芒果MiNAC1基因的功能研究

楊小州，周少麗，何新華，劉 源，余海霞，陸婷婷，王 卓，羅 聰

芒果基因的功能研究

楊小州*，周少麗*，何新華**，劉 源，余海霞，陸婷婷，王 卓，羅 聰**

亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室/植物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心/廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004

NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，研究芒果基因的功能為芒果的抗逆性育種提供基因資源。干旱、鹽和低溫等非生物脅迫嚴(yán)重影響芒果的生長發(fā)育。前期研究中，課題組從芒果逆境脅迫轉(zhuǎn)錄組中獲得了一個基因，表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)其與芒果的逆境脅迫應(yīng)答有關(guān)。本研究對芒果基因的功能進(jìn)行了驗證。將芒果基因構(gòu)建到pBI121-MiNAC1超量表達(dá)載體中，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，對獲得的T3代純合株系進(jìn)行表型觀察分析和逆境脅迫處理。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)芒果基因與野生型擬南芥的表型類似，轉(zhuǎn)基因不影響擬南芥的蓮座葉數(shù)量、抽薹時間、開花時間以及開花時的植株高度。逆境脅迫處理：分別用0、200、300、400 mmol/L甘露醇進(jìn)行干旱脅迫；用0、100、150、200 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫；4℃低溫脅迫處理轉(zhuǎn)基因與對照擬南芥植株。結(jié)果顯示：隨著甘露醇處理濃度的增加，轉(zhuǎn)基因株系與對照組擬南芥的根系生長發(fā)育均受到抑制，但轉(zhuǎn)基因株系受到抑制的影響顯著小于對照組擬南芥，比如在300 mmol/L甘露醇處理時，轉(zhuǎn)基因株系的根長顯著增長，OE9的根長是WT的1.51倍，側(cè)根數(shù)量顯著增加，OE7的側(cè)根數(shù)是WT的5倍，另外根冠比分析顯示，轉(zhuǎn)基因植株的根冠比顯著高于對照植株，OE2的根冠比是WT的1.53倍。鹽脅迫和低溫脅迫也取得了類似的結(jié)果。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)芒果基因可以通過增加轉(zhuǎn)基因植株的根長和側(cè)根數(shù)量提高其對干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫的抗性。本研究初步揭示了基因的功能，為深入研究基因參與調(diào)控芒果逆境脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

芒果；轉(zhuǎn)錄因子；；非生物脅迫；功能分析

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC1/2）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于陸生植物中[1]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的C末端為高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，N端為高度保守的5個亞結(jié)構(gòu)域[2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)的多樣性使得NAC轉(zhuǎn)錄因子功能多樣化[3]，植物NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物根、莖、葉等組織的生長發(fā)育以及調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成，而且逆境脅迫方面功能顯著，尤其是非生物逆境脅迫。植物NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物側(cè)根的生長發(fā)育上發(fā)揮著重要作用，掌葉大黃基因在一年生植株的根中表達(dá)量最高[4]?；ㄉ诓煌鞴僦械谋磉_(dá)量分析顯示在側(cè)根中最高[5]，過量表達(dá)基因使擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)增多[6]。同時玉米在胚芽鞘中大量表達(dá)，促進(jìn)莖尖分生組織的形成[7]，說明植物NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物莖的生長發(fā)育中起一定作用。植物NAC轉(zhuǎn)錄因子還對調(diào)控葉片衰老發(fā)揮著重要作用，擬南芥過表達(dá)基因可提高脫落酸合成基因的表達(dá)，積累脫落酸促進(jìn)擬南芥葉片衰老[8]。過量表達(dá)甜瓜基因的擬南芥植株葉片衰老也明顯加速[9]。煙草基因的過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉片提前衰老[10]。植物NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成中也發(fā)揮著重要作用。番木瓜的果實成熟過程中，番木瓜轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)類胡蘿卜素的生物合成[11]。在菠蘿的成熟過程中基因?qū)麑嵉男纬珊桶l(fā)育有促進(jìn)作用而且參與到逆境脅迫響應(yīng)[12]。植物NAC轉(zhuǎn)錄因子在非生物逆境方面功能明顯，一直是現(xiàn)在研究的熱點。在高鹽處理下，火龍果的上調(diào)表達(dá)[13]，水稻通過促進(jìn)根系發(fā)育提高過表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花的耐旱耐鹽性[14]；油茶基因的表達(dá)模式與其抗旱性有關(guān)[15]。在模擬干旱和高鹽脅迫處理下，梭梭表達(dá)量均顯著上調(diào)[16]。大麥基因的過表達(dá)使其在干旱脅迫下氣孔阻力增加，通過保證充足的光合作用提高抗旱性[17]。在低溫環(huán)境下甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子有25個NAC基因差異表達(dá)[18]，蘋果基因負(fù)調(diào)控蘋果的抗冷能力[19]。

