LmNotch基因在飛蝗翅發(fā)育中的功能分析

徐子龍，張福斌，武兆辰，張 晶,，張建珍，趙小明*

（1. 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2. 山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006）

昆蟲是世界上數(shù)量最多、種類最大的生物類群，也是唯一一種進(jìn)化出了飛行能力的無脊椎動(dòng)物。翅在昆蟲遷飛、求偶、覓食和躲避敵害等方面具有重要作用[1]。昆蟲的翅是由外胚層發(fā)育而來，完全變態(tài)昆蟲是由保留在幼蟲體內(nèi)的器官芽經(jīng)過完全變態(tài)發(fā)育成為完整的翅，如黑腹果蠅Drosophila melanogaster等；漸變態(tài)昆蟲則由若蟲的“翅芽”經(jīng)過不完全變態(tài)發(fā)育成為完整的翅，如飛蝗Locusta migratoria等[2]。因此，對(duì)昆蟲翅發(fā)育過程的研究將有助于了解昆蟲的變態(tài)。昆蟲翅發(fā)育的控制是一個(gè)非常精確和復(fù)雜的過程。目前，對(duì)昆蟲翅發(fā)育機(jī)制的研究主要來自黑腹果蠅[3]。在果蠅中，翅的發(fā)育受到 Decapentaplegic（Dpp）、Wingless（Wg）、Hedgehog（Hh）、Hippo、Notch以及JNK等信號(hào)通路的調(diào)控[4-6]，而且在許多不同的動(dòng)物中，這些信號(hào)通路在進(jìn)化上是高度保守的。目前，在很多模式昆蟲中這些信號(hào)通路中的一些影響翅發(fā)育的關(guān)鍵基因已被鑒定出來，如黑腹果蠅和赤擬谷盜Tribolium castaneum等[7-10]。

Notch信號(hào)通路在動(dòng)物中是高度保守的，在細(xì)胞發(fā)育過程中控制細(xì)胞命運(yùn)，并維持成體組織的穩(wěn)態(tài)[11,12]。Notch信號(hào)通路主要由Notch受體、Notch配體、轉(zhuǎn)錄因子、其他效應(yīng)子與Notch調(diào)節(jié)分子構(gòu)成[13]。其激活依賴于一個(gè)細(xì)胞膜上的配體與相鄰細(xì)胞的 Notch受體結(jié)合，這種結(jié)合使得 Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 NICD（intracellular domain of Notch）釋放，之后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，調(diào)控其下游的基因表達(dá)[14,15]。Notch是一個(gè)300 kDa的單次跨膜蛋白，由一個(gè)大的胞外區(qū)域、一個(gè)單一的跨膜部分和一個(gè)小的胞內(nèi)區(qū)域組成[16]，其中胞外結(jié)構(gòu)域由多個(gè)數(shù)量不同的EGF（epidermal growth factor）重復(fù)單元、3個(gè)Lin12/Notch repeats（LNRs）和一個(gè)鄰近跨膜結(jié)構(gòu)域組成，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)RAM（recombination binding protein-J-associated molecule）區(qū)域、7個(gè)錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域（Ankyrin）、一個(gè)TAD反激活區(qū)域（transactivation domain）和一個(gè)C末端區(qū)域[11]。在昆蟲翅發(fā)育研究中，Notch信號(hào)通路直接參與果蠅背部翅原基邊界的形成以及翅細(xì)胞的增殖分化[17]。然而，在非模式昆蟲中翅發(fā)育相關(guān)基因的鑒定及功能仍不清楚。

飛蝗是一種典型的漸變態(tài)昆蟲，也是世界性農(nóng)業(yè)害蟲。本文以Notch信號(hào)通路受體為研究對(duì)象，探討其在飛蝗翅發(fā)育中的功能，以期為漸變態(tài)昆蟲翅發(fā)育機(jī)制研究提供理論依據(jù)，同時(shí)為蝗蟲防治尋找新分子靶標(biāo)，從而為蝗災(zāi)生物防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用飛蝗蟲卵保存于本實(shí)驗(yàn)室的昆蟲飼養(yǎng)室，于人工孵化箱中孵化后移至干凈的紗籠中，每天喂食新鮮的小麥幼苗（3齡后輔以麥麩），待其生長(zhǎng)至5齡后進(jìn)行試驗(yàn)。培養(yǎng)溫度為（30±2）℃，濕度為（40±10）%。

