從內(nèi)蒙古巴彥淖爾草原牧民家庭中自然發(fā)酵酸牛乳中分離獲得的菌株[10]，有很強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)酸性環(huán)境和膽鹽有良好的耐受力，在pH 2.5的人工胃液中處理3 h后存活率達(dá)90.16%，在pH 8.0的人工腸液中處理24 h，活菌數(shù)不受影響[11]。植物乳桿菌P-8可以通過其表面蛋白黏附定植于人體腸道中，定植時(shí)間超過4個(gè)月[12]。定植于腸道后，一方面與有害菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另一方面代謝產(chǎn)生多種具有抑制有害菌功能的物質(zhì)(乳酸﹑細(xì)菌素和雙乙酰等)，從而抑制病原菌在腸道的定植，進(jìn)而改善腸道微生物菌群的平衡[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加植物乳桿菌P-8可顯著提高肉雞42日齡腸道中總細(xì)菌、乳桿菌屬、鏈球菌屬、梭桿菌亞種和雙歧桿菌屬等有益菌的數(shù)量，同時(shí)極大降低埃希氏菌屬、脫硫弧菌屬和彎曲桿菌屬等潛在致病菌的數(shù)量[14]。

目前，植物乳桿菌P-8因其能夠在腸道中長(zhǎng)期穩(wěn)定的定植并發(fā)揮益生功能，在家禽生產(chǎn)應(yīng)用上得到廣泛研究。其在人用產(chǎn)品生產(chǎn)應(yīng)用上的研究主要集中在對(duì)腸道菌群的影響及改善抑郁癥狀，對(duì)于植物乳桿菌P-8是否具有抗氧化和抗炎功能尚未報(bào)道。本研究采用植物乳桿菌P-8灌胃健康小鼠，考察其對(duì)小鼠腸道菌群的影響，同時(shí)研究其對(duì)小鼠的抗氧化能力和抗炎反應(yīng)，以期為揭示植物乳桿菌P-8的益生、保健功能及相關(guān)益生菌制劑的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠52只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2017—0038。所有小鼠飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)室溫度為(20±2) ℃，相對(duì)濕度為45%～60%。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施方案通過了北京聯(lián)合大學(xué)倫理委員會(huì)審核和批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)意見書編號(hào)2021—6)。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)P-8，北京科拓恒通生物技術(shù)股份有限公司；谷胱甘肽(glutathione, GSH)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；伊紅美藍(lán)瓊脂(eosin-methylene blue, EMB)培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基(疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂)、雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基(BBL)、乳桿菌選擇性培養(yǎng)基(LBS瓊脂)、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LB943酶標(biāo)儀，Bert hold Technologles；JA2003電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TGL-16M離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器款開發(fā)有限公司；WH-1漩渦混合器，常州市凱航儀器有限公司；SMART-N超純水機(jī)，上?？道追治鰞x器有限公司；UV—1800紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；WDX4000熒光儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及分組處理

將52只Balb/c雄性鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組13只，低、中、高劑量組每天分別按照2.5×107、5×107、1.5×108CFU/kg劑量灌胃植物乳桿菌P-8，空白組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠自由攝食和飲水。灌胃期間每天監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量和攝食情況并記錄。

1.3.2 小鼠糞便細(xì)菌計(jì)數(shù)

分別在灌胃的第0天和第30天，無菌操作取小鼠糞便0.1 g，加稀釋液后振蕩混勻，按照10倍梯度稀釋至10-8，分別用EMB培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基、LBS瓊脂培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基和胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中，厭氧或有氧條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)和生化反應(yīng)等，對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)并鑒定，計(jì)算糞便中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的活菌數(shù)(lg CFU/g)。

1.3.3 小鼠糞便的16S rDNA高通量測(cè)序分析

在灌胃植物乳桿菌P-8的30 d后，采集各組小鼠的新鮮糞便作為樣品，對(duì)小鼠糞便樣品進(jìn)行DNA提取和檢測(cè)，利用引物515F和806R對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物，構(gòu)建小片段文庫(kù)，基于Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，利用QIIME對(duì)97%的相似水平下聚類而成的操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析和物種注釋分析，樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，獲得物種豐度及多樣性等數(shù)據(jù)。

1.3.4 臟器系數(shù)和腸道長(zhǎng)度測(cè)定

灌胃30 d后，將小鼠脫頸處死解剖，之后取出心、肝、脾、肺、腎等臟器稱質(zhì)量，再根據(jù)小鼠的體質(zhì)量，按公式(1)計(jì)算臟器系數(shù)。測(cè)量小腸質(zhì)量及長(zhǎng)度，比較各組小鼠小腸質(zhì)量和長(zhǎng)度的變化。