芒果（L.）屬于漆樹科芒果屬喬木，芒果營養(yǎng)豐富深受消費者的青睞，素有“熱帶水果之王”美稱[20]。非生物脅迫影響芒果的生長發(fā)育、產(chǎn)量以及果實品質(zhì)。前期研究中，本課題組從‘四季蜜芒’中分離獲得了1個基因，表達(dá)模式分析顯示其在低溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)其表達(dá)，推測其可能在芒果逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用[21]。本研究構(gòu)建了基因的過量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到模式植物哥倫比亞野生型擬南芥中，采用干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫以驗證過量表達(dá)基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

逆境脅迫材料種植于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院標(biāo)本園，擬南芥為哥倫比亞型擬南芥（wild type, WT）保存于本實驗室。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定 將前期課題組已經(jīng)構(gòu)建好的過量表達(dá)載體pBI121-MiNAC1，通過花期侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥[22]。收取種子后，播種在1/2 MS（50 mg/L Kan）培養(yǎng)基上，篩選出陽性植株。待長至4片真葉時，移栽到基質(zhì)中在長日照條件下進(jìn)行培育。提取陽性苗DNA進(jìn)行PCR檢測，檢測引物為載體公用引物35SFu和基因特異引物MiNAC1d，對于檢測為陽性的植株進(jìn)行繼續(xù)培育，直到獲得T3代純合植株。

轉(zhuǎn)基因植株半定量檢測：利用HiPure HP Plant RNA Mini Kit試劑盒提取T3代擬南芥葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋cDNA濃度為100 ng/μL。以擬南芥為內(nèi)參基因，芒果以qNAC1u（上游引物）和qNAC1d（下游引物）為特異引物，參考WANG等[23]的方法進(jìn)行半定量檢測，檢測芒果基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 本研究所用引物序列

1.2.2 過量表達(dá)擬南芥株系的表型分析 在長日照條件下以WT為對照，觀察轉(zhuǎn)入芒果基因?qū)M南芥生長發(fā)育的影響。

1.2.3 過量表達(dá)擬南芥株系的逆境處理 逆境脅迫處理，將播種6 d的幼苗（WT、OE2、OE7、OE9）分別移栽到經(jīng)過不同逆境脅迫處理的1/2 MS培養(yǎng)基上。干旱脅迫：0、200、300、400 mmol/L的甘露醇處理；鹽脅迫：0、100、150、200 mmol/L的NaCl處理。干旱脅迫和鹽脅迫苗在22℃培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)。低溫脅迫：將苗置于22℃（常溫）和4℃（低溫）條件下進(jìn)行處理。參考張辰明等[24]的方法，每個處理重復(fù)3次，處理10 d后對擬南芥主根長、側(cè)根數(shù)（長于5 mm的根）及根冠比進(jìn)行測量并拍照記錄。根冠比=根鮮重÷鮮葉重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥轉(zhuǎn)化與檢測

通過PCR檢測陽性植株是否轉(zhuǎn)入目標(biāo)基因，結(jié)果見圖1A，轉(zhuǎn)基因陽性植株均可以擴(kuò)增出目標(biāo)大小的條帶，說明轉(zhuǎn)化成功。提取轉(zhuǎn)基因和對照擬南芥的葉片總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測基因的表達(dá)量，結(jié)果見圖1B，結(jié)果表明基因在轉(zhuǎn)基因株系OE2、OE7和OE9植株中可以正常表達(dá)，而在WT和轉(zhuǎn)空載體植株中不表達(dá)。

A：轉(zhuǎn)MiNAC1擬南芥陽性植株P(guān)CR檢測；B：對照和轉(zhuǎn)MiNAC1擬南芥的半定量檢測；C：過量表達(dá)MiNAC1擬南芥的表型分析。

2.2 過量表達(dá)的MiNAC1對擬南芥生長發(fā)育的影響

對T3代純合株系的蓮座葉、抽薹時間和開花時間以及開花時的植株高度與對照植株進(jìn)行比較觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)芒果基因?qū)M南芥的葉片形態(tài)、開花時間等表型沒有明顯的影響（圖1C）。

