組織選擇性雌激素復(fù)合物對子宮平滑肌瘤細(xì)胞增值及凋亡的影響

薛 雪，王曉林，王新穎，呂淑蘭

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710061)

絕經(jīng)的機(jī)制在于卵巢內(nèi)分泌功能衰竭、性激素分泌缺乏、排卵停止，進(jìn)而子宮內(nèi)膜停止增殖、分泌及周期性月經(jīng)來潮，性激素水平的下降可引發(fā)絕經(jīng)相關(guān)癥狀甚至疾病，其嚴(yán)重影響了患者的生活與工作[1]。目前，絕經(jīng)激素治療(menopausal hormone therapy，MHT)是“窗口期”預(yù)防心血管疾病、緩解絕經(jīng)相關(guān)癥狀、防治骨質(zhì)疏松及阿爾茲海默病等最有效的方法[2]。但目前廣泛應(yīng)用的MHT方案尚不完善，在藥物安全性方面仍存爭議，使得受益人群局限。研究發(fā)現(xiàn)MHT中的孕激素可能是諸多副反應(yīng)的主要刺激因素。將孕激素成份替換為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor modulators，SERMs)是MHT的最新策略，雌激素與SERMs所共同組成的組織選擇性雌激素復(fù)合物(tissue selective estrogen complex，TSEC)使藥物在有效的前提下進(jìn)一步提高了安全性[3]。值得注意的是，子宮平滑肌瘤是女性最為常見的生殖系統(tǒng)良性腫瘤，有高達(dá)70%的發(fā)病率[4]，其中48.6%的女性在子宮平滑肌瘤伴隨下進(jìn)入絕經(jīng)期[5]。在子宮平滑肌瘤如此高發(fā)病率的情況下，對其顧慮將影響較多人群的MHT決策。迄今為止，TSEC對子宮平滑肌瘤的影響尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究TSEC對子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖及凋亡能力的影響，探討TSEC作為MHT的新方案，對圍絕經(jīng)期子宮平滑肌瘤患者的安全性和有效性，為TSEC在MHT中的應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

選取2021年6月至8月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院因子宮平滑肌瘤行核除術(shù)患者，對手術(shù)切除的子宮平滑肌瘤組織通過酶消化法進(jìn)行子宮平滑肌瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)。本研究通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021-14)。

1.1 材料和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)所用的F12培養(yǎng)基、胎牛血清均采用Gibco相應(yīng)產(chǎn)品，二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]試劑使用Sigma相應(yīng)產(chǎn)品，抗雌激素受體-α(antiestrogen receptor-α，ER-α)兔抗人、抗雌激素受體-β(antiestrogen receptor-β，ER-β)兔抗人抗體、抗α-肌動(dòng)蛋白(α-Actin)兔抗人、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記二抗及熒光標(biāo)記二抗購自Abcam。

1.2 分組情況

實(shí)驗(yàn)共設(shè)立4個(gè)組：雌孕激素連續(xù)聯(lián)合組(10-7M 17-β雌二醇+3.3×10-8M安宮黃體酮，E+P組)、TSEC組(10-7M 17-β雌二醇+10-9M雷洛昔芬)、單獨(dú)雌激素組(10-7M 17-β雌二醇，E組)及對照組(Control組，無藥物刺激干預(yù))，觀察不同組藥物對子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)完成3次。

1.3 蘇木素-伊紅染色、免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色

取經(jīng)手術(shù)切除的新鮮子宮平滑肌瘤組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水后制蠟塊，連續(xù)切片，制成厚度為5μm的組織玻片，依次經(jīng)過脫蠟、水化處理后進(jìn)行后續(xù)染色：對于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，依次加入伊紅、蘇木素進(jìn)行染色；對于免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色，組織玻片經(jīng)3%H2O2處理、血清封閉孵育，相應(yīng)一抗孵育(抗體稀釋比例為1:100)、洗片、依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂肏RP標(biāo)記/熒光標(biāo)記的二抗孵育，洗片后以二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色及蘇木素細(xì)胞核染色，或經(jīng)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)細(xì)胞核染色，封片后放置于正置顯微鏡或熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照存儲(chǔ)、分析。

