芋ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）基因家族的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析

何芳練，劉莉莉，蔣慧萍，邱祖楊，黃詩(shī)宇，董偉清*

芋ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）基因家族的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析

何芳練1，劉莉莉2，蔣慧萍1，邱祖楊2，黃詩(shī)宇1，董偉清1*

1. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西南寧 530007；2. 荔浦市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣西荔浦 546600

芋（）為天南星科芋屬成員，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，其球莖主要貯藏物質(zhì)為淀粉。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，在植物淀粉合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但目前關(guān)于芋AGPase基因家族的分子結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式還不清楚。本研究以芋新品種‘荔浦芋1號(hào)’為試材，從全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組注釋信息中篩選到6個(gè)AGPase基因家族成員，利用RT-PCR技術(shù)克隆了6個(gè)基因的編碼區(qū)，利用生物信息學(xué)對(duì)其理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系和保守motif進(jìn)行分析；同時(shí)利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)6個(gè)基因在不同組織和球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明：克隆獲得6個(gè)芋AGPase基因編碼區(qū)的cDNA序列，序列長(zhǎng)度為1398～2028 bp，編碼的蛋白大小為350～543 aa，其中4個(gè)基因（～）編碼AGPase的大亞基，2個(gè)基因（，）編碼AGPase的小亞基。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，所有的AGPase分成了大亞基和小亞基2個(gè)群組，4個(gè)大亞基分在了大亞基組，2個(gè)小亞基分在了小亞基組。CeAGP家族蛋白分子質(zhì)量范圍為38 753.22～59 743.05 kDa，等電點(diǎn)范圍為5.64～8.82，亞細(xì)胞定位為葉綠體、淀粉體和細(xì)胞質(zhì)等。蛋白的保守motif分析發(fā)現(xiàn)，CeAGP家族蛋白共預(yù)測(cè)到11個(gè)保守motif，6個(gè)motif功能注釋為NTP_transferase，除CeAGPS2外，另外5個(gè)CeAGP蛋白均包含11個(gè)motif。在不同組織中，6個(gè)基因均能在所有組織中表達(dá)，其中和基因在葉片和葉柄中高表達(dá)，和基因在球莖中高表達(dá)，6個(gè)基因在根的表達(dá)量均較低。在球莖不同發(fā)育階段中，和高表達(dá)且均表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，2個(gè)基因分別在4月齡和5月齡階段的表達(dá)量最高。該研究結(jié)果為后續(xù)闡明芋淀粉合成的分子機(jī)制提供依據(jù)。

芋；AGPase；基因克?。槐磉_(dá)分析

芋（Schott），別名芋頭、芋艿，為天南星科芋屬成員，在世界范圍內(nèi)廣泛種植[1]。芋是一種古老的作物，其種植歷史可以追溯到28 000年前[2]。球莖是芋的主要食用部位，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、纖維和礦物質(zhì)等[3]，其中淀粉是其主要貯藏物質(zhì)，占干物質(zhì)含量的73%～80%[4]。

在植物中，淀粉的生物合成受一系列酶的調(diào)控，如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）、淀粉合成酶（starch synthase，SS）、淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）和脫分支酶（debranching enzyme，DBE）等[5-7]，其中AGPase（EC 2.7.7.27）是淀粉合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，影響植物淀粉的合成速率[8]。AGPase將葡萄糖-1-磷酸（Glc- 1-P）和ATP催化形成ADP-葡萄糖（ADP-glucose）和無(wú)機(jī)焦磷酸（PPi），其中ADP-葡萄糖作為淀粉合成的起始底物[9]。在高等植物中，AGPaes是由2個(gè)大亞基和2個(gè)小亞基組成的異源四聚體[10]。在大亞基和小亞基的功能方面已經(jīng)開(kāi)展了大量的研究，基本明確小亞基具有催化和調(diào)節(jié)功能，而大亞基主要負(fù)責(zé)AGPase的構(gòu)像調(diào)節(jié)[10-11]。

隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，許多植物的AGPase基因家族已經(jīng)陸續(xù)被克隆和鑒定，不同植物的AGPase基因個(gè)數(shù)存在差異，如番茄、獼猴桃和西谷椰子有4個(gè)AGPase基因[12-14]；馬鈴薯、擬南芥、玉米和甘薯有6個(gè)AGPase基因[11, 15-17]；水稻和木薯有7個(gè)AGPase基因[9, 18-19]；香蕉有8個(gè)AGPase基因[20]。