1.2 相關(guān)試劑

RNA提取試劑（RNAiso Plus）購于大連寶生物公司（TaKaRa）；雙鏈RNA合成試劑盒購于Promega公司；膠回收試劑盒購于天根公司（TIANGEN）；HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper），ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 cDNA序列獲取及聚類分析

基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫，搜索得到LmNotch基因的cDNA序列。將其cDNA序列翻譯成氨基酸序列，并對(duì)其編碼蛋白的功能域進(jìn)行分析。下載人Homo sapiens、小鼠Mus musculus、黑腹果蠅D.melanogaster、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis、棉鈴蟲Helicoverpa armigera、赤擬谷盜T. castaneum、德國(guó)小蠊Blattella germanica等物種的Notch氨基酸序列，利用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，獨(dú)立分析1000次，數(shù)值代表bootstrap估算值。

1.4 總RNA的提取及表達(dá)特性分析

摘取5齡飛蝗第1～8 d（N5D1-N5D8）的翅芽（WP）組織，同時(shí)取5齡第6 d的若蟲各個(gè)組織包括足（LG）、體壁（IN）、翅芽（WP）、脂肪體（FB）、前腸（FG）、中腸（MG）、后腸（HG）、胃盲囊（GC）、精巢（TE）、卵巢（OV）。利用RNAiso Plus提取總RNA，最終定量至0.5 μg/μL。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)LmNotch基因的特異性熒光定量引物（表1，由生工公司合成），以RPL-32為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR的方法檢測(cè)LmNotch的時(shí)期和組織表達(dá)情況，設(shè)置4次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析[18]。

表1 試驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in this experiment

1.5 RNA干擾和H&E染色

根據(jù)LmNotch的cDNA序列設(shè)計(jì)并合成帶有T7啟動(dòng)子序列的特異性引物（表1，由生工公司合成），以5齡若蟲翅芽cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度后利用膠回收試劑盒進(jìn)行膠純化。以1 μg膠回收產(chǎn)物為模板利用dsRNA合成試劑盒合成LmNotch基因的dsRNA（dsLmNotch），將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶后定量至2 μg/μL。選取24 h內(nèi)的5齡第1 d的飛蝗，對(duì)其注射dsLmNotch（注射數(shù)量為42只），每只的注射劑量為10 μg，同時(shí)注射等量的dsGFP（共47只）作為對(duì)照。取5齡第6 d（N5D6）的飛蝗翅芽組織，一部分用于沉默效率檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)取6組重復(fù)，每組設(shè)2次技術(shù)重復(fù)，另一部分用 3%戊二醛進(jìn)行固定。同時(shí)摘取對(duì)照組和處理組蛻皮前（N5D7）的翅芽，用 3%戊二醛固定，隨后送往武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行石蠟切片和H&E（伊紅和蘇木精）染色。剩余蟲子正常飼養(yǎng)進(jìn)行表型觀察。

1.6 LmNotch對(duì)其他翅發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

利用課題組飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，識(shí)別翅發(fā)育相關(guān)基因包括Dpp、Omb（optomotor-blind）、Salm（spalt major）、Salr（spalt related）、Yorkie以及翅特異表皮蛋白基因LmACP7、LmACP8、LmACP19。分別以RNA干擾的處理組和對(duì)照組個(gè)體翅芽組織cDNA為模板，利用qRT-PCR檢測(cè)其他翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，檢測(cè)引物見表1（由生工公司合成）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用2-ΔΔCt法對(duì)LmNotch基因在不同發(fā)育天數(shù)和不同組織中的相對(duì)表達(dá)量、RNA干擾后LmNotch沉默效率以及沉默LmNotch后翅發(fā)育相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，采用Studentt-test方法進(jìn)行差異表達(dá)分析（*P＜0.05表示差異顯著，**P＜0.01表示差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 LmNotch功能域及聚類分析