臟器系數(shù)/%=臟器平均質(zhì)量(g)/平均體質(zhì)量(g)×100

(1)

1.3.5 抗氧化水平測(cè)定

小鼠解剖后取出小腸、肝臟組織，利用試劑盒測(cè)定小腸、肝臟組織中T-SOD、MDA、GSH及GSH-Px含量。

1.3.6 炎癥因子水平測(cè)定

小鼠剪眼球取血后離心，取血清，利用酶標(biāo)儀和ELISA試劑盒測(cè)定IL-1β、IL-6的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析，采用單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。小鼠糞便細(xì)菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組自身前后比較采用成對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠體質(zhì)量、攝食的影響

如圖1所示，實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程中，各組小鼠的體質(zhì)量緩慢增加，且各組差異不顯著(P>0.05)，組間攝食、飲水量無顯著性差異(P>0.05)，表明植物乳桿菌P-8干預(yù)對(duì)健康小鼠體質(zhì)量及攝食無影響。

2.2 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響是評(píng)價(jià)益生菌安全性的重要指標(biāo)，其中臟器系數(shù)可反映動(dòng)物內(nèi)臟的功能狀態(tài)，一般選用肝、腎、腦、肺、脾、心等主要臟器進(jìn)行試驗(yàn)。正常時(shí)各臟器與體質(zhì)量的比值相對(duì)恒定。當(dāng)出現(xiàn)感染等異?，F(xiàn)象時(shí)，受損臟器質(zhì)量會(huì)發(fā)生改變。由表1可知，空白組及低、中、高劑量組小鼠各臟器系數(shù)不存在顯著性差異(P>0.05)。一般來說，臟器系數(shù)增大，表示臟器水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[15]。本研究中并未觀察到相關(guān)現(xiàn)象，表明灌胃植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠臟器無不良影響。

表1 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響(n=13)Table 1 Effect of L.plantarum P-8 on organ coefficient of mice(n=13)

2.3 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠小腸長(zhǎng)度和質(zhì)量的影響

對(duì)小鼠的小腸長(zhǎng)度和質(zhì)量進(jìn)行了測(cè)定，該指標(biāo)反映了小鼠對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，與機(jī)體的健康狀況相關(guān)。如圖2所示各組間的小腸長(zhǎng)度和質(zhì)量無顯著差異。表明灌胃植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠小腸沒有產(chǎn)生影響。

a-小腸質(zhì)量；b-小腸長(zhǎng)度圖2 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠小腸質(zhì)量和 長(zhǎng)度的影響(n=13)Fig.2 Effect of L.plantarum P-8 on small intestinal in mice(n=13)

2.4 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠抗氧化能力和抗炎反應(yīng)的影響

2.4.1 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠小腸、肝臟組織抗氧化能力的影響

SOD、GSH、GSH-Px、MDA是反映機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝的主要指標(biāo)，其中SOD、GSH、GSH-Px可有效地清除氧自由基，從而阻止脂質(zhì)過氧化。MDA含量與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度呈正相關(guān)，間接地反映細(xì)胞受損程度[16]。對(duì)各組小鼠小腸及肝臟組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。

表2 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠小腸組織T-SOD、 MDA、GSH和GSH-Px的影響(n=13)Table 2 Effect of L.plantarum P-8 on T-SOD, MDA, GSH and GSH-Px level in small intestine of mice (n=13)

在小腸組織中，與空白組小鼠相比，高劑量組小鼠的GSH水平及GSH-Px、T-SOD活力顯著升高(P<0.05)；MDA水平顯著降低(P<0.05)。在肝臟組織中，與空白組小鼠相比，高劑量組小鼠的GSH水平及GSH-Px、T-SOD活力顯著升高(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.05)，中劑量組GSH-Px活力顯著升高(P<0.05)，說明植物乳桿菌P-8能夠提高小鼠小腸和肝臟的抗氧化能力，加強(qiáng)小鼠小腸、肝臟內(nèi)的氧化防御系統(tǒng)功能，幫助機(jī)體抵御氧化應(yīng)激。

