香茅揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及抗氧化、抑真菌活性研究

王佳麗 張曉南 熊婷婷 牛亞倩 張英迪 徐 福

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030)

香茅草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]，別名包茅或檸檬草，是多年生禾本科香茅屬草本植物[1]。香茅草常被作為調(diào)味料出現(xiàn)在亞洲人的餐桌上[2]。此外，香茅草也被廣泛用于民間偏方，中國云南傣族人將香茅草烘干代茶飲，健胃消脂，治療腹瀉[3]；美國和巴西等國家利用香茅草驅(qū)蚊、治療發(fā)熱和焦慮癥以及清熱解毒等[4]?，F(xiàn)代研究證實，香茅草中具有多種大分子活性物質(zhì)，其中揮發(fā)油在臨床具有多種藥理活性，含有豐富的活性成分，特別是橙花醛和香葉醛，它們具有很好的抗菌功效，對真菌的生長均有抑制作用[5-6]；一些烯烴類、酯類和醛類物質(zhì)具有抗氧化效果[7]，可以作為天然抗氧化劑添加到食品中[8]；此外，從香茅揮發(fā)油中檢測出了波旁烯和欖香烯兩種活性成分，已證實該成分具有抗腫瘤的效果[9-10]。

近年比較常見的天然植物揮發(fā)油提取方法包括水蒸氣蒸餾法[11]、超臨界CO2萃取法[12]、索氏提取法[13]、微波輔助法[14]等。但這些傳統(tǒng)方法都有一定的缺陷：水蒸氣蒸餾法使用設(shè)備簡單，但提取率很低[15]；索氏提取法的提取率高，但要加入揮發(fā)性有毒試劑，具有污染性和潛在危害[15]；超臨界CO2萃取法能保護(hù)有效成分，但需要高壓設(shè)備，投資大[16]。而微波輔助提取法可以利用微波在極短的時間內(nèi)提高熱能的傳遞性，縮減加熱梯度，具有提取時間短、節(jié)能、操作簡單等優(yōu)點[14]。近年來，已有學(xué)者[17]將微波法用于輔助香茅草揮發(fā)油提取，但是由于單因素水平選取差異，使得試驗條件和結(jié)果達(dá)不到預(yù)期效果，出現(xiàn)最佳微波時間和液料比過大的問題，造成了能源的浪費。

研究擬采用微波輔助水蒸餾法提取香茅揮發(fā)油，利用GC-MS對香茅揮發(fā)油富含的化學(xué)成分進(jìn)行分析，并對香茅揮發(fā)油的抗氧化及抑制假尾孢真菌活性進(jìn)行探究，以期為揮發(fā)油產(chǎn)業(yè)的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香茅草：采購于廣西壯族自治區(qū)的玉林山農(nóng)戶；

去離子水：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；

正己烷：色譜純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；

無水硫酸鈉：純度≥99%，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

假尾孢菌：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)張曉南老師團(tuán)隊于水果表皮中分離鑒定；

電子天平：JA2003型：上海浦春計量儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：SpectraMax i3x型，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 7890A-5975C型，安捷倫科技有限公司；

精密量具游標(biāo)卡尺：GREENER型，煙臺市綠林工具有限公司；

循環(huán)水多用真空泵：SHB-D-Ⅲ型，河南省泰斯特儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A型，上海一恒科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52CS型，上海亞榮生化儀器廠；

微波爐：M1-L213B型(180～700 W)，廣東美的廚房電器制造有限公司；

恒溫水浴鍋：B-220型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 香茅揮發(fā)油的制備 將50 g的干香茅條和一定量的去離子水混合于裝置中加熱，初始溫度為25 ℃，大約30 min后產(chǎn)生揮發(fā)油。每隔一定時間記錄一次揮發(fā)油讀數(shù)，測定揮發(fā)油含量，使用無水硫酸鈉干燥揮發(fā)油，4 ℃保存?zhèn)溆?，采用GC-MS測定并統(tǒng)計揮發(fā)油的化學(xué)成分。

1.2.2 揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化 根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，以液料比、微波功率和提取時間為自變量，以揮發(fā)油得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0軟件對揮發(fā)油提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。因子編碼及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素和水平Table 1 Factor and levels in response surface analysis

1.2.3 香茅揮發(fā)油成分分析 采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[18]。檢測前，揮發(fā)油用正己烷稀釋50倍。采用Agilent 7890A氣相色譜Agilent MSD5975C質(zhì)譜檢測器，使用HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，樣品注入量1 μL，噴射器溫度250 ℃，電子電離能70 eV，質(zhì)量范圍40～400(m/z)。從60 ℃ 以3 ℃/min的速度升溫到250 ℃，持續(xù)10 min。采用色譜結(jié)合火焰離子化檢測器(GC-FID)，載氣為氮氣(恒定流量1 mL/min，純度99.999%)，進(jìn)樣器和檢測器溫度均為250 ℃，采用單個峰面積除以所有峰總面積計算相對比例，不考慮響應(yīng)因子；只包括超過0.1%的化合物。小于0.1%的峰值未計算在內(nèi)。