目前，關(guān)于芋AGPase基因的研究報(bào)道較少，LIU等[21]對(duì)芋葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選到26個(gè)與淀粉合成相關(guān)的候選基因，其中有1個(gè)AGPase基因；DONG等[22]對(duì)芋球莖不同發(fā)育階段的比較轉(zhuǎn)錄組分析，富集到與淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的139個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本和24個(gè)酶，其中富集到AGPase的轉(zhuǎn)錄本5條；王立等[5]克隆了芋AGPase小亞基基因（），該基因具有NTP_transf_3和PbH1結(jié)構(gòu)域，表達(dá)模式與球莖淀粉含量的積累呈顯著正相關(guān)。本課題組在前期研究中，使用PacBio平臺(tái)對(duì)自主選育的芋新品種‘荔浦芋1號(hào)’3月齡植株的葉片、葉柄、球莖和根進(jìn)行了混合樣全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本序列38 043條，將獲得的序列與芋參考基因組[（Niue2），https://db.cngb.org/search/ project/ PRJNA328799/] 進(jìn)行比對(duì)和功能注釋?zhuān)?個(gè)基因注釋為AGPase基因。根據(jù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組注釋信息，設(shè)計(jì)特異性克隆引物，克隆獲得6個(gè)芋AGPase基因的cDNA序列，通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)其編碼蛋白的分子結(jié)構(gòu)特性和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析；同時(shí)對(duì)6個(gè)AGPase基因在不同組織和球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步闡明芋淀粉合成的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為本課題組選育的芋新品種‘荔浦芋1號(hào)’，該品種為魁芋類(lèi)型（檳榔芋），主要食用母芋，具有粉、香、糯等特點(diǎn)。2020年3月上旬種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院武鳴里建科學(xué)研究基地，田間管理和農(nóng)事操作參考本課題組總結(jié)的檳榔芋輕簡(jiǎn)化栽培技術(shù)。根據(jù)芋球莖發(fā)育時(shí)期，每月取樣一次，即連續(xù)取發(fā)育1、2、3、4、5、6、7、8月齡的球莖樣品，球莖在取樣時(shí)取中上部。不同組織的樣品取播種3月齡（90 d）的葉片、葉柄、球莖及根。所有樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 使用植物多糖多酚總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP441]提取所有樣品的總RNA，提取方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用TIANScript Ⅱ cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，KR107]將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈。cDNA合成反應(yīng)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 CeAGP基因家族的克隆 以芋球莖和葉片cDNA為模板，根據(jù)前期全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的注釋信息，獲得6個(gè)編碼芋AGPase基因的序列，根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)特異性克隆引物（表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：2×Phanta?Master Mix 20 4.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足至40.0 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。將目的片段純化、回收后連接到pMD 19-T Vector（TaKaRa，6013）上，然后轉(zhuǎn)化DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布在LB（100 mg/L Amp）平板上。以M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer引物對(duì)挑取的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送廣州艾基生物公司測(cè)序。

1.2.3 CeAGP家族蛋白的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的ORF Finder在線(xiàn)工具（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）查找分析CeAGP家族蛋白的開(kāi)放閱讀框（ORF）；使用ExPASy- ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)CeAGP家族蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；利用 WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）預(yù)測(cè)CeAGP家族蛋白的亞細(xì)胞定位；使用MEME 5.4.1軟件（https://meme-suite.org/meme/）分析CeAGP 家族蛋白的保守motif，然后使用InterProScan數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）對(duì)預(yù)測(cè)的motif進(jìn)行功能注釋。

表1 基因克隆和熒光定量RT-PCR引物

1.2.4 CeAGP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 目前，許多植物的AGPase基因家族已經(jīng)被鑒定，可用于本研究進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。從Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站下載擬南芥、水稻、馬鈴薯、甘薯和木薯的AGPase蛋白序列，然后利用DNAMAN 9對(duì)芋、擬南芥、水稻、馬鈴薯、甘薯和木薯的AGPase蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用MEGA X的NJ法（Bootstrap值為1000次）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 CeAGP基因家族的轉(zhuǎn)錄組分析 課題組前期研究中對(duì)芋球莖發(fā)育過(guò)程中淀粉的含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在球莖發(fā)育前期（1～2月齡，即S1、S2），淀粉含量較低，在發(fā)育中期（3～5月齡，即S3、S4、S5）淡粉迅速積累，發(fā)育后期（6～8月齡，即S6、S7、S8）淀粉含量保持穩(wěn)定[22]。因此，根據(jù)球莖淀粉的積累規(guī)律，對(duì)芋球莖發(fā)育1、2、3、4、5和8月齡（TS1、TS2、TS3、TS4、TS5、TS6）的球莖樣品開(kāi)展了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，富集了大量與淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的mRNA、miRNA和CircRNA[22]。隨后，同樣基于淀粉的積累規(guī)律，對(duì)芋球莖發(fā)育3月齡的不同組織葉片、葉柄、球莖和根也開(kāi)展了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（未發(fā)表）。本研究從兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取6個(gè)CeAGP基因的FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）值，在百邁克云平臺(tái)（https://international. biocloud.net/zh/software/tools/detail/small/305）繪制CeAGP基因家族在不同組織和球莖不同發(fā)育階段的聚類(lèi)熱圖。