1.4 原代培養(yǎng)方法

子宮平滑肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)所使用的組織與免疫組化來源相同，將獲取的標(biāo)本組織塊放置于含100IU/mL雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中浸泡、清洗，使用眼科手術(shù)器械對組織進(jìn)行預(yù)處理，剔除標(biāo)本中的脂肪組織、血凝塊及壞死組織。配置含20μL/mL脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease I，DNase I)的Ⅱ型膠原酶溶液(1mg/mL)，將預(yù)處理后的組織塊放置入該溶液內(nèi)，同時(shí)將組織塊剪碎至1mm3左右，將溶液及組織塊一并置入37℃恒溫箱中消化4h，以稀釋方法終止消化，將溶液倒入70μm篩網(wǎng)過濾，以800r/min離心所獲溶液5min，此時(shí)取離心后沉淀物，加入培養(yǎng)液重新混懸細(xì)胞，并將其接種于5cm培養(yǎng)皿中，置入含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，接種6～8h后觀察細(xì)胞，在觀察到有較多細(xì)胞貼壁現(xiàn)象出現(xiàn)后，隨即進(jìn)行首次細(xì)胞換液，以棄去未貼壁細(xì)胞，隨后按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

收集對數(shù)期生長的細(xì)胞，按(5×10)/孔接種至96孔板內(nèi)，根據(jù)分組情況加入相應(yīng)藥物處理，培養(yǎng)24h、48h，于檢測孔內(nèi)加入50μL MTT溶液(5mg/mL)后，將孔板繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去孔板內(nèi)上清液后，于相應(yīng)檢測孔中加入DMSO溶液(150μL)，將孔板充分搖勻，轉(zhuǎn)運(yùn)至酶聯(lián)免疫檢測儀，用490nm波長檢測相應(yīng)研究孔內(nèi)液體的吸光度值(optical density，OD)。

1.6 細(xì)胞周期分布實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞并使用70%乙醇固定，PBS洗滌，隨后用染色緩沖液洗滌，將1×106個(gè)細(xì)胞重新懸浮在0.5mL的碘化丙啶(含核糖核酸酶，PI/RNase)染色緩沖液中，并將細(xì)胞在室溫下避光孵育15min。使用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(BD biosciences)分析細(xì)胞周期的分布。

1.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

使用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ檢測試劑盒(BD biosciences)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，向每個(gè)樣品中加入5μL PE-Annexin V溶液和5μL 7-氨基放線菌素D(7-AAD)溶液，將細(xì)胞在室溫下孵育15min，使用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.8 免疫印跡法實(shí)驗(yàn)

收集不同分組的細(xì)胞，使用放射免疫沉淀法裂解緩沖液(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)離心提取蛋白，經(jīng)制膠、相應(yīng)細(xì)胞提取蛋白上樣、電泳、濕式轉(zhuǎn)膜，加入需檢測蛋白的相應(yīng)一抗，4℃孵育12h，清洗后加入相應(yīng)二抗孵育，清洗后發(fā)光拍照、儲(chǔ)存結(jié)果，測量PCNA/β-Actin、Bcl-2/β-Actin相對蛋白表達(dá)量。α-Actin為平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物之一；β-Actin為人體細(xì)胞內(nèi)恒定表達(dá)的一種蛋白，其表達(dá)量在細(xì)胞中穩(wěn)定，因此免疫印跡法實(shí)驗(yàn)是檢測目標(biāo)蛋白與β-Actin的比值來確定目標(biāo)蛋白的變化趨勢。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮平滑肌瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

獲取手術(shù)切除的子宮平滑肌瘤組織，進(jìn)行HE染色及α-Actin染色、ER染色，確定該組織可用于原代培養(yǎng)，見圖1a～圖1c；其中HE染色中蘇木素將細(xì)胞核染色為紫色，伊紅將胞漿染色為紅色，進(jìn)而可以通過觀察細(xì)胞胞漿及細(xì)胞核的形態(tài)來確定細(xì)胞類型，此處HE染色的目的是明確原代培養(yǎng)的組織來源確定為子宮肌瘤組織，而非結(jié)締組織、脂肪或其他組織，見圖1a；免疫組化實(shí)驗(yàn)原理為通過一抗、二抗及DAB染色將目標(biāo)蛋白標(biāo)記，如出現(xiàn)棕色染色，則提示該區(qū)域有目標(biāo)蛋白的表達(dá)；α-Actin、ER均為子宮平滑肌瘤的標(biāo)記蛋白，免疫組化染色結(jié)果證實(shí)提示培養(yǎng)所得細(xì)胞表達(dá)這兩種標(biāo)記蛋白，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)可以證實(shí)原代培養(yǎng)所得細(xì)胞即為子宮平滑肌瘤細(xì)胞，見圖1b。使用酶消化法提取子宮平滑肌瘤原代細(xì)胞，經(jīng)首次換液3d后，可見所提取細(xì)胞已完全伸展，細(xì)胞形態(tài)上呈長梭形，繼續(xù)培養(yǎng)7～8d時(shí)，原代細(xì)胞生長活躍，呈平行排列，大小一致，細(xì)胞胞漿豐富；于光鏡下觀察，可見細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞核清晰，多呈桿狀或類圓形，見圖1d。行細(xì)胞免疫組化染色，α-Actin、ER均為陽性，見圖1e、圖1f。行細(xì)胞免疫熒光檢測，免疫熒光根據(jù)使用的二抗類型不同，陽性結(jié)果可呈現(xiàn)出綠色熒光或紅色熒光，DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色，因此如細(xì)胞內(nèi)可見紅色/綠色熒光，則提示目標(biāo)蛋白在該細(xì)胞中表達(dá)，此處免疫熒光檢測目的為進(jìn)一步證實(shí)原代培養(yǎng)所得細(xì)胞表達(dá)子宮平滑肌瘤細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，可見α-Actin(+)、ER-α(+)及ER-β(+)，與組織染色結(jié)果一致，原代培養(yǎng)成功，見圖1g～圖1i。