1.2.4 抗氧化活性研究

(1) DPPH自由基清除能力：配制0.05 mg/mL的紫色DPPH無水乙醇溶液，根據(jù)紫色褪色程度判定揮發(fā)油中氫原子或電子得失能力，測定揮發(fā)油對DPPH自由基的影響。每個濃度樣品溶液與DPPH乙醇溶液1∶1混合均勻，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度，上述試驗重復(fù)3次取均值；將樣品溶液替換為等量乙醇溶液作為空白對照；以與樣品溶液同濃度梯度VC溶液作為陽性對照[19]。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%；

A0——DPPH與乙醇混合溶液吸光度值；

A1——DPPH與樣品混合溶液吸光度值；

A2——乙醇與樣品混合溶液吸光度。

(2) ABTS自由基清除能力：ABTS無水乙醇溶液呈天藍(lán)色，其褪色程度可判斷揮發(fā)油的抗氧化能力，抗氧化能力越強則最大吸收波長734 nm處測得的吸光度值越小。將溶液與ABTS溶液以1∶9混合避光靜置10 min進(jìn)行測定Ai；將溶液替換為乙醇作為空白對照A0；以與樣品溶液同濃度梯度VC溶液為陽性對照。按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

C——ABTS自由基清除率，%；

A0——乙醇與樣品混合溶液吸光度值；

A1——ABTS與樣品混合溶液吸光度值；

A2——ABTS與乙醇混合溶液吸光度值。

(3)β-胡蘿卜素漂白試驗：將0.2 mg 的β-胡蘿卜素、20 μL亞油酸和200 μL吐溫-20依次溶解于200 μL氯仿溶液中并混合均勻，在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，再加入50 mL無水乙醇溶解即得到β-胡蘿卜素—亞油酸體系；樣品與β-胡蘿卜素—亞油酸溶液按1∶4混合均勻，水浴一定時間，在470 nm處測定抗氧化活性；以同濃度梯度的BHT溶液代替樣品溶液測得陽性對照結(jié)果[20]。按式(3)計算自由基清除率。

(3)

式中：

C——亞油酸氧化抑制率，%；

A樣品,0、A對照組,0——t=0時樣品溶液和對照組的吸光度值；

A樣品,2 h、A對照組,2 h——t=2 h時樣品溶液和對照組的吸光度值。

1.2.5 假尾孢菌菌株分離及培養(yǎng) 操作過程在超凈工作臺中進(jìn)行，使用超凈工作臺前需用75%酒精棉擦拭工作臺，并用紫外燈照射30 min，準(zhǔn)備酒精燈并將試驗用具滅菌放入超凈工作臺內(nèi)。將冷凍的番石榴上的腐爛部位切割成塊狀(10 mm×10 mm)研磨，加入到生理鹽水中震蕩30 s，梯度稀釋至105～107CFU/mL，取樣品100 μL均勻涂抹到固體培養(yǎng)基中，密封置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀測真菌形態(tài)。

1.2.6 MIC和MBC的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[21]，修改如下：將不同濃度的揮發(fā)油溶液加入到含培養(yǎng)基的平板中，使得培養(yǎng)基中所含揮發(fā)油最終質(zhì)量濃度分別為3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5 μg/mL，混勻注入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，使用打孔器將培養(yǎng)好的菌餅切割成直徑為4 mm的圓餅，放置在培養(yǎng)基中心位置，26 ℃下培養(yǎng)1～5 d，觀察菌體生長情況。對揮發(fā)油的每一濃度梯度做3組平行試驗，從無菌生長的培養(yǎng)基中找到揮發(fā)油濃度最小的培養(yǎng)基，即為該揮發(fā)油的最低抑菌濃度，以0.1%的吐溫-80水溶液作為對照。參考最低抑菌濃度試驗結(jié)果，制備濃度大于MIC的揮發(fā)油加入到液體培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)3 d，對澄清和較為澄清的試管進(jìn)行涂板，26 ℃培養(yǎng)2～5 d，以無菌落生長的揮發(fā)油濃度為最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

根據(jù)因素水平設(shè)計L9(34)試驗見表2。利用Box-Behnken設(shè)計原理并采用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到各因子對響應(yīng)值的二次多項回歸模型：

表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果 Table 2 Response surface methodology tests and results

