近紅外光熱轉(zhuǎn)換劑氧缺陷二氧化鉬的制備及其在光熱治療中的應(yīng)用

王曾學(xué) 劉 艷 趙 盼 張訓(xùn)迪 陽一鳴 孫 鵬張秀云 馮 玉 鄭婷婷＊, 陳 辰 李 偉＊,

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355)(2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，濟(jì)南 250355)(3山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院中醫(yī)藥新材料研究院，濟(jì)南 250355)

0 引 言

腫瘤的臨床治療一直是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)，手術(shù)、放療和化療是目前臨床應(yīng)用的主要手段，然而這些傳統(tǒng)的治療方法在殺傷腫瘤組織的同時，對機(jī)體的免疫系統(tǒng)有較大的破壞。光熱治療(PTT)利用對人體組織有較強(qiáng)穿透力的近紅外光，引發(fā)局部高熱破壞腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的，具有高效、微創(chuàng)和毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。目前研究最廣泛的近紅外光熱轉(zhuǎn)換劑包括貴金屬納米材料[1-4]、黑磷[5-7]、碳基納米材料[8-10]、有機(jī)化合物[11]以及半導(dǎo)體納米材料[12-16]。過渡金屬氧化物是半導(dǎo)體光敏劑中的一類代表，由于其具有原料豐富、制備簡單、結(jié)構(gòu)可調(diào)、性能穩(wěn)定的優(yōu)勢，因此成為研究的熱點(diǎn)[17-20]。但大部分過渡金屬氧化物光敏劑對光的響應(yīng)主要集中在可見光區(qū)，在生物應(yīng)用上，穿透能力差，達(dá)到病變部位的光子有限，為實(shí)現(xiàn)PTT對深層組織腫瘤的治療，減小對健康組織的傷害，開發(fā)具有近紅外響應(yīng)的過渡金屬氧化物光敏劑具有深遠(yuǎn)意義。

過渡金屬氧化物二氧化鉬(MoO2)是一種在能帶結(jié)構(gòu)和電子傳導(dǎo)方面具有金屬性的化合物[21-22]，其晶體結(jié)構(gòu)屬于單斜晶系，具有畸變的金紅石型結(jié)構(gòu)[23]。在MoO2晶體中，氧原子緊密堆積成八面體，Mo原子占據(jù)八面體的空隙，但是偏離中心位置，所以導(dǎo)帶中Mo的電子離開原位，表面具有較高的自由電子密度，這使得MoO2具有金屬性，從而表現(xiàn)出一定的局域表面等離子體共振效應(yīng)(LSPR)[24-25]，使其在近紅外區(qū)具有光吸收能力。劉莊等[26-27]在油胺輔助下合成了MoOx超薄納米片，但其穩(wěn)定性較差，生理?xiàng)l件下易被氧化，而且納米材料的油相表面不利于其生物學(xué)應(yīng)用。目前報道的MoO2由于氧空位濃度較低，普遍存在光熱轉(zhuǎn)換率低、易氧化、穩(wěn)定性差等問題[28-32]。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為一種非離子型高分子化合物，具有優(yōu)良的生物相容性，可以吸附在納米顆粒表面，阻止納米顆粒繼續(xù)長大，同時具有一定的還原性，可作為形成MoO2納米顆粒的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑和還原劑。采用一步水熱法合成MoO2納米材料，借助PVP的還原作用獲得具有豐富氧缺陷的MoO2納米材料，借助其LSPR效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)高效的光熱轉(zhuǎn)化性能，并考察納米材料的細(xì)胞毒性和細(xì)胞光熱殺傷性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

PVP購自百靈威試劑公司；五氯化鉬(MoCl5)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(1X PBS)、臺盼藍(lán)染液購自蘭杰柯科技有限公司；胰酶購自賽國生物科技有限公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自賽默飛世爾科技有限公司；Enhanced Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司；人肝癌細(xì)胞CL-0103(Hep G2細(xì)胞)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；人正常肝細(xì)胞(L02細(xì)胞)購自北納生物科技有限公司。