1.2.6 CeAGP基因家族的表達(dá)分析 以葉片、葉柄、根和球莖不同發(fā)育階段的cDNA為模板，使用AnalytikJena qTOWERE 2.2熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量RT-PCR試驗(yàn)。根據(jù)克隆獲得的芋CeAGP基因家族序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量RT-PCR引物（表1），以芋基因?yàn)閮?nèi)參基因[5]。使用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，Q711-02）進(jìn)行熒光定量RT-PCR試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為：SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，模板cDNA 1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20.0 μL。熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。采用2?ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CeAGP基因家族cDNA序列克隆

以芋球莖和葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1316～2028 bp的目的基因片段（圖1），經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化及菌落PCR鑒定，得到陽(yáng)性克隆。通過(guò)測(cè)序、拼接獲得6個(gè)芋AGPase基因的cDNA序列，序列長(zhǎng)度為1398～2028 bp（表2），其中編碼AGPase大亞基的基因4個(gè)，將其命名為、、和；編碼AGPase小亞基的基因2個(gè)，將其命名為和。將獲得的基因核苷酸序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得相應(yīng)的GenBank登錄號(hào)（表2）。

M: Marker III; 1: CeAGPL1 1F1R; 2: CeAGPL2 1F1R; 3: CeAGPL3 1F1R; 4: CeAGPL4 1F1R; 5: CeAGPL4 2F2R; 6: CeAGPS1 1F1R; 7: CeAGPS2 1F1R.

表2 CeAGP家族蛋白的理化性質(zhì)

2.2 CeAGP家族蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

對(duì)克隆獲得的CeAGP基因家族編碼的蛋白大小進(jìn)行分析，結(jié)果表明，6個(gè)CeAGP基因家族編碼的蛋白大小為350～543 aa（表2）。對(duì)CeAGP基因家族編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2，CeAGP家族蛋白分子質(zhì)量范圍為38 753.22～ 59 743.05 kDa，等電點(diǎn)范圍為5.64～8.82，CeAGP家族蛋白預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞位置主要有葉綠體、淀粉體和細(xì)胞質(zhì)等。

2.3 CeAGP家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究CeAGP家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系，用36個(gè)AGPase蛋白用于系統(tǒng)進(jìn)化研究，其中包括6個(gè)水稻OsAGP，6個(gè)擬南芥AtAGP，5個(gè)馬鈴薯StAGP，7個(gè)木薯MeAGP，6個(gè)甘薯IbAGP和6個(gè)芋CeAGP。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，所有的AGPase被分成大亞基和小亞基2個(gè)群組（圖2）。大亞基群組包含23個(gè)AGPase蛋白，其中包括4個(gè)水稻OsAGP（OsAGPL1：LOC_Os03g52460；OsAGPL2：LOC_Os01g44220；OsAGPL3：LOC_ Os05g50380；OsAGPL4：LOC_Os07g13980），4個(gè)擬南芥AtAGP（AtAGPL1：AT5G19220；At-A-GPL2：AT1G27680；AtAGPL3：AT4G39210；At--A-GPL4：AT2G21590），3個(gè)馬鈴薯StAGP（St-A-GPL1：PGSC0003DMG400009026；StAGPL2：PG-SC0003DMG400015952；StAGPL3：PGS-C-000-3-D-MG400000735），4個(gè)木薯MeAGP（MeAGPL1：Man-es.01G236700；MeAGPL2：Manes.03-G-18-2-1-00；MeAGPL3：Manes.11G085500；MeAGPL4：Manes.15G025400），4個(gè)甘薯IbAGP（IbAGPL1：JQ797692；IbAGPL2：JQ797693；IbAGPL3：JQ797694；IbAGPL4：JQ797695）和4個(gè)芋CeAGP；小亞基群組包含13個(gè)AGPase蛋白，其中包括2個(gè)水稻OsAGP（OsAGPS1：LOC_Os09g12660；OsAGPS2：LOC_Os08g25734），2個(gè)擬南芥AtAGP（AtAGPS1：AT5G48300；AtAGPS2：AT1G0-5610），2個(gè)馬鈴薯StAGP（StAGPS1.1：PGSC0003-DM-G400031084；StAGPS1.2：PGSC0003D-MG-400046891），3個(gè)木薯MeAGP（MeAGPS1：Man-es.-05-G2080-00；MeAGPS2：Manes.12G067900；MeAGPS3：Manes.13G058900），2個(gè)甘薯IbAGP（IbAGPS1：JQ797696；IbAGPS2：JQ797697）和2個(gè)芋CeAGP（圖2）。

