基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)鑒定人參皂苷Rg3抗卵巢癌的分子靶點(diǎn)研究

崔 熙,張小玲,李 旭,趙 靜,趙 樂

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061；3.西安大興醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710002；4.西安市人民醫(yī)院/西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710004)

卵巢癌的死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1]。卵巢癌的危險因素包括高脂飲食、肥胖、終生未育、子宮內(nèi)膜異位癥、遺傳因素等[2-4]。卵巢癌的治療方法主要為手術(shù)輔以化療及維持治療[5]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，卵巢癌的治療方案中也引入了靶向治療藥物，但患者的5年生存率未有顯著改善[6-7]。開發(fā)新的卵巢癌治療藥物是改善卵巢癌患者預(yù)后的一個有效途徑。

中草藥是中華民族幾千年智慧的結(jié)晶，越來越多的臨床實(shí)例證實(shí)中草藥在保健益壽方面發(fā)揮著重要作用，其中人參自古以來就被用作許多疾病的營養(yǎng)強(qiáng)化劑和治療藥物。人參皂苷Rg3是提取自人參的活性單體，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制皮膚瘢痕增生和血管生成等特性[8-13]。體內(nèi)外實(shí)驗結(jié)果表明，人參皂苷Rg3能抑制卵巢癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14-20]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)借助于生物信息學(xué)、分子生物學(xué)主要數(shù)據(jù)庫信息，綜合考慮機(jī)體內(nèi)靶標(biāo)分子、生物效應(yīng)分子的多種相互作用關(guān)系，通過與疾病相關(guān)的基因進(jìn)行聯(lián)合分析，構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，從而促進(jìn)新靶向藥物的研發(fā)，提高靶向藥物篩選的成功率[21-22]。為探索人參皂苷Rg3抑制卵巢癌的作用機(jī)理，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法鑒定人參皂苷Rg3的分子靶點(diǎn)，以便為卵巢癌的臨床治療提供實(shí)驗依據(jù)。

1 研究資料與方法

1.1 研究資料

1.1.1 確定人參皂苷Rg3的作用靶點(diǎn)

借助整合了化學(xué)物質(zhì)、基因、功能表型和疾病之間相互作用的比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)(http://ctd.mdibl.org)，檢索識別人參皂苷Rg3的潛在靶點(diǎn)。

1.1.2 篩選卵巢癌的靶點(diǎn)分子

對卵巢癌的靶點(diǎn)通過藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database，TTD)(http://db.idrblab.org/ttd/)和基因卡(GeneCards)網(wǎng)站(https://www.genecards.org/)輸入關(guān)鍵詞“ovarian cancer”進(jìn)行篩查，整合信息、去除重復(fù)項，得到卵巢癌的靶點(diǎn)。

1.1.3 構(gòu)建人參皂苷Rg3抗卵巢癌靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

使用在線韋恩圖(Venny 2.1.0)獲取1.1.1和1.1.2中檢索到的靶點(diǎn)交集，將共有靶點(diǎn)輸入STRING蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，于Organism欄中選擇Homo sapiens、限定物種為人源，構(gòu)建靶點(diǎn)的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)一步構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，在輸出欄(Exports)中選擇下載TSV格式文件，然后將文件中的node1、node2、combined score信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理，通過Cytoscape內(nèi)置的“Network Analyzer”對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲得各靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)連接度(Degree值)、節(jié)點(diǎn)緊密度(Closeness值)和節(jié)點(diǎn)介度(Betweenness值)等信息。

1.1.4 人參皂苷Rg3作用于卵巢癌靶點(diǎn)的富集分析和京都基因與基因組百科全書通路分析

首先用R包(3.7.0)將4個共有交集靶點(diǎn)的基因symbol轉(zhuǎn)換為id，然后通過R包(3.7.0)中的Cluster profiler模塊對其進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析。GO富集分析基于超幾何分布檢驗，P<0.05達(dá)到顯著水平，認(rèn)為這群基因在該GO術(shù)語(term)富集。KEGG信號通路富集分析P<0.05說明其富集顯著性強(qiáng)、富集程度高。將所得到的結(jié)果使用R包(3.7.0)進(jìn)行可視化處理。圖片中不同的顏色代表不同P值，從藍(lán)色到紅色表示P值從大到小，富集程度越來越顯著。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL，美國)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系3AO、A2780和SKOV3，培養(yǎng)箱條件設(shè)定為濕度100%、溫度37℃、二氧化碳含量5%。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行藥物處理。