2.4.2 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠抗炎癥反應(yīng)的影響

IL-1β等促炎因子和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，當(dāng)感染或某些其他疾病出現(xiàn)時(shí)，IL-1β能快速被誘導(dǎo)升高，啟動(dòng)免疫功能，引起機(jī)體正常組織受損[17]。IL-1β的升高可以通過刺激炎癥產(chǎn)生，影響內(nèi)臟敏感性，引起腸易激綜合征[18]。研究表明，在許多癌癥中IL-6的表達(dá)會(huì)升高，如皮膚癌、乳腺癌、肺癌等[19]。對(duì)各組小鼠血清中IL-1β和IL-6水平進(jìn)行分析，如圖3所示，與空白組相比，高劑量組血清中IL-1β、IL-6顯著降低(P<0.05)，說明植物乳桿菌P-8能夠有效降低小鼠機(jī)體中的炎癥因子水平，低水平的IL-1β、IL-6 可提高細(xì)胞免疫反應(yīng)、激活機(jī)體防御功能[20]。

a-IL-1β;b-IL-6圖3 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠IL-1β和 IL-6的影響(n=13)Fig.3 Effect of IL-2, TNF-α, IL-1β and IL-6 in small intestine of mice by L.plantarum P-8(n=13)

2.5 益生菌對(duì)小鼠腸道微生物的影響

2.5.1 植物乳桿菌P-8對(duì)常見腸道微生物的影響

由表3可見，灌胃受試物前，空白組及低中高各劑量組的腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落總數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，灌胃30 d后，空白組和低、中劑量組各類微生物數(shù)量與灌胃前相比無顯著性差異，而高劑量組與灌胃前相比乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

表3 植物乳桿菌P-8對(duì)小鼠腸道菌群的影響(n=13) 單位：lg CFU/g

2.5.2 植物乳桿菌P-8對(duì)腸道微生物多樣性的影響

從門水平上(圖4-a)分析物種組成發(fā)現(xiàn)，各組主要以擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為主，空白組中擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門分別占61.76%、27.83%、0.82%，占總序列數(shù)的90.42%。與空白組相比，高劑量組中擬桿菌門的豐度下降至44.12%；厚壁菌門和變形菌門的豐度分別上升至45.00%、2.43%。

從屬水平上(圖4-b)分析物種組成發(fā)現(xiàn)，以擬桿菌屬(Bacteroides)、Lachnospiraceae_NK4A136_group屬、理研菌屬(Alistipes)和乳桿菌屬(Lactobacillus)為主。

對(duì)各組進(jìn)行差異物種分析(圖5)，在屬水平上，與空白對(duì)照相比，低劑量組Lactobacillus的豐度顯著增加(P<0.05)，中高劑量組Lactobacillus的豐度極顯著上升(P<0.01)；高劑量組Odoribacter的豐度極顯著增加(P<0.01)，Muribaculum、芽孢桿菌屬(Bacillus)的豐度顯著降低(P<0.05)。

圖4 各組小鼠腸道菌群門水平(a)及屬 水平(b)的物種豐度圖Fig.4 Species abundance at phylum(a) and genus(b) level of intestinal microflora of mice in each group

圖5 物種相對(duì)豐度聚類熱圖Fig.5 Species abundance from clustering heatmap注：Control-空白組；L-低劑量組；M-中劑量組；H-高劑量組

Lactobacillus具有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)能量代謝、抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群、降血糖和降血脂等生理活性，其豐度是人體健康的重要指征[21-23]。Lactobacillus在生長(zhǎng)代謝過程中，會(huì)產(chǎn)生乳酸、醋酸、甲酸、丁酸等代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物能夠降低體系的pH值，抑制其它一些不耐酸的雜菌的生長(zhǎng)[24]，這是大部分乳酸菌的抑菌機(jī)制。Odoribacter是人體腸道微生物中常見的一種產(chǎn)生短鏈脂肪酸的微生物，其豐度與非酒精性脂肪肝、囊性纖維化和炎癥性腸病等疾病的發(fā)生負(fù)相關(guān)，是一種與宿主相互作用的有益共生菌[25]。上述結(jié)果表明，植物乳桿菌P-8能在一定程度上調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群組成，增加Lactobacillus、Odoribacter等菌屬豐度。

3 結(jié)論

本研究探究了植物乳桿菌P-8對(duì)健康小鼠腸道菌群、抗氧化能力及炎癥水平的影響。結(jié)果表明植物乳桿菌P-8可以有效增加小鼠的小腸和肝臟組織中GSH水平及T-SOD、GSH-Px活力，降低MDA水平，降低炎癥因子IL-1β、IL-6水平，促進(jìn)雙歧桿菌、乳桿菌類有益菌的生長(zhǎng)。植物乳桿菌P-8在調(diào)節(jié)腸道微生物組成及抗炎抗氧化方面表現(xiàn)出較好的效果，研究結(jié)果為揭示植物乳桿菌P-8的益生、保健功能及相關(guān)益生菌制劑的開發(fā)利用提供依據(jù)。