由圖2可知，在芋CeAGP小亞基蛋白中，CeAGPS2與AtAGPS2和MeAGPS1形成的分支聚在一起，形成了一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化分支；而CeAGPS1與OsAGPS1和OsAGPS2的親緣關(guān)系更近。在芋Ce-A-GP大亞基蛋白中，CeAGPL1和CeAGPL4聚在一個(gè)分支上，然后與IbAGPL3、StAGPL2和AtA-G--PL2形成的分支聚在一起；CeAGPL2與MeAGPL1聚在一個(gè)分支上，說(shuō)明彼此的親緣關(guān)系更近；Ce-A-GPL3與AtAGPL1、StAGPL1、IbAGPL4、Me-A-GPL2和MeAGPL4形成的分支聚在一起（圖2）。

圖2 水稻、擬南芥、馬鈴薯、甘薯、木薯和CeAGP家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 CeAGP家族蛋白的保守motif分析

為了進(jìn)一步分析CeAGP家族蛋白的結(jié)構(gòu)多樣性和功能，使用MEME 5.4.1軟件和InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CeAGP家族蛋白的保守motif進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能注釋?zhuān)▓D3和表3）。結(jié)果顯示，共預(yù)測(cè)到11個(gè)保守motif，6個(gè)motif（motif 1，4～8）注釋為NTP_transferase（PF00483）；CeAGPL1、CeAGPL2、CeAGPL3、CeAGPL4和CeAGPS1包含所有的11個(gè)motif；而CeAGPS2包含motif 2～5和motif 8～11，缺少了motif 1、motif 6、motif 7。

2.5 CeAGP基因家族在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的表達(dá)分析

為了研究CeAGP基因家族在芋生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，根據(jù)課題組前期對(duì)芋球莖淀粉的積累規(guī)律，對(duì)球莖發(fā)育3月齡植株的不同組織（葉片、葉柄、球莖和根）和球莖不同發(fā)育階段（1、2、3、4、5和8月齡）的樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取6個(gè)CeAGP基因家庭成員的FPKM值，對(duì)CeAGP基因在芋不同組織和球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

由圖4和表4可看出，在球莖、葉片和葉柄中高表達(dá)，其中最高的為球莖，F(xiàn)PKM值為887.11，其次為葉片和葉柄，F(xiàn)PKM值為327.53和164.35，根的表達(dá)量最低，F(xiàn)PKM值僅為15.97；在球莖中高表達(dá)，F(xiàn)PKM值為851.76，在葉片、葉柄和根中低表達(dá)，F(xiàn)PKM值≤40.07；在葉片和葉柄有較高的表達(dá)量，F(xiàn)PKM值分別為323.51和131.76，在球莖和根中低表達(dá)，F(xiàn)PKM值≤13.58；、和在所有的組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量較低，F(xiàn)PKM值≤25.66。由于高等植物的AGPaes是由2個(gè)大亞基和2個(gè)小亞基組成的異源四聚體，大亞基和小亞基由不同的基因編碼產(chǎn)生[10]。從基因家族在芋不同組織的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在球莖中，和基因高表達(dá)且表達(dá)量基本一致，遠(yuǎn)高于其他4個(gè)基因，說(shuō)明球莖AGPase主要是由和基因編碼產(chǎn)生的多肽形成；在葉片和葉柄中，和基因高表達(dá)且表達(dá)量基本一致，遠(yuǎn)高于其他4個(gè)基因，說(shuō)明葉片和葉柄AGPase主要是由和基因編碼產(chǎn)生的多肽形成。此外，球莖和基因的整體表達(dá)量高于葉片和的整體表達(dá)量，葉片的和整體表達(dá)量又高于葉柄的和的表達(dá)量，推測(cè)芋球莖、葉片和葉柄均具有合成淀粉的能力，且合成能力大小為球莖>葉片>葉柄。

圖3 CeAGP家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化和保守motif分析

表3 芋CeAGP家族蛋白保守motif及功能注釋

圖4 CeAGP基因家族在芋不同組織的表達(dá)分析

由圖5和表5可看出，表達(dá)呈逐漸升高后降低的趨勢(shì)，其中表達(dá)最高的是TS5（5月齡)，F(xiàn)PKM值為691.48，其次為T(mén)S4（4月齡），F(xiàn)PKM值為558.03；的表達(dá)趨勢(shì)與一致，均為逐漸升高后降低的趨勢(shì)，其中表達(dá)量最高的為T(mén)S4（4月齡），F(xiàn)PKM值為361.34；、、和在球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)量均較低，F(xiàn)PKM值≤40.99。在球莖發(fā)育過(guò)程中，僅有和基因高表達(dá)，與基因家族在不同組織的表達(dá)結(jié)果一致。

