中生菌素和納他霉素復(fù)配制劑防治番茄灰霉病的協(xié)同增效作用

紀(jì)林東，馬 超，徐 軍,2，趙宜君,2，張彥輝，段小莉，楊 洋，陳 昶,2*

（1. 河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司，北京 100193；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

番茄灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的番茄病害，主要發(fā)生在花期和結(jié)果期，對(duì)花、果實(shí)、葉片和莖造成危害。番茄灰霉病的發(fā)生時(shí)間較早，持續(xù)時(shí)期也比較長(zhǎng)，造成的損失極大[1]。發(fā)病后可造成早春大量爛果，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重的地塊甚至高達(dá)50%左右。該病在采后的儲(chǔ)藏運(yùn)輸過程中也可繼續(xù)造成嚴(yán)重危害[1]。目前，化學(xué)藥劑依然是防治番茄灰霉病的主要用藥，但多年用藥導(dǎo)致灰霉病菌對(duì)市售常用殺菌劑的抗藥性不斷增加。

中生菌素是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原生物防治研究所研制的一種農(nóng)用抗生素，是由淡紫灰鏈霉菌海南變種產(chǎn)生的一種抗生素，屬N－糖苷類堿性水溶性物質(zhì)[2]，可通過抑制病原細(xì)菌蛋白質(zhì)肽鍵的合成以及抑制真菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)而發(fā)揮較好的抑菌作用，具有觸殺和滲透作用。Ren等[3]明確了中生菌素對(duì)茶樹葉斑病病原菌上的作用機(jī)制，表明中生菌素可誘導(dǎo)細(xì)胞器、隔膜和胞外多糖的形態(tài)變化，以核糖體為靶點(diǎn)干擾翻譯，在信使 RNA和蛋白質(zhì)水平上影響菌絲部分蛋白的生物合成。目前，農(nóng)民開始嘗試使用中生菌素防治番茄灰霉病，但對(duì)其室內(nèi)毒力及作用機(jī)理尚不明確。納他霉素是一種無臭、無味、低劑量且安全性高的食品防腐劑，是由納他鏈霉菌發(fā)酵制得的一種白色至乳白色的無臭無味結(jié)晶粉末，通常以烯醇式結(jié)構(gòu)存在。它的作用機(jī)理是與真菌的麥角甾醇以及其他甾醇基團(tuán)結(jié)合，阻遏麥角甾醇生物合成，從而使細(xì)胞膜畸變，最終導(dǎo)致滲漏，引起細(xì)胞死亡[4]。該藥物對(duì)灰霉病具有一定防治效果，張鵬[5]明確了其對(duì)灰葡萄孢的作用機(jī)理，主要是降低細(xì)胞膜中麥角甾醇的含量，影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成內(nèi)容物的滲漏抑制菌絲生長(zhǎng)。

對(duì)具有不同作用機(jī)理的生物農(nóng)藥進(jìn)行復(fù)配，有希望進(jìn)一步提升生物農(nóng)藥的作用效果。將中生菌素和其他農(nóng)藥進(jìn)行復(fù)配也是當(dāng)前農(nóng)藥行業(yè)研究的熱點(diǎn)之一[6]。本文選取阻止真菌麥角甾醇合成的納他霉素與抑制病原菌蛋白質(zhì)合成的中生菌素進(jìn)行復(fù)配，通過室內(nèi)毒力測(cè)定和田間試驗(yàn)探究二者防治番茄灰霉病菌的協(xié)同增效作用，為復(fù)配生物農(nóng)藥的研發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、藥劑和培養(yǎng)基等

供試菌株：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥課題組提供。

供試器材：顯微鏡，培養(yǎng)箱，電子天平，凹玻片，載玻片，計(jì)數(shù)器等。

供試藥劑：10%中生菌素母藥，福建凱立生物制品有限公司；98%納他霉素，上海麥克林生化科技有限公司；復(fù)配制劑1：3%中生菌素·納他霉素可濕性粉劑（簡(jiǎn)稱WP），中生菌素:納他霉素=9:1；復(fù)配制劑2：3%中生菌素·納他霉素WP，中生菌素:納他霉素=1:1；復(fù)配制劑3：3%中生菌素·納他霉素WP，中生菌素:納他霉素=7:3，3%中生菌素WP，3%納他霉素WP，自制。

