獼猴桃園區(qū)坡度和晴雨天對(duì)獼猴桃潰瘍病傳播的影響

汪 華，鄧思怡，劉 軍，常 威，程杰元，陳 琦，喻大昭#

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢430064；2. 華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430064；3. 浠水縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心植保站，浠水438200；4. 赤壁神山興農(nóng)科技有限公司，赤壁437300）

中國(guó)是獼猴桃原產(chǎn)地和世界上最大的獼猴桃生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1,2]。以“紅陽(yáng)”品種為主的紅心獼猴桃因其口感和品質(zhì)深受市場(chǎng)青睞。但該品種易感由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa）引起的潰瘍病[3-5]。該病害具有發(fā)生范圍廣、傳播迅速和防治難度大等特點(diǎn)[6]，在我國(guó)16個(gè)省份已造成嚴(yán)重危害[7,8]，成為制約獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外已從病原學(xué)、發(fā)生規(guī)律和治理辦法等多方面對(duì)該病進(jìn)行了研究。已有的結(jié)果表明該病病菌可在病株枝干、葉、芽、葉痕和田間病殘?bào)w上越冬，成為翌年初侵染源[9,10]。病菌主要借風(fēng)、雨、昆蟲(chóng)傳播，通過(guò)自然孔口和傷口侵染寄主[11]。其發(fā)展與溫度和濕度關(guān)系密切[12]。Serizawa和Ichikawa[13]研究表明春季旬平均氣溫在12 ℃～18 ℃時(shí)，病害發(fā)生嚴(yán)重，而氣溫超過(guò)25 ℃時(shí)，新病斑僅在陰涼雨濕條件下發(fā)生。但未見(jiàn)雨天是否促進(jìn)獼猴桃潰瘍傳播的報(bào)道。另外，前期獼猴桃園區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，園區(qū)陡坡區(qū)域的獼猴桃潰瘍病流行較為嚴(yán)重。為明確露地栽培獼猴桃園區(qū)坡度和晴、雨天對(duì)獼猴桃潰瘍病傳播的影響。本研究于2020年4月和2021年3月在獼猴桃園區(qū)的不同坡度區(qū)域和晴、雨環(huán)境下利用孢子捕捉器開(kāi)展病原捕集試驗(yàn)，記錄獼猴桃樹(shù)葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)，以此反映不同條件對(duì)病害傳播的影響，為該病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)品種為“紅陽(yáng)”紅心獼猴桃。植物基因組DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。中農(nóng)簡(jiǎn)易病菌孢子捕捉器由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制，專利號(hào)：ZL201410009269.6[14]。其進(jìn)氣倉(cāng)直徑10 cm、高度10 cm，頂部設(shè)有8個(gè)進(jìn)氣孔，進(jìn)氣孔長(zhǎng)3 cm、寬1 cm，捕捉倉(cāng)直徑10 cm、高度10 cm、底座長(zhǎng)12 cm、寬12 cm、高5 cm，底部風(fēng)扇直徑8 cm，出風(fēng)口為下方，鋰電池組（12 V，30 AH）供電裝置由深圳市勁風(fēng)科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 獼猴桃園區(qū)基本情況調(diào)查

2020年4月14日對(duì)湖北省赤壁市半島南獼猴桃園區(qū)18個(gè)種植紅陽(yáng)獼猴桃的棚區(qū)的栽培模式、地形環(huán)境以及潰瘍病的病情指數(shù)和病株率進(jìn)行了調(diào)查。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：全株無(wú)明顯病斑；1級(jí)：只有葉片可見(jiàn)明顯病斑，且病斑面積均未超過(guò)10%；2級(jí)：葉片、枝條均有明顯病斑，但病斑環(huán)繞枝條15%以下，主干無(wú)病斑或病斑面積低于25%；3級(jí)：枝條、葉片和主干均有明顯病斑，且主干病斑面積在25%～50%；4級(jí)：全株發(fā)病或死亡，或主干病斑面積高于50%。

1.3 獼猴桃潰瘍病菌捕集試驗(yàn)