2.3 過量表達(dá)的MiNAC1對擬南芥干旱脅迫的影響

本研究采用不同濃度甘露醇處理過量表達(dá)的株系（OE2、OE7、OE9）并測其根長、側(cè)根數(shù)與根冠比。在0 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)下過量表達(dá)的株系與WT之間的根長沒有明顯差異。隨著甘露醇濃度的增大，WT與過量表達(dá)的株系的生長發(fā)育均受到抑制，葉片發(fā)黃變小，葉柄狹長，根長漸短，側(cè)根增多。但過表達(dá)株系受到的抑制相對于WT較?。▓D2A～圖2D）。在200、300、400 mmol/L濃度的甘露醇處理時，過量表達(dá)株系的根長比WT顯著增長（圖2E），側(cè)根數(shù)顯著增多（圖2F），根冠比顯著增大（圖2G）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)芒果基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的抗性。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.4 過量表達(dá)的MiNAC1對擬南芥鹽脅迫的影響

本研究采用不同濃度NaCl處理WT與過量表達(dá)的株系（OE2、OE7和OE9）并測其根長、側(cè)根數(shù)與根冠比。在0 mmol/L NaCl的處理下過量表達(dá)的株系與WT之間的根長，側(cè)根數(shù)與根冠比沒有明顯差異，隨著NaCl濃度的增大，WT與過量表達(dá)的株系的生長發(fā)育均受到抑制，表現(xiàn)出葉片發(fā)黃變白，根長漸短，側(cè)根增多的現(xiàn)象。但過量表達(dá)的的生長發(fā)育受到的抑制不明顯（圖3A～圖3D）。在100、150、200 mmol/L濃度的NaCl的處理下，過量表達(dá)的的根長比WT的顯著增長（圖3E），側(cè)根數(shù)顯著增多（圖3F），根冠比顯著增大（圖3G）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)芒果株系可以顯著提高擬南芥對鹽脅迫的抗性。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.5 過量表達(dá)的MiNAC1對擬南芥低溫脅迫的影響

本研究采用常溫22℃和低溫4℃處理WT與過量表達(dá)的株系（OE2、OE7、OE9）并測其根長、側(cè)根數(shù)與根冠比。在常溫22℃培養(yǎng)中，過量表達(dá)的株系和WT的生長發(fā)育均受到影響，在低溫4℃處理下，過量表達(dá)的株系和WT表現(xiàn)出葉片小而厚，葉莖發(fā)紅，植株生長弱小的現(xiàn)象，但是過量表達(dá)的株系受低溫抑制的不明顯（圖4A、圖4B、圖4C）。在4℃的培養(yǎng)下，過量表達(dá)的株系的根長較WT的顯著增長（圖4C），側(cè)根數(shù)顯著增加（圖4F），根冠比顯著增加（圖4G）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)芒果株系可以顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對低溫的抗性。

3 討論

植物的生長發(fā)育受到非生物脅迫的影響，嚴(yán)重降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫是造成農(nóng)作物損失最嚴(yán)重的非生物脅迫[25-26]。植物遭到脅迫后打破正常的生理代謝狀態(tài)，以適應(yīng)脅迫下的環(huán)境[27]，比如沙芥幼苗根系的主根長、主根體積和根冠比隨著干旱脅迫天數(shù)的延長不斷增加[28]。轉(zhuǎn)細(xì)葉百合基因的煙草幼苗在鹽脅迫下其根長、鮮重和長勢顯著好于對照[29]。NAC轉(zhuǎn)錄因子對植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[30]。植物NAC轉(zhuǎn)錄因子是一個大的基因家族，在應(yīng)對逆境脅迫的功能方面一直被廣泛關(guān)注。在前期研究中，課題組從芒果中分離克隆了一個基因，表達(dá)模式分析顯示，低溫、鹽脅迫和干旱脅迫均影響其表達(dá)，說明基因與芒果的逆境脅迫應(yīng)答有關(guān)[21]。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