表4 CeAGP基因家族在芋不同組織的FPKM值

圖5 CeAGP基因家族在芋球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)分析

2.6 CeAGP基因家族的熒光定量表達(dá)分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，選取了3月齡植株的葉片、葉柄、球莖和根4種組織及球莖8個(gè)不同發(fā)育階段（1、2、3、4、5、6、7、8月齡）的樣品，對(duì)CeAGP基因家族在不同組織和球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行分析。由圖6可知，在不同組織中，在球莖的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（<0.05），其次為葉片和葉柄，顯著高于根的表達(dá)（<0.05）；在球莖顯著表達(dá)（<0.05）；在葉片中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（<0.05），其次為葉柄；雖然、和在不同組織均能表達(dá)，但整體表達(dá)量較低。在球莖不同發(fā)育階段中（圖7），的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在S5（5月齡）階段的表達(dá)量最高（<0.05）；的表達(dá)也是呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在S4（4月齡）階段表達(dá)量最高；、、和在球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)量雖然存在差異，但整體表達(dá)量較低。6個(gè)CeAGP基因家族成員在不同組織和球莖不同發(fā)育階段的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致。

表5 CeAGP基因家族在芋球莖不同發(fā)育階段的FPKM值

3 討論

AGPase是淀粉生物合成途徑的第一個(gè)限速酶，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮重要作用[20]。本研究根據(jù)前期對(duì)芋3月齡植株不同組織（葉片、葉柄、球莖和根）的混合樣進(jìn)行了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，序列經(jīng)與芋參考基因組進(jìn)行比較，獲得功能注釋信息，其中有6個(gè)基因注釋為AGPase基因。根據(jù)序列信息，設(shè)計(jì)特異性克隆引物，克隆獲得了6個(gè)AGPase基因的cDNA序列，包括4個(gè)大亞基基因（～）和2個(gè)小亞基基因（，）。克隆的芋AGPase基因家族個(gè)數(shù)與馬鈴薯、擬南芥、玉米和甘薯上報(bào)道的AGPase基因個(gè)數(shù)一致[11, 15-17]，與番茄、獼猴桃、西谷椰子、水稻、木薯和香蕉等鑒定的AGPase基因個(gè)數(shù)存在差異[9, 12-14, 18-20]，至于芋中是否還存在其他AGPase基因，仍需進(jìn)一步通過(guò)全基因組范圍內(nèi)開(kāi)展基因家族鑒定和分析。

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，所有的AGPase蛋白分成了大亞基和小亞基2個(gè)群組，芋的4個(gè)大亞基分在了大亞基組，2個(gè)小亞基分在了小亞基組，這與木薯、香蕉的AGPase系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果一致[9, 20]。6個(gè)CeAGP蛋白共預(yù)測(cè)到11個(gè)保守motif，與其他植物AGPase預(yù)測(cè)的motif略有差異，如香蕉上共預(yù)測(cè)到15個(gè)motif，木薯上預(yù)測(cè)到20個(gè)motif[9, 20]。所有的CeAGP蛋白中，CeAGPS2包含8個(gè)motif，其余5個(gè)CeAGP蛋白均包含11個(gè)motif，推測(cè)CeAGPS2可能在進(jìn)化歷史和行使功能方面與其他5個(gè)CeAGP蛋白存在差異。在香蕉AGPase上也存在類(lèi)似情況，6個(gè)MaAPL包含15個(gè)motif，而MaAPS1包含11個(gè)motif，MaAPS2僅包含9個(gè)motif[20]。雖然4個(gè)CeAGPL與CeAGPS1有著相同的motif，但可能在基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)方面存在差異，在其他植物如香蕉、蓮、小麥、甘薯等均發(fā)現(xiàn)AGPase的大亞基和小亞基基因在內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)方面存在差異[10-11, 20, 24]。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）。