1.2 氧缺陷MoO2(VO-MoO2)的制備

稱取0.94 g PVP加入4 mL去離子水溶解，磁力攪拌30 min獲得溶液A；稱取0.273 g MoCl5，加入6.5 mL去離子水溶解，磁力攪拌30 min獲得溶液B。將溶液A和溶液B混合，磁力攪拌30 min。取適量體積的混合溶液加入含聚四氟乙烯內(nèi)襯的25 mL高壓反應(yīng)釜中，填充度約為50%，置于200℃烘箱中反應(yīng) 12 h，冷卻后取出，20 000 r·min-1離心 10 min，去掉上清液，加去離子水洗滌3次，冷凍干燥，得到VO-MoO2粉末。

1.3 材料表征

采用透射電鏡(TEM，JEM-100CⅫ)觀察樣品的形貌和粒度大小，加速電壓為80 kV，采用能譜(EDS)表征材料的元素組成。采用高分辨透射電鏡(HRTEM，Philips Tecnai 20U-TWIN)觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)和晶體取向，加速電壓為200 kV。采用X射線粉末衍射儀(XRD,Rigaku D/Max 2200PC)表征樣品的物相結(jié)構(gòu)，測試條件：CuKα輻射(λ=0.154 2 nm)，石墨單色器，管電壓40 kV，管電流20 mA，掃描速度10(°)·min-1，掃描范圍 10°～80°。采用激光粒度儀(Brookhaven，ZetaPALS Instruments)測試樣品的粒度分布。采用X射線光電子能譜儀(XPS，Perkin Elmer,PHI-5300 ESCA spectrometer)分析樣品的表面原子狀態(tài)，AlKα作為激發(fā)源，電子結(jié)合能用C1s峰284.6 eV進(jìn)行校正。采用電子順磁共振波譜(EPR，Bruker A 300)考察樣品的氧缺陷情況。

1.4 近紅外光吸收能力測定

將VO-MoO2粉末加入去離子水中分別配制濃度為 0、25、50、100、150 μg·mL-1的 VO-MoO2納米顆粒膠體溶液，用紫外可見近紅外分光光度計(Hitachi，UH4150)對樣品進(jìn)行吸收光譜掃描，并考察VO-MoO2最大吸光度與濃度的關(guān)系。

1.5 光熱性能測定

將VO-MoO2粉末加入去離子水中分別配制成0、10、25、50、100、150 μg·mL-1的納米顆粒膠體溶液，取1 mL納米膠體溶液置于石英比色皿中，利用近紅外激光器(VCL-808nmM1-7W)對納米膠體溶液進(jìn)行照射，激光器波長808 nm，功率為1 W，每20 s記錄膠體溶液的溫度，持續(xù)測量600 s，且每隔1 min用熱成像相機(jī)拍照，用不同濃度下的納米膠體溶液升溫曲線評價材料的光熱轉(zhuǎn)換性能。

另取 1 mL 100 μg·mL-1的 VO-MoO2納米膠體溶液于石英比色皿中，用近紅外激光器對納米膠體溶液進(jìn)行照射，改變激光器照射功率(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 W)，每20 s記錄膠體溶液的溫度，持續(xù)測量600 s，考察不同功率下納米膠體溶液的光熱轉(zhuǎn)換性能。

在功率為1 W的808 nm激光照射下記錄100 μg·mL-1的VO-MoO2納米膠體溶液在600 s內(nèi)的升溫情況。關(guān)閉激光器，VO-MoO2納米膠體溶液自然冷卻，記錄600 s內(nèi)的溫度變化，根據(jù)文獻(xiàn)方法[33]計算VO-MoO2納米材料的光熱轉(zhuǎn)換效率：

式中η為光熱轉(zhuǎn)換效率，h為傳熱系數(shù)，S為石英管的表面積，Tmax為平衡溫度，Tsurr為環(huán)境溫度，Qdis為石英比色皿的熱量散失，I為照射激光功率，A為VO-MoO2納米顆粒懸浮液在808 nm處的吸光度，t為液體冷卻階段時間，mi為VO-MoO2納米顆粒懸浮液的質(zhì)量，Cp為水的比熱容，τs為樣品系統(tǒng)時間常數(shù)，θ為無量綱溫度驅(qū)動力。