(4)

表3 響應(yīng)面試驗各因素方差分析? Table 3 Analysis of variance for each factor

由圖1(a)可以看出，隨著液料比從6∶1 (mL/g)增加到10∶1 (mL/g)，微波功率從385 W增加到700 W，揮發(fā)油得率也相應(yīng)地增加，較高的液料比有利于得到更多的提取物，較高的微波功率可以快速破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，微波處理越強烈，越有利于揮發(fā)成分的流出。當(dāng)液料比和微波功率同時增高時，揮發(fā)油得率也增大。圖1(b)顯示揮發(fā)油得率隨液料比的增大而升高，當(dāng)液料比為7∶1 (mL/g)、微波時間為22 min時，揮發(fā)油的得率趨于平緩，可能是由于當(dāng)水溶液體積過大，揮發(fā)油溶解在水中不容易揮發(fā)出來，再延長提取時間并不能增加得率。圖1(c)中，香茅揮發(fā)油的得率也是隨著微波功率、微波時間的增加而增加，但過長的時間并不能增加揮發(fā)油得率，當(dāng)功率達(dá)到600 W左右，揮發(fā)油得率趨于平緩，過大的功率會導(dǎo)致能耗加。經(jīng)響應(yīng)面分析得出微波提取最佳條件為料液比7.185∶1 (mL/g)，功率700 W，時間21.707 min，此時揮發(fā)油得率為15.965 mL/kg·DW。在最佳提取條件下再次進(jìn)行揮發(fā)油的提取驗證實驗，重復(fù)3次，揮發(fā)油得率平均值為16.000 mL/kg·DW，此揮發(fā)油得率大于響應(yīng)面試驗中的數(shù)值，說明上述組合條件為揮發(fā)油提取最佳條件。

圖1 各因素對揮發(fā)油得率影響的響應(yīng)面圖Figure 1 Response surface diagram of the influence of various factors on the yield of essential oil

2.2 揮發(fā)油成分分析

微波輔助提取法和加熱套提取法所得香茅揮發(fā)油的離子流色譜圖分別見圖2和圖3，微波輔助提取法中共得到46個峰，共檢出39種成分，占所提揮發(fā)油總量的98.63%；加熱套提取法中共得到57個峰，共檢出43種成分，占所提揮發(fā)油總量的96.74%。各成分及其相對含量見表4。總體而言，這兩種方法提取的揮發(fā)油中的主要成分均為香茅醛和香茅醇，但相對含量存在差異，加熱套提取法的相對含量明顯小于微波輔助提取法的，微波輔助提取法所得到的揮發(fā)油中功能成分含量普遍高于加熱套提取的揮發(fā)油，兩種工藝都有各自的特點，提取成分種類的不同主要與提取工藝密切相關(guān)，揮發(fā)油成分含量也存在一定差異。微波加熱會使食品內(nèi)部分子振動摩擦并迅速產(chǎn)熱，引起食品溫度升高，從而達(dá)到快速加熱的目的。與傳統(tǒng)加熱方法相比，微波加熱不僅具有加熱速度快、加熱均勻、對產(chǎn)品的機械損傷小、提取效率高，耗能低等優(yōu)點，也更是一種符合綠色發(fā)展觀念的揮發(fā)油提取法。

圖2 微波輔助提取法所得香茅揮發(fā)油總離子流圖Figure 2 Total ion flow diagram of citronella volatile oil obtained by microwave-assisted extraction method

圖3 加熱套提取法所得香茅揮發(fā)油總離子流圖Figure 3 Total ion flow diagram of citronella volatile oil obtained by heating mantle extraction method

表4 香茅揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜—質(zhì)譜分析結(jié)果Table 4 Gas chromatography-mass spectrometry results for the chemical compositions of citronella essential oil

續(xù)表4

2.3 抗氧化活性

香茅揮發(fā)油對DPPH自由基和ABTS自由基的IC50值分別為0.546，1.694 mg/mL，均高于BHT(0.017，0.081 mg/mL)，表明香茅揮發(fā)油具有很好的自由基清除能力(表5)。根據(jù)表5中數(shù)據(jù)顯示，香茅揮發(fā)油對DPPH自由基、ABTS自由基的清除效率均低于VC與BHT，而抗氧化能力的大小取決于抗氧化劑的濃度及其供氫能力，香茅揮發(fā)油是天然抗氧化活性物質(zhì)，由多種化合物構(gòu)成；在β-胡蘿卜素漂白試驗中，香茅揮發(fā)油抗氧化IC50值為0.145 mg/mL，低于BHT的抗氧化能力0.02 mg/mL，與DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗結(jié)果一致。以上結(jié)論表明香茅揮發(fā)油屬于天然抗氧化物，具有安全性、無毒副作用的特點，可用于各類抗氧化產(chǎn)品開發(fā)之中，保護(hù)生物體免受自由基氧化，因此具有良好的應(yīng)用前景。