在普遍認(rèn)知中，葉片合成淀粉的場(chǎng)所為葉綠體，而在貯藏器官（塊莖）合成淀粉的場(chǎng)所為淀粉體，因而AGPase也主要存在于葉綠體和淀粉體中[16-17]。此外，也有相關(guān)研究表明，AGPase不僅存在于質(zhì)體中，也存在于細(xì)胞質(zhì)，如水稻AGPase亞細(xì)胞定位中，OsAGPS2a、OsAGPS1、OsAGPL1、OsAGPL3和OsAGPL4定位于質(zhì)體，而OsAGPS2b和OsAGPL2定位于細(xì)胞質(zhì)中[25]；玉米胚乳AGPase以質(zhì)外體為主[26]；香蕉果肉AGPase存在于細(xì)胞質(zhì)和淀粉體中，且在細(xì)胞質(zhì)中活性大于淀粉體[27]。在本研究中，CeAGP家族蛋白預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞位置主要有葉綠體、淀粉體和細(xì)胞質(zhì)等，預(yù)測(cè)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，至于每個(gè)CeAGP更加精細(xì)的亞細(xì)胞定位，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在芋不同組織中，在球莖中高表達(dá)，在葉片和葉柄高表達(dá)，在球莖葉片和葉柄中的表達(dá)量均較高，而、和在所有組織中的表達(dá)量均較低，說(shuō)明不同的CeAGP基因在不同組織的表達(dá)模式上存在差異。其他植物AGPase基因也存在類(lèi)似情況，如木薯在葉片高表達(dá)，在貯藏根中高表達(dá)，而在貯藏根和葉片中均高表達(dá)[9]；香蕉和在果實(shí)上高表達(dá)，在葉片和果實(shí)高表達(dá)，而在所有組織中的表達(dá)量均較低[20]。同時(shí)，從CeAGP基因家族在芋不同組織的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在球莖中，和基因高表達(dá)；而在葉片和葉柄中，高表達(dá)的基因?yàn)楹停f(shuō)明芋球莖AGPase與葉片和葉柄AGPase由不同的基因編碼產(chǎn)生，推測(cè)芋球莖與葉片和葉柄在淀粉合成方式上存在差異，這與VAN HARSSELAAR等[16]報(bào)道的馬鈴薯在葉片和塊莖中有不同的淀粉合成方式一致。

在芋球莖不同發(fā)育過(guò)程中，和的表達(dá)量均表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在中后期表達(dá)量最高，其余4個(gè)基因的表達(dá)量均較低。王立等[5]對(duì)芋AGPase小亞基基因在球莖發(fā)育過(guò)程中的研究結(jié)果表明，該基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在播種后160 d表達(dá)水平最高，與本研究結(jié)果一致。在本課題組前期研究中，對(duì)球莖發(fā)育過(guò)程中淀粉的積累結(jié)果表明，在球莖發(fā)育前期（1～2月齡）淀粉含量較低，隨后在接下來(lái)的3個(gè)月（3～5月齡）淀粉含量迅速增加，最后趨于穩(wěn)定[22]；同時(shí)，（）和（）的轉(zhuǎn)錄水平在球莖4月齡顯著上調(diào)[22]，與本研究結(jié)果一致。和在球莖高表達(dá)且表達(dá)趨勢(shì)與淀粉的積累趨勢(shì)一致，且與其在不同組織的表達(dá)結(jié)果相互印證，說(shuō)明這2個(gè)基因可能是球莖淀粉積累的關(guān)鍵基因。綜上，本研究克隆獲得6個(gè)編碼芋AGPase基因的cDNA序列，序列長(zhǎng)度為1398～2028 bp，編碼的蛋白大小為350～543 aa。在葉片和葉柄中，高表達(dá)的基因?yàn)楹?；在球莖中，高表達(dá)的基因?yàn)楹?，且這2個(gè)基因在球莖不同發(fā)育階段中均表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。相關(guān)研究結(jié)果為后續(xù)闡明芋淀粉合成的分子機(jī)制提供依據(jù)。

[1] 黃新芳, 柯衛(wèi)東, 葉元英, 李雙梅. 中國(guó)芋種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2005, 6 (1): 119-123.

HUANG X F, KE W D, YE Y Y, LI S M. Advances in research on germplasm resources of Chinese taro[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2005, 6(1): 119-123. (in Chinese)

[2] YIN J M, JIANG L, WANG L, HAN X Y, GUO W Q, LI C H, ZHOU Y, DENTON M, ZHANG P T. A high-quality genome of taro [(L.) Schott], one of the world’s oldest crops[J]. Molecular Ecology Resources, 2021, 21(1): 68-77.

[3] TEMESGEN M, RETTA N. Nutritional potential, health and food security benefits of taro(L.): A review[J]. Food Science and Quality Management, 2015, 36: 23-30.

[4] NJINTANG N Y, MBOFUNG C M F, KESTELOOT R. Multivariate analysis of the effect of drying method and particle size of flour on the instrumental texture characteristics of paste made from two varieties of taro (L. Schott) flour[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 81(1): 250-256.