1.6 穩(wěn)定性測試

通過升降溫循環(huán)測試考察VO-MoO2的光熱穩(wěn)定性，通過XRD、TEM、EDS、UV-Vis-NIS測試VO-MoO2升降溫循環(huán)前后材料的組成、結(jié)構(gòu)及光吸收能力，進(jìn)一步證明材料的穩(wěn)定性。取1 mL 100 μg·mL-1的VO-MoO2納米膠體溶液于石英比色皿中，用808 nm激光器照射，功率為1 W，每隔20 s記錄溫度，持續(xù)記錄溫度600 s，停止照射，自然降溫，繼續(xù)記錄溫度600 s，以上為一個循環(huán)，重復(fù)上述循環(huán)10次以考察材料的光熱穩(wěn)定性。

1.7 細(xì)胞毒性測試

以含體積分?jǐn)?shù)2%FBS的DMEM為培養(yǎng)基，將肝癌細(xì)胞Hep G2和正常肝細(xì)胞L02分別接種至96孔板中，每孔接種1×104個細(xì)胞，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，加入用培養(yǎng)基稀釋的VO-MoO2，濃度梯度為 0、50、100、200、300、400、500 μg·mL-1，每組5個平行對照孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，PBS洗滌，分別加入100 μL體積分?jǐn)?shù)10%的CCK-8的培養(yǎng)基，恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測吸光度并按照式5進(jìn)行細(xì)胞存活率(R)計算：

其中 ODs、ODc、ODb分別為實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組在450 nm處的光密度。

1.8 癌細(xì)胞光熱殺傷效果測試

通過近紅外光照射后的細(xì)胞存活率分別考察VO-MoO2對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的體外光熱殺傷效果。以含體積分?jǐn)?shù)2%FBS的DMEM為培養(yǎng)基，將肝癌細(xì)胞Hep G2接種至96孔板中，每孔接種1×104個細(xì)胞，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入用培養(yǎng)基稀釋的 VO-MoO2，濃度為 100 μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，取出 96孔板，將與1 mL 100 μg·mL-1VO-MoO2共孵育12 h的Hep G2細(xì)胞置于功率為1 W的808 nm激光下照射2 min，對照組為含1 mL 100 μg·mL-1VO-MoO2+無激光照射，空白組為不含VO-MoO2+無激光照射及不含VO-MoO2+激光照射，激光照射功率同實(shí)驗(yàn)組，操作結(jié)束后將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。因VO-MoO2納米材料本身在450 nm處有一定的吸光度，會對酶標(biāo)儀450 nm處吸光度造成干擾，因此，采用臺盼藍(lán)染色法考察近紅外光對癌細(xì)胞的光熱殺傷效果。加入臺盼藍(lán)，顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色，并使用細(xì)胞計數(shù)板精確計數(shù)，分別計算實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞存活率。

VO-MoO2對正常肝細(xì)胞L02的體外光熱殺傷效果實(shí)驗(yàn)方法同上述肝癌細(xì)胞Hep G2。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的形貌與結(jié)構(gòu)表征

TEM照片顯示水熱制備的VO-MoO2為類球形顆粒，粒度約18 nm，分散性良好，如圖1a所示。圖1b中的HRTEM照片顯示了清晰的晶格條紋，結(jié)合XRD圖分析可知其分別對應(yīng)金紅石型MoO2的(101)和(1ˉ11)晶面，插圖中單個顆粒的衍射斑點(diǎn)清晰可見，說明其為單晶結(jié)構(gòu)。圖1c的XRD圖與標(biāo)準(zhǔn)卡片PDF No.32-0671特征峰一致，表明VO-MoO2為單斜晶系金紅石型結(jié)構(gòu)。與商用MoO2相比，VO-MoO2的衍射峰明顯寬化，說明其為納米級顆粒。從圖1d的粒徑分布可以看出，VO-MoO2納米顆粒的粒徑分布較窄，平均粒徑約為108 nm，由于VO-MoO2納米顆粒表面包裹PVP且采用動態(tài)光散射測出的納米顆粒粒徑為水合半徑，使得激光粒度儀檢測出的粒徑比TEM圖像中的納米顆粒大(由于加速電壓的破壞作用以及襯度較小，包覆在納米顆粒上的PVP在TEM圖中基本不顯示)，平均ζ電位約為21 mV，表明溶膠狀態(tài)較穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多次洗滌VO-MoO2納米顆粒時，納米顆粒會出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，對應(yīng)的動態(tài)光散射平均水合粒徑及膠體溶液光學(xué)照片如圖2所示。由圖可知，離心、洗滌次數(shù)超過3次會顯著降低膠體溶液的穩(wěn)定性，使VO-MoO2顆粒聚集，說明PVP的包覆在一定程度上有利于VO-MoO2膠體溶液的穩(wěn)定。