根據(jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫，搜索獲得LmNotch基因cDNA序列，該基因含有7455 bp開放閱讀框，編碼2484個(gè)氨基酸。通過對(duì)LmNotch基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其含有36個(gè)EGF（epidermal growth factor）重復(fù)單元、3個(gè)NL（Lin-12/Notch）結(jié)構(gòu)域、1個(gè)NOD（NOTCH protein domain）結(jié)構(gòu)域、1個(gè)NODP結(jié)構(gòu)域、7個(gè)ANK（Ankyrin repeats）結(jié)構(gòu)域和1個(gè)DUF3454（Domain of unknown function）區(qū)域（圖1A）。聚類分析顯示，Notch在物種間保守性較高，且LmNotch與蜚蠊目Notch聚為一支（圖1B）。

圖1 Notch蛋白結(jié)構(gòu)域與聚類分析Fig. 1 Phylogenetic and domain analysis of LmNotch

2.2 LmNotch在5齡飛蝗中的表達(dá)特性

利用qRT-PCR進(jìn)行LmNotch的表達(dá)特性檢測(cè)，結(jié)果顯示LmNotch在5齡若蟲翅芽發(fā)育第1～4 d的表達(dá)量較高（N5D1～N5D4），而在第5～8 d表達(dá)量較低（N5D5～N5D8）（圖2A）；LmNotch在足、翅芽、前腸和卵巢中有較高表達(dá)，而在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較低（圖2B）。

2.3 LmNotch生物學(xué)功能分析

對(duì)5齡第2 d的飛蝗注射dsLmNotch，以注射等量dsGFP的飛蝗為對(duì)照，取翅芽檢測(cè)沉默效率。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，處理組中LmNotch表達(dá)極顯著降低（圖3A）。表型觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組飛蝗均能蛻皮至成蟲，而注射dsLmNotch的飛蝗約70%無法完成蛻皮過程產(chǎn)生致死表型，另有10%的飛蝗能夠蛻至成蟲但出現(xiàn)翅紊亂表型（圖3B，3C）。分別對(duì)N5D6和N5D7的對(duì)照組和處理組飛蝗翅芽進(jìn)行石蠟切片和H&E染色分析，結(jié)果顯示，對(duì)照組中N5D6和N5D7翅芽舊表皮發(fā)生降解，形成大量新表皮并產(chǎn)生折疊，上下兩層新表皮間形成空腔，而處理組中翅芽舊表皮雖能夠正常降解但翅上下兩層表皮之間腔空間增大，新表皮無法完整形成（圖4）。

圖3 注射dsRNA后對(duì)LmNotch基因表達(dá)及飛蝗翅發(fā)育的影響Fig. 3 Effects of dsLmNotch on the expression of LmNotch and the wing development of L. migratoria

圖4 LmNotch沉默后的翅芽H&E染色觀察Fig. 4 The observation of wing pads stained by H&E staining at N5D6 and N5D7 after the silence of LmNotch

2.4 LmNotch影響翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

利用qRT-PCR檢測(cè)沉默LmNotch的表達(dá)后翅發(fā)育相關(guān)基因及翅特異表皮蛋白基因的表達(dá)，結(jié)果顯示Dpp、Omb、LmACP7和LmACP8基因的表達(dá)量顯著降低，而Yorkie和LmACP19的表達(dá)量顯著升高（圖5）。

圖5 沉默LmNotch后翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況Fig. 5 The expression of wing development genes detected by qRT-PCR after silencing of LmNotch