[5] 王 立, 殷劍美, 韓曉勇, 張培通, 郭文琦, 李春宏. 芋淀粉合成酶基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2016, 43(6): 1117-1125.

WANG L, YIN J M, HAN X Y, ZHANG P T, GUO W Q, LI C H. Gene cloning and expression analysis of ADP-glucose pyrophosphorylase in[J]Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(6): 1117-1125. (in Chinese)

[6] 何芳練, 邱祖楊, 董偉清, 劉莉莉. 荸薺基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種, 2021, 19(17): 5654- 5661.

HE F L, QIU Z Y, DONG W Q, LIU L L. Cloning and expression analysis ofgene in[J]. Molecular Plant Breeding, 2021, 19(17): 5654-5661. (in Chinese)

[7] 董偉清, 江 文, 何芳練, 邱祖楊, 蔣慧萍, 黃詩(shī)宇, 劉莉莉, 何春紅, 楊干德. 荸薺淀粉合成酶的基因克隆及表達(dá)分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2021, 34(5): 956-963.

DONG W Q, JIANG W, HE F L, QIU Z Y, JIANG H P, HUANG S Y, LIU L L, HE C H, YANG G D. Gene cloning and expression analysis of ADP-glucose pyrophosphorylase in[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2021, 34(5): 956-963. (in Chinese)

[8] AGUILERA J M, PARADA J. Review: starch matrices and the glycemic response[J]. Food Science and Technology International, 2011, 17(3): 187-204.

[9] DONG M Y, FAN X W, LI Y Z. Cassavagenes and their encoded proteins are different from those of other plants[J]. Planta, 2019, 250: 1621-1635.

[10] CHENG N, ZENG X F, ZHENG X F, DIAO Y, WANG Y W, XIE K Q, ZHOU M Q, HU Z L. Cloning and characterization of the genes encoding the small and large subunit of the ADP-glucose pyrophosphorylase in lotus ()[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2015, 37: 1734.

[11] ZHOU Y X, CHEN Y X, TAO X, CHENG X J, WANG H Y. Isolation and characterization of cDNAs and genomic DNAs encoding ADP-glucose pyrophosphorylase large and small subunits from sweet potato[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2016, 291: 609-620.

[12] AU S L, TAN S H, HARIKRISHNA K, NAPIS S. Isolation and characterization of cDNA clones encoding ADP-glucose pyrophosphorylase from sago palm ()[J]. Journal of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, 2002, 6(5): 301-308.

[13] PETREIKOV M, SHEN S, YESELSON Y, LEVIN I, BAR M, SCHAFFER A A. Temporally extended gene expression of the ADP-Glc pyrophosphorylase large subunit (AgpL1) leads to increased enzyme activity in developing tomato fruit[J]. Planta, 2006, 224: 1465-1479.

[14] NARDOZZA S, BOLDINGH H L, OSORIO S, H?HNE M, WOHLERS M, GLEAVE A P, MACRAE E A, RICHARDSON A C, ATKINSON R G, SULPICE R, FERNIE A R, CLEARWATER M J. Metabolic analysis of kiwifruit () berries from extreme genotypes reveals hallmarks for fruit starch metabolism[J]. Journal of Experimental Botany, 2013, 64: 5049-5063.

[15] CREVILLéN P, VENTRIGLIA T, PINTO F, OREA A, MéRIDA á, ROMERO J M. Differential pattern of expression and sugar regulation ofADP-glucose pyrophosphorylase-encoding genes[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(9): 8143-8149.

[16] VAN HARSSELAAR J K, LORENZ J, SENNING M, SONNEWALD U, SONNEWALD S. Genome-wide analysis of starch metabolism genes in potato (L.)[J]. BMC Genomics, 2017, 18: 37.

[17] QU J Z, XU S T, ZHANG Z Q, CHEN G Z, ZHONG Y Y, LIU L S, ZHANG R H, XUE J Q, GUO D W. Evolutionary, structural and expression analysis of core genes involved in starch synthesis[J]. Scientific Reports, 2018, 8: 12736.

[18] LU F H, PARK Y J. Sequence variations insignificantly associated with amylose content and viscosity properties in rice (L.)[J]. Genetics Research, 2012, 94(4): 179-189.

[19] TANG X J, PENG C, ZHANG J, CAI Y, YOU X M, KONG F, YAN H G, WANG G X, WANG L, JIN J, CHEN W W, CHEN X G, MA J, WANG P, JIANG L, ZHANG W W, WAN J M. ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 2 is essential for storage substance accumulation and subunit interactions in rice endosperm[J]. Plant Science, 2016, 249: 70-83.