1.2.2 藥物和抗體

20(S)-Rg3購自天士力制藥集團(tuán)股份有限公司(天津)。將20(S)-Rg3以4mg/mL的濃度溶解于二甲亞砜(DMSO)中作為原液，并在-20℃下保存。使用的抗體有：小鼠抗人β-actin單克隆抗體，兔抗人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；HRP-羊抗兔/鼠二抗(Pierce，美國)。

1.2.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗

將對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以(3×105)個細(xì)胞/孔的密度種于6孔板，種板24小時后，一孔加終濃度80μg/mL的20(S)-Rg3作為處理組，另一孔加等濃度DMSO作為陰性對照，處理72小時后用含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法緩沖液(radio-immunoprecipitation assay buffer，RIPA)提取細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸含量測定法(bicinchoninic acid assay，BCA)定量，加入蛋白體積1/4的5×上樣緩沖液，混勻后煮沸變性，按照每孔30μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，0.32A轉(zhuǎn)印90分鐘至硝酸纖維素(NC)膜，10%脫脂奶室溫封閉3小時，抗人EGFR或β-actin抗體4℃過夜孵育，二抗室溫孵育2小時，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影拍照。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3對卵巢癌作用靶點(diǎn)的篩選

利用CTD數(shù)據(jù)庫獲得人參皂苷Rg3的潛在作用靶點(diǎn)65個；以“ovarian cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫中搜尋相應(yīng)靶點(diǎn)，共得到8 412個卵巢癌潛在疾病作用靶點(diǎn)；將人參皂苷Rg3的所有靶點(diǎn)與卵巢癌的所有靶點(diǎn)進(jìn)行比對，通過Venny 2.1.0軟件共獲取4個交集靶點(diǎn)，包括EGFR、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase 1，PARP1]、含桿狀病毒IAP重復(fù)序列蛋白5(Baculoviral IAP repeat containing 5，BIRC5)和凸素1(prominin 1，PROM1)，見圖1。

2.2 人參皂苷Rg3和卵巢癌靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)

人參皂苷Rg3與卵巢癌的共同靶點(diǎn)被認(rèn)為可能是人參皂苷Rg3治療卵巢癌的作用靶點(diǎn)。將其交集分析獲得的4個人參皂苷Rg3抗卵巢癌靶點(diǎn)導(dǎo)入基因/蛋白相互作用檢索搜查工具(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，STRING)在線數(shù)據(jù)庫，分析獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

借助Cytoscape 3.7.1軟件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果，展示了所有靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)連接度(Degree值)、節(jié)點(diǎn)緊密度(Closeness值)和節(jié)點(diǎn)介度(Betweenness值)，EGFR的節(jié)點(diǎn)最大，見圖3。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，則度值越大，因此將EGFR確定為后續(xù)實(shí)驗驗證的靶點(diǎn)。

2.3 人參皂苷Rg3對基因功能及信號通路的影響

為深入了解各交集靶點(diǎn)的生物學(xué)功能，對這些靶點(diǎn)進(jìn)行了GO富集分析與KEGG信號通路富集分析。GO富集分析得到P<0.05的條目共計433個，包括生物過程(biological process，BP)條目357個、細(xì)胞組成(cell composition，CC)條目33個、分子功能(molecular function，MF)條目43個，各類別排名前10位的條目見圖4。這些靶點(diǎn)所涉及的生物過程主要為解剖結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)(anatomical structure homeostasis)、DNA修復(fù)的正向調(diào)控(positive regulation of DNA repair)及對DNA損傷刺激反應(yīng)的正調(diào)控(positive regulation of response to DNA damage stimulus)。這些靶點(diǎn)的細(xì)胞組成主要分布于染色體區(qū)域(chromosomal region)、頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)、細(xì)胞頂端部分(apical part of cell)、核膜(nuclear envelope)等。這些靶點(diǎn)所涉及的分子功能主要有鈣粘蛋白的結(jié)合(cadherin binding)、蛋白ADP-核糖酶活性(protein ADP-ribosylase activity)及半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑參與的細(xì)胞凋亡過程(cysteine-type endopeptidase inhibitor activity involved in apoptotic process)等。

KEGG信號通路富集分析得到P<0.05的通路共計23條，均與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，見圖5。富集的主要通路包括結(jié)直腸癌(colorectal cancer)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、膀胱癌(bladder cancer)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)等。