3 討論

本文基于飛蝗翅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得了Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵受體因子Notch。與其他物種Notch類似，飛蝗Notch含有EGF重復(fù)單元、Lin-12/Notch結(jié)構(gòu)域、NOD/NODP結(jié)構(gòu)域和ANK結(jié)構(gòu)域，且該蛋白在物種間高度保守（圖1），暗示其可能具有保守性功能。已有研究表明Notch在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成中的細(xì)胞分化增殖和凋亡具有重要作用[19]。如果蠅中，Notch的重復(fù)單元EGF-23到EGF-29發(fā)生單個(gè)氨基酸替換時(shí)，導(dǎo)致果蠅Notch信號(hào)的異常從而發(fā)生表型變化[20]。在哺乳動(dòng)物中，研究表明Notch信號(hào)通路對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等發(fā)育具有重要作用[21]。

在無脊椎動(dòng)物中，昆蟲是唯一有翅的生物類群。昆蟲翅的發(fā)育受到一系列信號(hào)通路的控制，如Hippo，Wingless，Dpp和 Notch等信號(hào)通路。在家蠶Bombyx mori中，干擾 Hippo信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄共激活因子BmYorkie3的表達(dá)能夠抑制翅生長(zhǎng)發(fā)育[22]。Dpp信號(hào)通路靶基因Sal（Salm和Salr）是飛蝗和果蠅翅生長(zhǎng)發(fā)育所必需的[23]。在飛蝗中，LmNotch在翅芽組織中高表達(dá)（圖2），可能參與飛蝗翅的發(fā)育。利用飛蝗對(duì)RNA干擾的敏感性，合成并向5齡若蟲注射LmNotch基因dsRNA，結(jié)果顯示LmNotch沉默效率達(dá)到90%以上，且沉默LmNotch的飛蝗個(gè)體出現(xiàn)蛻皮困難和翅紊亂的表型（圖3），表明LmNotch在飛蝗蛻皮和翅發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，但LmNotch如何影響飛蝗蛻皮和翅發(fā)育尚不清楚。據(jù)報(bào)道，Notch受體與配體Delta和/或Serrate結(jié)合后，會(huì)經(jīng)歷一系列的蛋白水解，從而產(chǎn)生Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD）[24]。NICD轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子Hairless和協(xié)同激活因子Mastermind結(jié)合，刺激下游靶基因的表達(dá)[25]。為了探討LmNotch在飛蝗翅發(fā)育中的下游靶基因，作者根據(jù)果蠅翅發(fā)育相關(guān)基因序列（Dpp，Omb，Salm，Salr和Yorkie）搜索獲得了飛蝗同源基因序列并檢測(cè)了沉默LmNotch表達(dá)后翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默LmNotch表達(dá)后Dpp和Omb表達(dá)顯著下降，Yorkie表達(dá)顯著上升，而Salm和Salr沒有顯著變化（圖5）。2014年，Djiane等[26]研究發(fā)現(xiàn)Notch能夠抑制果蠅翅原基中Yorkie的活性，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。同樣在果蠅翅發(fā)育研究中，Dpp對(duì)其下游基因omb起正調(diào)節(jié)的作用[27]，而在飛蝗中沉默LmNotch表達(dá)后能夠降低Dpp和Omb的表達(dá)。上述結(jié)果表明，LmNotch能夠調(diào)控Hippo和Dpp信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而影響翅的發(fā)育。

昆蟲翅的發(fā)育除了受一系列復(fù)雜的基因控制外，還依賴于細(xì)胞的一系列功能和細(xì)胞外基質(zhì)。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)飛蝗翅特異表皮蛋白基因（LmACP7，LmACP8和LmACP19）在翅表皮細(xì)胞外基質(zhì)形成和穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，這些基因的缺失可導(dǎo)致飛蝗翅發(fā)育異常[28-30]。本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默LmNotch表達(dá)后能夠顯著抑制LmACP7和LmACP8的表達(dá)，而促進(jìn)LmACP19的表達(dá)（圖5），這可能是導(dǎo)致翅表皮形成異常的原因之一（圖4），這些結(jié)果暗示LmNotch可能通過調(diào)控翅表皮蛋白基因的表達(dá)參與飛蝗翅表皮細(xì)胞外基質(zhì)的形成，然而其具體作用機(jī)制如何，還需要進(jìn)一步研究。