菌懸液：用去離子水沖洗在番茄灰霉病菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生的孢子，制取106孢子/mL菌懸液，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同混和藥劑對(duì)灰霉病菌的抑制作用 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[7]檢測(cè)混和藥劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)作用。通過預(yù)試驗(yàn)確定中生菌素、納他霉素和它們的各比例復(fù)配藥劑對(duì)番茄灰霉病菌的濃度梯度均為2、4、6、8、10 μg/mL。將中生菌素與納他霉素預(yù)先配置成9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的5個(gè)不同比例母液，將不同濃度母液與PDA混和，配制成終濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的培養(yǎng)基，將直徑5 mm的番茄灰霉病菌菌餅接種于上述含藥PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)4 d。每個(gè)濃度3個(gè)培養(yǎng)皿，該試驗(yàn)重復(fù)2次。計(jì)算不同濃度藥劑對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率和EC50，抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

用SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50。采用Wadley法進(jìn)行增效作用評(píng)價(jià)[8]。當(dāng)增效系數(shù)SR＞1.5為增效作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR＜0.5為拮抗作用。具體公式如下：

式中：A和B分別代表兩種藥劑，a和b分別代表兩種藥劑在混劑中所占比例，obs為測(cè)定值，EXP為理論值。

1.2.2 孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn) 采用凹玻片法[9]檢測(cè)不同比例復(fù)配藥劑對(duì)番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)抑制率。設(shè)置藥劑比例和濃度與1.2.1相同。

1.2.3 田間藥效試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于河北省廊坊市九州鎮(zhèn)冷棚進(jìn)行，番茄品種為普羅旺斯（廣東金作農(nóng)業(yè)科技有限公司），每畝定植約3000株，該地區(qū)種植番茄10年，灰霉病連年發(fā)生，栽培品種一致，長(zhǎng)勢(shì)相同，水肥管理水平一致，符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理，藥劑為500倍稀釋的中生菌素、納他霉素、中生菌素和納他霉素可濕性粉劑復(fù)配制劑1、2、3，各制劑中藥劑總含量為3%，其中復(fù)配制劑1、2、3中生菌素與納他霉素含量配比為9:1、1:1和7:3，對(duì)照為清水。每個(gè)處理小區(qū)10 m2，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。用15 L高品質(zhì)壓力噴壺均勻施藥，每個(gè)處理間隔7 d施藥一次，連續(xù)施藥兩次，第二次施藥7 d后從每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取3株調(diào)查全部果實(shí)和葉片發(fā)病情況。根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算防病效果。葉片病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：沒有病斑；1級(jí)：病斑面積低于整個(gè)葉面積的5%；3級(jí)：病斑面積大于等于5%，低于10%；5級(jí)：病斑面積大于等于10%，低于20%；7級(jí)：病斑面積大于等于 20%，低于50%；9級(jí)：病斑面積大于50%。番茄果實(shí)病害分級(jí)方法[10]：0級(jí)：沒有病斑；1級(jí)：殘留的花瓣或柱頭發(fā)?。?級(jí)：柱頭發(fā)病蔓延到果臍部或萼片發(fā)生腐爛；5級(jí)：果臍部有潤(rùn)濕斑沒有霉層；7級(jí)：果臍部有霉層但沒有蔓延到其他部分；9級(jí)：霉層由果臍擴(kuò)展到果的其他部分。

式中：ID為病情指數(shù)；Nn為各級(jí)病葉/果數(shù)；n為相對(duì)級(jí)數(shù)值；Nt為調(diào)查總?cè)~/果數(shù)。P為防治效果，%；CK0為空白對(duì)照區(qū)施藥前病情指數(shù)；CK1為空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)；PT0為藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)；PT1為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配制劑對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

中生菌素與納他霉素均對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)有著較好的抑制作用，EC50分別為1.9405和6.1186 μg/mL，中生菌素對(duì)番茄灰霉病的毒力優(yōu)于納他霉素。當(dāng)中生菌素與納他霉素比例為 9:1和 1:1時(shí)，增效系數(shù)SR＞1.5，表現(xiàn)為增效作用；中生菌素與納他霉素比例為7:3、3:7和1:9時(shí)，0.5≤SR≤1.5，表現(xiàn)為相加作用（表1）。