2.2 TSEC對子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖的影響

應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測TSEC組、E+P組、E組和對照組的細(xì)胞分別于24h、48h的OD值。在24h時(shí)間點(diǎn)，TSEC組與對照組OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.984，P=0.071)，而E+P組(t=-30.113，P<0.001)、E組(t=-16.148，P<0.001)分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在48h時(shí)間點(diǎn)，TSEC組與對照組OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.997，P=0.069)，而E+P組(t=-23.553，P<0.001)、E組(t=-16.432，P<0.001)分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2a。

常規(guī)培養(yǎng)子宮平滑肌瘤原代細(xì)胞，應(yīng)用免疫印跡法技術(shù)檢測各組細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)水平低于E+P組(1.04±0.03 vs.1.23±0.04，t=-23.267，P<0.001)，對照組同樣低于E組(1.04±0.03 vs.1.15±0.01，t=-13.472，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對照組細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)水平與TSEC組比較(1.04±0.03 vs.1.02±0.05，t=-2.449，P=0.627)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2b。

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測TSEC組、E+P組、E組及對照組的細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，E+P組、E組細(xì)胞G1/S時(shí)相轉(zhuǎn)換減弱，而TSEC組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(E+P組 vs.對照組，t=-17.642，P<0.001；E組 vs.對照組，t=-21.367，P<0.001；TSEC組 vs.對照組，t=-2.039，P=0.097，見圖2c。

表1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 MTT experiment results

2.3 TSEC對子宮平滑肌瘤細(xì)胞凋亡能力的影響

常規(guī)培養(yǎng)子宮平滑肌瘤原代細(xì)胞，使用免疫印跡法技術(shù)檢測各組干預(yù)后細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于E+P組(0.63±0.04 vs.1.17±0.01，t=-66.136，P<0.001)，對照組同樣低于E組(0.63±0.04 vs.1.04±0.02，t=-50.215，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而對照組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平與TSEC組比較(0.63±0.04 vs.0.62±0.01，t=1.225，P=0.289)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3a、圖3b。

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測TSEC組、E+P組、E組及對照組的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，E+P組、E組細(xì)胞凋亡減少，而TSEC組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(E+P組 vs.對照組，t=23.097，P<0.001；E組 vs.對照組，t=20.972，P<0.001；TSEC組 vs.對照組，t=0.202，P=0.850)，見圖3c。

3 討論

3.1 TSEC對子宮平滑肌瘤影響的研究現(xiàn)狀

將SERMs與雌激素配伍，可能對MHT的有效性和安全性都更加有益[6]。婦女健康研究組織(Women′s Health Initiative，WHI)于2011年在MHT指南中提出了TSEC方案，與傳統(tǒng)的由雌孕激素形成的MHT方案相比較，TSEC將孕激素成份替換為SERMs，避免了孕激素可能帶來乳腺癌發(fā)病增高的風(fēng)險(xiǎn)，減輕了治療過程中患者對MHT副作用的恐慌，還保持了雌激素的有益作用，彌補(bǔ)了SERMs類藥物因雌激素撤退而導(dǎo)致的潮熱等副反應(yīng)，提高了機(jī)體耐受性。子宮平滑肌瘤為性激素依賴性腫瘤，長期的雌激素暴露將導(dǎo)致子宮平滑肌瘤體積增加。MHT為外源性添加雌孕激素，因此對患有子宮平滑肌瘤的圍絕經(jīng)期婦女可能存在導(dǎo)致肌瘤體積增長的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，SERMs可通過調(diào)節(jié)子宮平滑肌瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，抑制肌瘤的生長，甚至減小肌瘤的體積[7]。而SERMs與雌激素配伍組成TSEC作為MHT的策略，對圍絕經(jīng)期女性子宮平滑肌瘤的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。