表5 香茅揮發(fā)油的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacity of the essential oil from the leaves of citronella mg/mL

2.4 抑真菌試驗

假尾孢真菌包括有上千個品種，從腐敗番石榴中分離的假尾孢真菌是座囊菌綱、球腔菌科下的微生物，廣泛存在于番石榴屬果實表面[22]，為了驗證香茅揮發(fā)油對真菌的抑制性，從冷凍的番石榴變質(zhì)部位進(jìn)行假尾孢菌分離。假尾孢真菌于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，經(jīng)革蘭氏染色，采用電子顯微鏡觀測表面結(jié)構(gòu)如圖4所示，其呈現(xiàn)出絲狀纏繞的狀態(tài)，無序排列，未經(jīng)染色的假尾孢真菌頭部呈黑褐色，尾孢呈乳白色，在生長過程中占空間較大，當(dāng)假尾孢真菌繁殖到一定數(shù)量時，肉眼可見黑褐色頭部覆蓋住尾孢，最終呈片狀分布在培養(yǎng)皿中。

圖4 經(jīng)革蘭氏染色的顯微鏡下200倍的假尾孢菌Figure 4 Pseudotail bacteria 200 times under the microscope after gram staining

采用瓊脂打孔法[23]測定香茅揮發(fā)油的抗真菌能力。

假尾孢菌是無性型真菌屬，生長速度緩慢，因此菌株生長情況觀察總時長為120 h。在24 h時，各培養(yǎng)皿中菌株均無明顯生長，隨時間推移，陸續(xù)出現(xiàn)菌落，隨揮發(fā)油抑菌液濃度的增大菌落數(shù)越少。當(dāng)揮發(fā)油抑菌液的質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時，對假尾孢真菌的抑制作用不明顯，菌落呈放射狀生長，但當(dāng)揮發(fā)油抑菌液質(zhì)量濃度為2.5～3.0 μg/mL時，對假尾孢真菌具有較好的抑制效果，但假尾孢真菌在2.5 μg/mL的抑菌液中持續(xù)120 h后仍然有一點生長；因此可以得出：在相同時間條件下，隨著香茅揮發(fā)油濃度的不斷增大，菌落生長直徑越來越??；該結(jié)果表明在單位時間恒定的情況下，揮發(fā)油對假尾孢菌的抑制強度與揮發(fā)油濃度呈正比例關(guān)系，且判斷MIC為2.5 μg/mL，MBC為3.0 μg/mL，由圖5可知，菌株在72 h時的觀察效果已經(jīng)很明顯，在揮發(fā)油質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL 的培養(yǎng)皿中，并未觀察到菌株生長，但是隨時間推移，直到120 h時瓊脂塊周圍出現(xiàn)白色菌落狀物，推測是因為時間的增加使培養(yǎng)皿中揮發(fā)油量逐漸減少，抑制作用逐漸消失，可能再延長培養(yǎng)時間，菌落數(shù)會越來越多，因此在培養(yǎng)前期就可以確定其MIC值，隨時間推移反而會影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，揮發(fā)油濃度的增大抑菌效果也顯著增加。童周[24]研究表明α-松油醇、香茅醇和香茅醛等活性成分具有良好的抑真菌效果，由于香茅揮發(fā)油中也富含這幾種成分，因此推測對抑制假尾孢真菌起到了很大作用。這也有利于揮發(fā)油抑制真菌以及香茅揮發(fā)油對其他真菌方面的研究。

圖5 不同質(zhì)量濃度香茅揮發(fā)油對假尾孢真菌的抑制情況Figure 5 Inhibitory effects of citronella essential oil at different mass concentrations on pseudosporomycetes

3 結(jié)論

微波輔助提取香茅揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)為微波功率700 W、微波時間21.707 min、液料比7.185∶1 (mL/g)，揮發(fā)油得率為15.965 mL/kg·DW。GC-MS分析鑒定出39種化合物成分，主要成分為烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物等，這些藥用成分的百分含量比加熱套提取法所得揮發(fā)油多。通過DPPH自由基、ABTS自由基以及亞油酸氧化的抑制率評估香茅揮發(fā)油的抗氧化性能，分別為92.49%，92.46%，82.23%，且香茅揮發(fā)油抑菌液對假尾孢菌的抑制MIC值為2.5 μg/mL，MBC值為3.0 μg/mL。但是微生物種類繁多，香茅揮發(fā)油對更多菌種的抑制作用還有待研究。