圖1 VO-MoO2的(a)TEM圖、(b)HRTEM圖(插圖：由HRTEM照片得到的傅里葉變換圖)、(c)XRD圖和(d)水合粒徑分布圖Fig.1 (a)TEM image,(b)HRTEM image(Inset：Fourier transform images obtained from HRTEM),(c)XRD pattern,and(d)hydration particle size distribution pattern of VO-MoO2

圖2 (a)VO-MoO2多次洗滌后的平均粒徑和(b)膠體溶液光學(xué)照片F(xiàn)ig.2 (a)Average particle sizes and(b)optical photographs of solutions of VO-MoO2after multiple washing times

為了證明合成的VO-MoO2含有豐富的氧缺陷，對樣品進(jìn)行了XPS、Raman譜圖以及EPR表征，并與商用MoO2進(jìn)行比較。O1sXPS譜圖中結(jié)合能位于529.2和530.5 eV處的峰分別歸屬于晶格氧和缺陷氧[34]，分峰后發(fā)現(xiàn)VO-MoO2中有更大比例的缺陷氧(圖3a)，而商用MoO2中以晶格氧為主(圖3b)。VO-MoO2的Raman譜圖(圖3c)中出現(xiàn)了明顯的拉曼振動峰，譜圖中 VO-MoO2位于 228、276、329和 367 cm-1處的振動峰分別代表O2—Mo—O2、O1=Mo=O1、O3—Mo—O3和 O2=Mo=O2的彎曲振動，位于656、811和986 cm-1處的振動峰分別對應(yīng)Mo—O2—Mo、Mo—O3—Mo和 Mo=O1的伸縮振動(On表示MoO2晶格中某個位置的氧)，這表明氧缺陷的存在[35]，而商用MoO2沒有明顯的拉曼振動峰。在EPR光譜中，商用MoO2和MoO3幾乎沒有EPR振動峰(圖3d)，而VO-MoO2中強(qiáng)烈的EPR振動峰也證實(shí)了大量氧缺陷的存在[25]。推測其反應(yīng)原理為通過PVP的還原作用和反應(yīng)釜的高溫高壓作用析出MoO2晶粒，借助MoCl5水溶液的酸性條件，H+在反應(yīng)釜高溫高壓環(huán)境中刻蝕MoO2納米顆粒，獲得表面富氧缺陷MoO2納米材料，經(jīng)近紅外光照射，入射的近紅外光能在納米材料表面與氧缺陷引起的高效傳輸?shù)淖杂呻娮诱鹗幉òl(fā)生共振，同時氧缺陷能夠加速M(fèi)oO2光生電子和空穴的分離，使其具有高效電荷轉(zhuǎn)移速率，顯示出增強(qiáng)的LSPR效應(yīng)，表現(xiàn)出對近紅外光的強(qiáng)吸收[36]。

圖3 (a)VO-MoO2和(b)商用MoO2的XPS譜圖;(c)VO-MoO2和商用MoO2的Raman譜圖;(d)VO-MoO2、商用MoO2和商用MoO3的EPR譜圖Fig.3 XPS spectra of(a)VO-MoO2and(b)commercial MoO2;(c)Raman spectra of VO-MoO2and commercial MoO2;(d)EPR spectra of VO-MoO2,commercial MoO2,and commercial MoO3

2.2 近紅外光吸收能力

材料的近紅外吸收能力直接影響其光熱轉(zhuǎn)換效率，對合成的VO-MoO2進(jìn)行UV-Vis-NIR吸收光譜測試，如圖4a所示，VO-MoO2在400～1 100 nm范圍內(nèi)有一巨大的吸收峰，表明材料在可見光至近紅外光區(qū)都具有優(yōu)良的吸光性能，吸收峰峰值位于770 nm，這一峰值屬于近紅外Ⅰ區(qū)，隨濃度的增加，VO-MoO2的可見光和近紅外光吸收能力也依次增加，且最大吸收波長處的吸光度與濃度線性關(guān)系良好(圖4b)。VO-MoO2的近紅外吸收性能使其在作為PTT的光敏劑方面展示出巨大潛力。