[20] MIAO H, SUN P, LIU Q, LIU J, XU B, JIN Z. The AGPase family proteins in banana: genome-wide identification, phylogeny, and expression analyses reveal their involvement in the development, ripening, and abiotic/biotic stress responses[J]. International Journal Molecular Sciences, 2017, 18: 1581.

[21] LIU H, YOU Y, ZHENG X, DIAO Y, HUANG X, HU Z. Deep sequencing of thetranscriptome revealed candidate genes for major metabolic pathways of starch synthesis[J]. South African Journal of Botany, 2015, 97: 101-106.

[22] DONG W Q, HE F L, JIANG H P, LIU L L, QIU Z Y. Comparative transcriptome sequencing of taro corm development with a focus on the starch and sucrose metabolism pathway[J]. Frontiers in Genetics, 2021, 12: 771081.

[23] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[24] ROSE M K, HUANG X Q, BR?Lé-BABEL A. Molecular characterization and sequence diversity of genes encoding the large subunit of the ADP-glucose pyrophosphorylase in wheat (L.)[J]. Journal of Applied Genetics, 2016, 57: 15-25.

[25] LEE S K, HWANG S K, HAN M, EOM J S, KANG H G, HAN Y H, CHOI S B, CHO M H, BHOO S H, AN G, HAHN T R, OKITA T W, JEON J S. Identification of the ADP-glucose pyrophosphorylase isoforms essential for starch synthesis in the leaf and seed endosperm of rice (L.)[J]. Plant Molecular Biology, 2007, 65: 531-546.

[26] DENYER K, DUNLAP F, THORBJORNSEN T, KEELING P, SMITH A M. The major form of ADP-glucose pyrophosphorylase in maize endosperm is extra-plastidial[J]. Plant Physiology, 1996, 112(2): 779-785.

[27] SOLIS-BADILLO E, AGAMA-ACEVEDO E, TIESSEN A, VALENZUELA J A L, BELLO-PEREZ L A. ADP-glucose pyrophosphorylase is located in the plastid and cytosol in the pulp of tropical banana fruit ()[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 2020, 75: 76-82.

Cloning, Bioinformatics and Expression Analysis of ADP-glucose Pyrophosphorylase Gene Family in

HE Fanglian1, LIU Lili2, JIANG Huiping1, QIU Zuyang2, HUANG Shiyu1, DONG Weiqing1*

1. Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricutural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China; 2. Lipu Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Lipu, Guangxi 546600, China

Taro () is a member of the genusin the family Tenaxaceae and is widely grown worldwide, and the main storage material of its corm is starch.ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) is the first key and rate-limiting enzyme for starch synthesis and plays a critical role in plant starch synthesis, but the molecular structural features and expression patterns of the taro AGPase gene family are still unclear.In this study, six AGPase genes were selected from the full-length transcriptome annotations using the new taro variety ‘Lipuyu No.1’ as the test material. The coding regions of the six genes were cloned by RT-PCR, and the physicochemical properties, evolutionary relationships and conserved motifs were analyzed by bioinformatics.The results showed that the cDNA sequences of the coding regions of six taro AGPase genes were ranged from 1398 bp to 2028 bp and the proteins encoded were ranged from 350 aa to 543 aa in size, of which four genes (to) encoded large subunits of AGPase and two genes (,) encoded small subunits of AGPase. Phylogenetic analysis showed that all AGPases were divided into two groups, large and small subunits, with four large subunits in the large subunit group and two small subunits in the small subunit group. The molecular mass of CeAGPfamily proteins ranged from 38 753.22 kDa to 59 743.05 kDa, with an isoelectric point range of 5.64 to 8.82 and subcellular localization to chloroplasts, amyloplasts and cytoplasm, etc.The conserved motif analysis of the proteins revealed that a total of 11 conserved motifs were predicted for CeAGP family proteins, six motifs were functionally annotated as NTP_transferase, and the other five CeAGP proteins contained 11 motifs except for CeAGPS2.In different tissues, all sixgenes were expressed in all tissues, with high expression ofandin leaves and petioles, high expression ofandin corms, and low expression of all sixgenes in roots.andwere highly expressed in different developmental stages of the corm and both showed a tendency to increase and then decrease, with the highest expression of both genes at 4 and 5 months of age, respectively. These results provide a basis for the subsequent elucidation of the mechanism of taro starch synthesis.

; AGPase; gene cloning; expression analysis

S961.6

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.08.004

2022-02-10；

2022-03-03

廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB20297041）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（桂農(nóng)科2021JM82）；廣西荔浦芋試驗(yàn)站（No. TS202113）。

何芳練（1988—），男，碩士，助理研究員，研究方向：芋種質(zhì)資源創(chuàng)新利用與遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：董偉清（DONG Weiqing），E-mail：dongweiqing@gxaas.net。