2020年4月16—22日和2021年3月24—30日，根據(jù)發(fā)病情況和地勢(shì)環(huán)境，在10號(hào)棚架內(nèi)選擇了4塊試驗(yàn)地作為4個(gè)處理（如表1所示）。每處理設(shè)置3臺(tái)孢子捕捉器作為3個(gè)重復(fù)。蓄電池固定在獼猴桃植株中間的水泥支柱上，捕捉器固定在蓄電池上（圖1），捕捉器上部有進(jìn)氣倉(cāng)，下部有捕集倉(cāng)，底部有風(fēng)扇，將儀器周圍的空氣吸入倉(cāng)內(nèi)，使病原菌落到健康葉片上。

表1 孢子捕捉器在獼猴桃園內(nèi)不同地勢(shì)擺放坡度及排布方式Table 1 Slope and arrangement of pathogen traps in different terrains in kiwi orchard

圖1 孢子捕捉器在獼猴桃園區(qū)不同地勢(shì)的擺放位置Fig. 1 Trap positions in each treatment in different terrains in the orchard

獼猴桃潰瘍病菌捕集操作步驟：（1）早上7點(diǎn)左右，在“紅陽(yáng)”獼猴桃試驗(yàn)棚，用75%酒精消毒的剪刀，采集大、小葉位一致的健康獼猴桃葉片備用；在室內(nèi)用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡葉片1 min，無(wú)菌水漂洗兩遍，滅菌紗布吸干葉片表面水分，將葉柄剪至1 cm長(zhǎng)，用2 cm×3 cm的滅菌紗布將葉柄部位包住，備用。（2）將雙層無(wú)菌濾紙放入直徑9 cm的塑料培養(yǎng)皿中，添加無(wú)菌水至濾紙潤(rùn)濕。然后，將步驟1處理好的葉片放入其中。（3）將孢子捕捉器底部電源斷開(kāi)，打開(kāi)捕捉器進(jìn)氣倉(cāng)，將盛放有上述葉片的培養(yǎng)皿置于捕捉器倉(cāng)底部，蓋上進(jìn)氣倉(cāng)，接通電源。（4）孢子捕捉器捕集24 h后，取出培養(yǎng)皿中葉片，放入有無(wú)菌濕潤(rùn)濾紙的磁盤(pán)中，同時(shí)用健康獼猴桃葉片做陰性對(duì)照。磁盤(pán)上用透明封口膜保濕。當(dāng)葉片出現(xiàn)褪綠小點(diǎn)或不規(guī)則的褐色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)周圍有黃色暈圈且黃色暈圈連續(xù)3 d擴(kuò)大時(shí)，把第1 d觀察到黃色暈圈的時(shí)間定義為開(kāi)始顯癥時(shí)間，把該時(shí)間與葉片采集日之間的時(shí)間差定義為顯癥所需時(shí)長(zhǎng)。（5）把確定顯癥所需時(shí)長(zhǎng)后的葉片用干濾紙將葉片分開(kāi)包裹，放入自封袋中，置于4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)顯癥葉片的病原菌分子鑒定，以確認(rèn)該病斑為由潰瘍病菌所致。（6）連續(xù)7 d，記錄當(dāng)日天氣情況，包括溫度、濕度、晴雨天。

1.4 潰瘍病斑的分子鑒定

用植物基因組DNA提取試劑盒提取獼猴桃顯癥葉片和健康葉片（陰性對(duì)照）的DNA。利用獼猴桃潰瘍病菌特異性引物（上游引物PsaF1：5′-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3′和下游引物PsaR2：5′-CAC GCACCCTTCAATCAGGATG-3′）[15]鑒定獼猴桃發(fā)病葉片是否為潰瘍病菌所致。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL:無(wú)菌水9.5 μL，Master mix 12.5 μL，DNA 1.0 μL，引物 PsaF1/PsaR2各 1.0 μL。PsaF1/R2進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增條帶大小為280 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。分別對(duì)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。PCR擴(kuò)增片段送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序得到的序列在 NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行Blast檢索比對(duì)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Office Excel軟件對(duì)各試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。利用SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析，利用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃園區(qū)基本情況調(diào)查

為了選取合適的試驗(yàn)區(qū)域，對(duì)所選獼猴桃園區(qū)的地勢(shì)和潰瘍病發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果顯示園區(qū)發(fā)病棚區(qū)病情指數(shù)低于30的有4個(gè)，介于30～50之間的棚區(qū)有6個(gè)，超過(guò)50的棚區(qū)有8個(gè)（表2）。其中，8、16、17和18號(hào)的區(qū)域?yàn)槠降?，病情指?shù)均明顯低于有斜坡區(qū)域，表明不同地勢(shì)可能影響病害的傳播。本試驗(yàn)選擇靠近路邊，方便通行，植株長(zhǎng)勢(shì)一致，且包括不同坡度的10號(hào)棚架作為后續(xù)試驗(yàn)區(qū)域。