不同物種的基因均可以使其轉(zhuǎn)基因植株提高對逆境脅迫的抗性，比如將水稻O基因轉(zhuǎn)入棉花，過量表達(dá)的棉花在干旱和高鹽脅迫下蒸騰速率下降，根系發(fā)育增強(qiáng)，提高了過量表達(dá)棉花的耐旱和耐鹽性[14]。在干旱和鹽脅迫培養(yǎng)下，過量表達(dá)的水仙基因可以提高煙草對干旱和鹽脅迫的抗性[31]。番茄的表達(dá)模式分析顯示其不但受干旱脅迫、鹽脅迫和細(xì)菌病原體的誘導(dǎo)，與煙草空載相比在干旱和鹽脅迫下過表達(dá)株系還表現(xiàn)出更多側(cè)根數(shù)量和更長的根長[32]。說明植物在遭受逆境脅迫時通過增加主根的長度和須根的數(shù)量來應(yīng)對逆境脅迫[33]，本研究中，將芒果基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，在干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和對照擬南芥的根系生長均受到抑制，但轉(zhuǎn)基因擬南芥植株受到的抑制效應(yīng)顯著小于WT植株，而側(cè)根數(shù)和根冠比也都大于WT，說明轉(zhuǎn)芒果基因可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫的抗性。

本研究中過表達(dá)擬南芥的主根增長，側(cè)根數(shù)目顯著增加，提高了株系的生物產(chǎn)量，且根冠比增大。說明芒果基因可以參與干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫的應(yīng)答，具有提高芒果抗逆性的運用潛能。

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Functional Analysis of aGene in Mango

YANG Xiaozhou*, ZHOU Shaoli*, HE Xinhua**, LIU Yuan, YU Haixia, LU Tingting, WANG Zhuo,LUO Cong**

State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources / National Demonstration Center for Experimental Plant Science Education / College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China

NAC transcription factors play important roles in the response to abiotic stress in plants. Studying the function of the mangogene may provide genetic resources for mango stress tolerance breeding. Abiotic stresses such as drought, salt and low temperature affect the growth and development of mango. In a previous study, agene was obtained from the transcriptome of mango stress samples, and the expression pattern analysis showed that it was related to the stress response of mango. In this study, the function of the mangogene was verified. The pBI121-MiNAC1 overexpression vector was constructed and transferred into the model plant. The T3 homozygous lines were used for phenotypic observation and stress treatment. The results showed that the phenotypes of the transgenic mangogene and WT wild-typewere similar with each other. The transgenic mangogene did not affect the number of rosette leaves, bolting time, flowering time and plant height at flowering. Transgenic and WTwere treated with Mannitol (0, 200, 300, 400 mmol/L), salt (0, 100, 150, 200 mmol/L) and low temperature stress at 4℃, respectively. Stress treatment was performed by comparing the changes in root length, lateral root number and root crown ratio with the transgenic and control plants. Under drought stress treatment, the root length of WT and transgenic plants was obviously inhibited with the concentration increase of mannitol treatment, but the degree of inhibition was significantly lower in transgenic lines than that of WT plants. The lateral root number increased, but the transgenic plants were significantly higher than that of WT plants. In addition, the root crown ratio of transgenic plants was also significantly higher than that of control plants. For example, under 300 mmol/L mannitol treatments, the root length increased significantly, with OE9 was 1.51 times longer than that of WT. The number of lateral roots increased significantly, with OE7 having 5 times more lateral roots than that of WT. The root crown ratio was significantly higher in transgenic plants than that in control plants, and that in OE2 was 1.53-fold higher than that of WT. Similar results were obtained under salt stress and low temperature stress. These results indicated that transgenic mangogene could improve the resistance of transgenic plants to drought stress, salt stress and low temperature stress by increasing root length and lateral root number. This study initially revealed the function ofgene, and laid a foundation for further study ofgene involved in regulating the regulatory network of mango stress.

mango; transcription factor;; abiotic stress; functional analysis

S667.7

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.08.001

2022-01-25；

2022-03-04

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西芒果創(chuàng)新團(tuán)隊栽培與病蟲害防治崗位項目（No. nycytxgxcxtd-2021-06-2）；廣西自然科學(xué)基金項目（No. 2014GXNSFBA118102）；科技先鋒隊‘強(qiáng)農(nóng)富農(nóng)’‘六個一’專項行動（No. 202204）。

楊小州（1991—），男，碩士研究生，研究方向：果樹分子生物學(xué)；*同等貢獻(xiàn)作者：周少麗（1997—），女，本科生，研究方向：果樹分子生物學(xué)。**通信作者（Corresponding author）：何新華（HE Xinhua），E-mail：honest66222@163.com；羅 聰（LUO Cong），E-mall：22003luocong@163.com。