2.4 20(S)-Rg3下調(diào)卵巢癌細(xì)胞的EGFR表達(dá)情況

為驗證上述分析結(jié)果，采用人參皂苷Rg3的主要成分20(S)-Rg3處理了卵巢癌細(xì)胞3AO、A2780和SKOV3，采用蛋白免疫印跡法檢測20(S)-Rg3對EGFR表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)20(S)-Rg3處理后，3株細(xì)胞的EGFR蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，見圖6。

3 討論

3.1 人參皂苷Rg3介導(dǎo)下卵巢癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)意義

關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要因素。EGFR的突變、擴(kuò)增是推動腫瘤進(jìn)展的重要因素，癌細(xì)胞中EGFR信號通路的激活參與了細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等功能。EGFR過表達(dá)或激活與腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)[23]。有70%以上的卵巢癌患者EGFR通路被激活。EGFR突變或擴(kuò)增也與化療耐藥密切相關(guān)。因此，EGFR被認(rèn)為是晚期卵巢癌治療的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)EGFR下游的信號通路主要包括大鼠肉瘤癌基因/絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶激酶/絲裂原活化蛋白激酶(Ras/Raf/MEK/ERK)和大鼠肉瘤癌基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(Ras/PI3K/AKT/mTOR)通路，以EGFR、Raf和AKT為靶點(diǎn)的藥物已獲準(zhǔn)用于臨床，但多項研究報道，在單用或者聯(lián)合使用的情況下，它們對卵巢癌的治療有效率均較低[24]。

EGFR是本次人參皂苷Rg3網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中富集度最高的靶基因，實(shí)驗初步證實(shí)了人參皂苷Rg3的主要組分20(S)-Rg3處理卵巢癌細(xì)胞的EGFR表達(dá)顯著降低，這為人參皂苷Rg3作用機(jī)制的研究提供了實(shí)驗依據(jù)。

3.2 20(S)-Rg3對卵巢癌臨床治療的潛在應(yīng)用價值

課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3的主要組分20(S)-Rg3通過多種途徑抑制了卵巢癌的細(xì)胞惡性表型。有研究揭示了20(S)-Rg3在卵巢癌細(xì)胞和裸鼠皮下荷瘤模型中均能促使缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α)降解，阻斷缺氧驅(qū)動的癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有效地抑制了卵巢癌的遷移和腹腔內(nèi)擴(kuò)散[14]。有研究從DNA甲基化調(diào)控機(jī)制入手，發(fā)現(xiàn)20(S)-Rg3通過降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的表達(dá)水平而抑制其介導(dǎo)的抑癌基因VHL的啟動子甲基化，使得卵巢癌細(xì)胞中的VHL上調(diào)[25]。20(S)-Rg3還可以通過下調(diào)DNMT3A介導(dǎo)的microRNA啟動子甲基化而促進(jìn)對有氧糖酵解關(guān)鍵酶HK2和PKM2的直接抑制，進(jìn)而拮抗有氧糖酵解，發(fā)揮抑制卵巢癌的作用[17-18]。這些研究結(jié)果證實(shí)了20(S)-Rg3的作用途徑較為豐富，但其抗卵巢癌的直接靶點(diǎn)有待鑒定。

在實(shí)驗證實(shí)20(S)-Rg3具有抗卵巢癌活性的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用直接靶點(diǎn)。通過對藥物與疾病共同作用靶點(diǎn)的交集分析，借助PPI、GO和KEGG等分析工具，篩選獲得靶標(biāo)，并進(jìn)行實(shí)驗驗證，本研究證實(shí)20(S)-Rg3能夠抑制EGFR。

遺憾的是，由于人參皂苷Rg3的生物利用度較低，水溶性和生物膜通透性較差，胃腸道作用不穩(wěn)定，體內(nèi)代謝率高，因此臨床應(yīng)用有限。未來可以通過開發(fā)有效的給藥系統(tǒng)或給藥途徑來提高人參皂苷Rg3的生物利用度，使其快速高效地應(yīng)用于臨床治療，這也為后續(xù)研究提出了更多的要求[26]。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，快速構(gòu)建出人參皂苷Rg3-靶點(diǎn)-卵巢癌的網(wǎng)絡(luò)模型，有利于預(yù)測和分析人參皂苷Rg3對卵巢癌的作用途徑和藥理機(jī)制，為人參皂苷Rg3成為卵巢癌臨床治療候選藥物提供了理論依據(jù)。