表2 獼猴桃園區(qū)情況調(diào)查T(mén)able 2 Investigation of the kiwifruit orchard

2.2 坡度對(duì)獼猴桃潰瘍病菌傳播的影響

2020年和2021年對(duì)獼猴桃園區(qū)試驗(yàn)地的坡頂和坡底（10°）、坡上（45°）和坡下（30°）進(jìn)行病原菌捕集，結(jié)果均表明在坡底和坡頂（10°）進(jìn)行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)比在坡上（45°）和坡下（30°）進(jìn)行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)長(zhǎng)1～2 d（圖2A，B），表明30°至45°陡坡區(qū)域有利于獼猴桃潰瘍病的傳播。

圖2 不同坡度捕集病原菌的獼猴桃葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)Fig. 2 Length of time necessary to show symptoms in kiwi leaves placed inside pathogen traps at different slope areas

2.3 晴、雨天對(duì)獼猴桃潰瘍病傳播的影響

2020年和2021年分別連續(xù)7 d調(diào)查了天氣情況對(duì)發(fā)病的影響結(jié)果表明，2020年4月18日和4月20日雨天導(dǎo)致溫度低濕度高，獼猴桃葉片7～8 d即可發(fā)病，而晴天獼猴桃葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)為10～12 d（圖3A）。2021年3月27日、3月29日和3月30日雨天也表現(xiàn)出同樣的結(jié)果（圖3B）。因此，表明雨天導(dǎo)致的低溫高濕環(huán)境利于潰瘍病的傳播。

圖3 晴、雨天捕集病原菌的獼猴桃葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)Fig. 3 Time length necessary to show symptoms in kiwi leaves placed inside pathogen traps on sunny and raining days

2.4 獼猴桃顯癥葉片的病原菌分子鑒定

通過(guò)獼猴桃潰瘍病菌特異性引物Psa F1/Psa R2 進(jìn)行的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，作為陰性對(duì)照的健康葉片DNA未擴(kuò)增出條帶，顯癥葉片DNA則擴(kuò)增出280 bp大小的條帶。對(duì)所有擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序，并經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast檢索比對(duì)，結(jié)果顯示所有發(fā)病葉片為Psa侵染所致。

3 討論

有研究表明，雨水可能是獼猴桃潰瘍病菌中短距離傳播的重要途徑[11,16,17]，但并沒(méi)有量化研究。本研究通過(guò)病原捕集，并以葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)明確了雨天環(huán)境對(duì)獼猴桃潰瘍病傳播的影響，證明雨天進(jìn)行病原捕集后葉片顯癥所需時(shí)長(zhǎng)最短（7～8 d）。而晴天回收的葉片，顯癥時(shí)長(zhǎng)通常為10～12 d。其原因可能在于雨天利于潰瘍病菌的增殖，群體數(shù)量增加后致傳播量加大。但也可能與雨水促進(jìn)了病原菌的定殖和侵染有關(guān)。無(wú)論如何，雨水是可以促進(jìn)該病的擴(kuò)散。因此，避雨栽培應(yīng)可能成為獼猴桃潰瘍病防控的有效手段。地勢(shì)較為平坦的棚架發(fā)病情況和病株率相對(duì)較輕，進(jìn)行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥時(shí)間較長(zhǎng)。試驗(yàn)中，在坡底（10°）進(jìn)行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時(shí)間最長(zhǎng)，而在45°陡坡進(jìn)行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時(shí)間最短。這可能是因?yàn)槎钙卤绕降亟邮樟烁囡L(fēng)帶來(lái)的病原菌，并在葉片上集聚，增加了病原菌的接種勢(shì)。因此，地形上的隔離對(duì)該病的防控有一定的意義。本研究首次借助孢子捕捉器直接證實(shí)了園區(qū)陡坡區(qū)域和雨天環(huán)境可以促進(jìn)獼猴桃潰瘍病的流行，為后續(xù)防治方法和防治策略的制訂提供了依據(jù)。