圖4 (a)不同濃度VO-MoO2的UV-Vis-NIR譜圖;(b)在770 nm處VO-MoO2濃度與吸光度的線性關(guān)系Fig.4 (a)UV-Vis-NIR spectra of different concentrations of VO-MoO2;(b)Linear relationship between the concentration of VO-MoO2and the absorbance at 770 nm

2.3 光熱轉(zhuǎn)換性能

將VO-MoO2在808 nm激光器下照射10 min，以去離子水為對照，每20 s記錄溫度。圖5a顯示了不同濃度的VO-MoO2的升溫曲線，隨濃度增大，VO-MoO2升溫能力逐漸增強(qiáng)，150 μg·mL-1VO-MoO2經(jīng)照射10 min后溫度升高至57.3℃，升溫達(dá)35.8℃，而去離子水經(jīng)照射10 min后，溫度變化不明顯。改變激光的輻照功率，100 μg·mL-1VO-MoO2溶液最高溫度隨功率增大而升高，功率為1 W時，經(jīng)10 min照射溫度，升高至57.5℃，約升溫31.5℃(圖5b)。一般的PTT，溫度升高至50℃以上便可產(chǎn)生較好的療效，因此選用100 μg·mL-1的 VO-MoO2膠體溶液在808 nm激光下照射10 min進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換效率計算。圖5c為一個升降溫循環(huán)過程，由式2擬合得到t--lnθ關(guān)系圖(圖5d)，由線性關(guān)系得τs=235.3 s，根據(jù)式1、4計算可知VO-MoO2溶液的η達(dá)67.9%。

圖5 (a)不同濃度VO-MoO2的升溫曲線(激光功率1.0 W);(b)不同輻照功率下VO-MoO2的升溫曲線(濃度100 μg·mL-1);(c)VO-MoO2的升降溫曲線(濃度100 μg·mL-1，激光功率 1.0 W);(d)t--ln θ擬合曲線Fig.5 (a)Temperature rise curves of different concentrations of VO-MoO2(laser power of 1.0 W);(b)Temperature rise curves of VO-MoO2at different irradiation powers(concentration of 100 μg·mL-1);(c)Temperature rise and fall curves of VO-MoO2(laser power of 1.0 W and concentration 100 μg·mL-1);(d)t--ln θ fitted curve

在808 nm激光照射下VO-MoO2膠體溶液會產(chǎn)生大量的熱量。圖6為不同濃度的VO-MoO2在808 nm激光照射下的升溫情況，去離子水照射10 min后溫度從20.0℃上升到24.8℃，升溫幅度僅有4.8℃，而相同體積的 100 μg·mL-1VO-MoO2膠體溶液從20.0℃上升到了69.6℃，升溫幅度高達(dá)49.6℃，由此可證明VO-MoO2是一種優(yōu)良高效的光熱轉(zhuǎn)化材料。

圖6 近紅外光照(1 W)下不同濃度VO-MoO2的熱成像圖Fig.6 Thermal images of VO-MoO2with different concentrations under near-infrared illumination(1 W)

2.4 光熱穩(wěn)定性

為研究材料的穩(wěn)定性，將100 μg·mL-1VO-MoO2在808 nm 1.0 W激光功率下照射10 min，自然冷卻至室溫，重復(fù)10個循環(huán)，如圖7a所示，VO-MoO2納米材料每個循環(huán)照射可達(dá)到的最高溫度幾乎一樣，每個循環(huán)升溫情況無差異，表明VO-MoO2具有優(yōu)異的光熱性能，其光熱性能不會隨著光照次數(shù)的增多而發(fā)生變化。每個升降溫循環(huán)后的UV-Vis-NIR譜圖如圖7b所示，材料的光吸收能力幾乎無變化，而隨循環(huán)次數(shù)增加最大波長處吸光度輕微增加，這可能是溶液照射過程中升溫導(dǎo)致的微量蒸發(fā)所致。

圖7 (a)VO-MoO2膠體溶液循環(huán)照射升降溫曲線;(b)VO-MoO2膠體溶液循環(huán)照射不同次數(shù)的UV-Vis-NIR譜圖Fig.7 (a)Temperature rise and fall curve of VO-MoO2colloidal solution under cyclic irradiation;(b)UV-Vis-NIR spectra of VO-MoO2colloidal solution after the different times of cyclic irradiation