2.2 復(fù)配制劑對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)表明，中生菌素和納他霉素單劑對(duì)番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)抑制效果均較好，EC50分別為5.2137和8.8219 μg/mL，中生菌素優(yōu)于納他霉素。當(dāng)中生菌素與納他霉素比例為9:1、7:3和1:1時(shí)，增效系數(shù)SR＞1.5，表現(xiàn)為增效作用；中生菌素與納他霉素比例為3:7和1:9時(shí)，0.5≤SR≤1.5，表現(xiàn)為相加作用（表2）。

表2 中生菌素和納他霉素復(fù)配制劑對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制及增效作用Table 2 Synergistic inhibition of Zhongshengmycin and Natamycin on the conidial germination of B. cinerea

2.3 復(fù)配制劑對(duì)番茄灰霉病的田間藥效

2.3.1 復(fù)配制劑對(duì)番茄葉片灰霉病的田間藥效 中生菌素和納他霉素單劑及其不同比例復(fù)配的可濕性粉劑對(duì)番茄葉片灰霉病的防效如表3所示。中生菌素和納他霉素單劑配方的500倍液防效較差，分別為53.80%和44.37%。5種不同比例的復(fù)配制劑對(duì)番茄葉片灰霉病的防效存在顯著性差異，當(dāng)中生菌素與納他霉素質(zhì)量比為9:1和1:1時(shí)，對(duì)番茄葉片灰霉病防效顯著高于單劑和其他比例，具有增效作用，防效分別為81.04%和74.00%。

表3 中生菌素與納他霉素復(fù)配制劑對(duì)番茄葉部灰霉病的田間防效Table 3 Efficacies of Zhongshengmycin and Natamycin mixture in control of gray mold of tomato leaves in fields

2.3.2 復(fù)配制劑對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的田間藥效 中生菌素和納他霉素單劑及其不同比例復(fù)配的可濕性粉劑對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的防效如表4所示。與對(duì)葉片灰霉病防效趨勢(shì)類似，中生菌素和納他霉素單劑配方的 500倍液防效較差，分別為58.72%和 42.53%。5種不同比例的制劑對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的防效存在顯著性差異，中生菌素與納他霉素為9:1時(shí)，對(duì)番茄果實(shí)灰霉病防治具有顯著的增效作用，防效最好，可達(dá)78.48%；中生菌素和納他霉素的比例為1:1和7:3時(shí)，防效略有下降，分別為71.16%和63.75%。

表4 中生菌素與納他霉素復(fù)配制劑對(duì)番茄果實(shí)部灰霉病的田間防效Table 4 Efficacies of Zhongshengmycin andNnatamycin mixture in the control of gray mold on tomato fruits in fields

3 討論

番茄灰霉病是發(fā)病嚴(yán)重且難于控制的病害，目前用于番茄灰霉病防治的藥劑大多為化學(xué)藥劑，但抗藥性問題突出[11,12]。本研究首次引進(jìn)生物抑菌活性物質(zhì)納他霉素與中生菌素進(jìn)行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)復(fù)配比例為 9:1和1:1時(shí)，兩種藥劑具有協(xié)同增效作用，為生物農(nóng)藥的合理增效使用提供了依據(jù)。

不同作用機(jī)理的農(nóng)藥混和，可能產(chǎn)生增效作用。張亞等[13]發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺和咯菌腈的質(zhì)量比為1:1和5:1等比例時(shí)，對(duì)草莓灰霉病菌有增效作用。本研究中中生菌素與納他霉素以質(zhì)量比9:1和1:1混和時(shí)，表現(xiàn)為增效作用，其中比例為9:1時(shí)增效系數(shù)達(dá)到3.6348，在該比例時(shí)，EC50為0.5730 μg/mL，與腐霉利和異菌脲抑制番茄灰霉病菌的EC50值0.22和0.44 μg/mL[14]接近。目前生產(chǎn)中防治灰霉病比較好的化學(xué)藥劑40%嘧霉胺750倍液對(duì)番茄灰霉病的盆栽防效為80.63%，田間防效為75.55%[15]。本研究中，中生菌素和納他霉素混和制劑對(duì)番茄灰霉病在葉片和果實(shí)上的防效分別達(dá)到81.04%和78.48%，與40%嘧霉胺的防病效果接近，具有很大的應(yīng)用潛力。