3.2 TSEC對子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖影響的分析

本研究顯示，TSEC組對子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖能力無明顯影響，而E+P組、E組則促進(jìn)了子宮平滑肌瘤細(xì)胞的增殖。TSEC對子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖能力無明顯影響的機(jī)制可能與該用藥方案中SERMs的抗雌激素活性相關(guān)。SERMs存在組織特異性，在骨骼血管系統(tǒng)中表現(xiàn)為雌激素受體激動(dòng)劑，而在子宮、乳房中表現(xiàn)為雌激素受體拮抗劑[8]。作為二代SERMs的雷洛昔芬在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均顯示出對子宮平滑肌瘤細(xì)胞的一致抑制作用[9]，Chung等[10]的體外研究提示，雷洛昔芬顯示出比米非司酮更顯著的肌瘤細(xì)胞活性和增殖抑制能力。而新一代的SERMs，如巴多昔芬[11]、歐派米芬[12]同樣可能對肌瘤細(xì)胞具有拮抗性活動(dòng)，但仍然需要大規(guī)模的隨機(jī)臨床試驗(yàn)來確定其安全性。TSEC方案是在SERMs的基礎(chǔ)上同時(shí)添加雌激素，人類雌激素受體包含α和β兩種不同亞型，分別由兩組獨(dú)立的基因編碼，其中雌激素受體α為高親和力受體，但容量低；相反，雌激素受體β為低親和力、高容量，二者的轉(zhuǎn)錄、激活與抑制分別由不同的信號通路介導(dǎo)。子宮平滑肌瘤的雌激素受體比例失調(diào)是其發(fā)病機(jī)制之一。在子宮平滑肌瘤組織中，ER-α和ER-β的信使RNA(messenger RNA，mRNA)均呈高表達(dá)狀態(tài)，但ER-α的蛋白表達(dá)并未升高，這可能是由于轉(zhuǎn)錄后修飾作用使得ER-α的雌二醇結(jié)合位點(diǎn)缺失，或者ER-α的mRNA錯(cuò)誤翻譯，肌瘤組織中ER-β的表達(dá)升高2～3倍，因此α和β受體基因的差異表達(dá)可能在肌瘤組織的生長中起到了關(guān)鍵作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，SERMs對ER-α的抑制作用較強(qiáng)，而對ER-β只有較弱的抑制作用[13]。TSEC方案中的雌激素可能通過與ER-β相互作用，誘導(dǎo)肌瘤細(xì)胞的生長，從而拮抗了SERMs的抗增殖效應(yīng)。本研究中TSEC組表現(xiàn)出對子宮平滑肌瘤細(xì)胞無明顯促增殖的作用。

本研究中可見E+P組細(xì)胞增殖活躍，其原因除了雌激素促進(jìn)細(xì)胞的生長作用外，孕激素的作用也占有重要地位。子宮平滑肌瘤的生長與孕激素水平密切相關(guān)，其機(jī)制為孕激素具有促進(jìn)肌瘤細(xì)胞的有絲分裂及生長的功能。Moro等[14]的臨床研究表明，應(yīng)用雌激素+孕激素存在導(dǎo)致子宮平滑肌瘤體積增大的風(fēng)險(xiǎn)；本研究結(jié)果與其結(jié)論一致，雌孕激素連續(xù)聯(lián)合對子宮平滑肌瘤有促進(jìn)作用，而據(jù)本研究中TSEC組與對照組的MTT及細(xì)胞周期測定等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TSEC對肌瘤細(xì)胞的增殖無明顯影響，提示TSEC對肌瘤患者可能具有更好的安全性。

3.3 TSEC對子宮平滑肌瘤細(xì)胞凋亡影響的分析

Bcl-2蛋白屬于凋亡抑制基因，相應(yīng)蛋白的表達(dá)增高提示細(xì)胞凋亡能力的減弱[15]。本研究顯示，TSEC組Bcl-2蛋白表達(dá)水平與對照組相比無明顯變化，且TSEC組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于E+P組及E組；提示TSEC組對子宮平滑肌瘤細(xì)胞凋亡能力無明顯抑制作用，這可能同樣與TSEC中SERMs的作用相關(guān)。Jin等[16]的體外實(shí)驗(yàn)表明，SERMs對子宮平滑肌瘤細(xì)胞促凋亡的調(diào)節(jié)作用為濃度依賴性，低濃度的SERMs可抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。本研究中免疫印跡法及凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，E+P組、E組對肌瘤細(xì)胞具有抑制凋亡作用，對子宮平滑肌瘤具有潛在的促進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，TSEC對子宮平滑肌瘤細(xì)胞的增殖及凋亡無明顯影響，TSEC較E+P等MHT方案在對子宮平滑肌瘤細(xì)胞的影響中可能具有更好的安全性。在未來的研究中將通過改變TSEC中兩種藥物的濃度及比例，在安全有效治療絕經(jīng)綜合征的同時(shí)，爭取達(dá)到治療子宮平滑肌瘤的目的。