經(jīng)過10個升降溫循環(huán)測試后，材料的粒徑、組成及結(jié)構(gòu)變化見圖8。從TEM照片(圖8a、8b)及水合粒徑變化圖(圖8f)中看出循環(huán)前后材料的形貌及顆粒大小基本無變化。EDS譜圖(圖8c、8d)顯示了循環(huán)前后材料基本組成都是Mo和O兩種元素(圖中C和Cu來自制樣用的碳膜和銅網(wǎng))。XRD圖重現(xiàn)性良好(圖8e)，都為單斜相二氧化鉬。循環(huán)前后的材料組成和結(jié)構(gòu)表征進(jìn)一步證明VO-MoO2納米材料具有優(yōu)良的穩(wěn)定性。

圖8 VO-MoO2循環(huán)照射(a)前和(b)后的TEM圖;VO-MoO2循環(huán)照射(c)前和(d)后的EDS譜圖;(e)VO-MoO2循環(huán)照射前后的XRD圖;(f)VO-MoO2循環(huán)照射不同次數(shù)水合粒徑變化Fig.8 TEM images of VO-MoO2(a)before and(b)after cyclic illumination;EDS spectra of VO-MoO2(c)before and(c)after cyclic illumination;(e)XRD patterns of VO-MoO2before and after cyclic illumination;(f)Hydration particle sizes of VO-MoO2after the different times of cyclic irradiation

2.5 CCK-8細(xì)胞毒性

將人源高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞Hep G2和正常人體肝細(xì)胞L02用于VO-MoO2的細(xì)胞毒性評估。采用CCK-8法檢測0～500 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)的VO-MoO2對Hep G2細(xì)胞和L02細(xì)胞的毒性，將Hep G2細(xì)胞和L02細(xì)胞分別與不同濃度VO-MoO2納米材料共孵育24 h，加入CCK-8試劑，采用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)式5計算細(xì)胞存活率。如圖9所示，在0～300 μg·mL-1的低劑量組中Hep G2細(xì)胞和L02細(xì)胞存活率無下降，反而表現(xiàn)出一定程度的增殖，這可能是由于VO-MoO2表面殘留的少量PVP具有較好的生物相容性，陳等[37]也報道了聚乳酸經(jīng)過PVP修飾后，更具有細(xì)胞親和性，在細(xì)胞孵育過程中PVP對細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用和促增殖作用。當(dāng)VO-MoO2濃度增大到400 μg·mL-1時，Hep G2細(xì)胞存活率降低至69.2%，L02細(xì)胞存活率降低至56.5%；VO-MoO2對L02細(xì)胞的影響趨勢與對Hep G2細(xì)胞的影響基本一致，在300 μg·mL-1之前對細(xì)胞無損傷，但在更高的濃度下，細(xì)胞的存活率顯著降低。根據(jù)光熱轉(zhuǎn)換性能測試結(jié)果可知，當(dāng)VO-MoO2濃度達(dá)到100 μg·mL-1時，足以達(dá)到較好的療效，且在此治療劑量下，VO-MoO2對2種細(xì)胞無毒性，表面包覆的少量PVP對細(xì)胞具有一定的保護(hù)和促增殖作用。

圖9 Hep G2細(xì)胞和L02細(xì)胞與不同濃度VO-MoO2孵育后的細(xì)胞存活率Fig.9 Cell survival rates of Hep G2 cells and L02 cells incubated with different concentrations of VO-MoO2

2.6 細(xì)胞內(nèi)的光熱殺傷性能

分別考察了VO-MoO2對肝癌細(xì)胞Hep G2和正常肝細(xì)胞L02的光熱殺傷性能。經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，正常活細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，臺盼藍(lán)不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而喪失活性的細(xì)胞的細(xì)胞膜不完整，通透性增加，可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。100 μg·mL-1VO-MoO2與肝癌細(xì)胞Hep G2共孵育后經(jīng)臺盼藍(lán)染色，空白組(圖10a)和對照組(圖10b、10c)均為細(xì)胞膜完整、活力正常的細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)組(圖10d)細(xì)胞均被染成藍(lán)色。經(jīng)細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，空白組和對照組細(xì)胞存活率均在 99% 以上，而與 100 μg·mL-1VO-MoO2共孵育的Hep G2細(xì)胞經(jīng)808 nm激光照射2 min后細(xì)胞存活率為0。

圖10 Hep G2細(xì)胞(a)正常培養(yǎng)后臺盼藍(lán)染色圖和(b)經(jīng)808 nm激光照射后臺盼藍(lán)染色圖;(c)Hep G2細(xì)胞與VO-MoO2共孵育后臺盼藍(lán)染色圖;(d)Hep G2細(xì)胞與VO-MoO2共孵育經(jīng)808 nm激光照射后臺盼藍(lán)染色圖Fig.10 Trypan blue staining photographs(a)in normal culture background and(b)irradiated by 808 nm laser of Hep G2 cells;(c)Trypan blue staining of co-incubation of Hep G2 cells with VO-MoO2;(d)Trypan blue staining of Hep G2 cells co-incubated with VO-MoO2under 808 nm laser irradiation

同等條件下的L02細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色，空白組(圖11a)、對照組(圖11b、10c)及實(shí)驗(yàn)組(圖11d)除極個別細(xì)胞為藍(lán)色外，絕大多數(shù)細(xì)胞為未染色的活力正常細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，無激光照射的空白組和對照組細(xì)胞存活率為99%，激光照射空白組細(xì)胞存活率為97%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率為96%。

圖11 L02細(xì)胞(a)正常培養(yǎng)后和(b)經(jīng)808 nm激光照射后臺盼藍(lán)染色圖;(c)L02細(xì)胞與VO-MoO2共孵育后臺盼藍(lán)染色圖;(d)L02細(xì)胞與VO-MoO2共孵育經(jīng)808 nm激光照射后臺盼藍(lán)染色圖Fig.11 Trypan blue staining photographs(a)in normal culture background and(b)irradiated by 808 nm laser of L02 cells;(c)Trypan blue staining of co-incubation of L02 cells with VO-MoO2;(d)Trypan blue staining of L02 cells co-incubated with VO-MoO2under 808 nm laser irradiation

以上結(jié)果表明用VO-MoO2作為光敏劑進(jìn)行PTT對正常組織細(xì)胞基本沒有損傷，但對癌細(xì)胞具有顯著的光熱殺傷性能，可能是由于VO-MoO2納米顆粒外層包覆的PVP增強(qiáng)了VO-MoO2在腫瘤細(xì)胞中的通透性和滯留作用，使VO-MoO2在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積[38-39]，經(jīng)近紅外光照射后對癌細(xì)胞具有顯著的光熱殺傷性能，將其作為PTT光敏劑具有廣闊的前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

為全面評估VO-MoO2納米材料的光熱轉(zhuǎn)換和光熱殺傷性能，總結(jié)了文獻(xiàn)報道的部分光熱轉(zhuǎn)化劑的性能參數(shù)，見表1。VO-MoO2納米材料光熱轉(zhuǎn)換效率達(dá) 67.9%，100 μg·mL-1VO-MoO2與癌細(xì)胞共孵育后經(jīng)808 nm激光照射2 min后，癌細(xì)胞殺傷率為100%，顯著優(yōu)于文獻(xiàn)報道的光敏劑的性能參數(shù)。

表1 光敏劑性能參數(shù)比較 Table 1 Comparison of performance parameters of photosensitizers

續(xù)表1

3 結(jié) 論

通過水熱法在還原條件下制備的VO-MoO2因具有大量氧缺陷，表現(xiàn)出極佳的LSPR特性，從而具有優(yōu)異的近紅外光學(xué)吸收性質(zhì)。100 μg·mL-1VO-MoO2在808 nm激光照射下，短時間內(nèi)升溫達(dá)到31.5℃，光熱轉(zhuǎn)化效率高達(dá)67.9%，材料具有良好的光熱穩(wěn)定性，經(jīng)10次循環(huán)照射，近紅外吸收能力、組成及結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化，有利于多次治療；因PVP的包覆作用，低劑量的VO-MoO2對細(xì)胞沒有毒性，反而具有一定的細(xì)胞增殖作用，因此該光熱制劑具有優(yōu)異的生物相容性。低劑量的VO-MoO2經(jīng)808 nm近紅外光照射對癌細(xì)胞具有顯著的光熱殺傷性能，該VO-MoO2作為PTT的光敏劑具有廣闊的前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>