天然多糖組合物緩解干皮癥的功效及機(jī)理研究

干皮癥是一種皮膚科常見病，由于皮膚免疫屏障功能的損壞，皮膚保濕能力下降而引起的病變。以皮膚干燥為特點的皮膚病如老年干燥癥、特異性皮炎和季節(jié)性干燥癥等癥狀,系統(tǒng)性疾病如腎功能衰竭

、膽汁淤積也會引起嚴(yán)重的干皮癥，其早期主要表現(xiàn)為皮膚干燥、瘙癢、出現(xiàn)裂紋等，且伴隨不同程度的瘙癢，如不及時治療會進(jìn)一步發(fā)展為濕疹

。目前，皮膚干燥癥瘙癢的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，建立適宜的動物模型，有助于研究其發(fā)病機(jī)制。丙酮—乙醚—水（Acetone—Ether—Water，AEW）模擬的干皮癥模型，其機(jī)制為去除角質(zhì)層中的脂質(zhì)成分如神經(jīng)酰胺、膽固醇和游離脂肪酸,破壞皮膚的屏障功能

，引起皮膚干燥發(fā)炎。目前臨床上對于干皮癥等癥狀主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類外用藥物進(jìn)行治療，但是長期對患者應(yīng)用激素類外用藥物會導(dǎo)致其皮膚出現(xiàn)色素沉著、皮膚萎縮以及毛細(xì)血管擴(kuò)張等不良反應(yīng)

。

左小龍覺得黃瑩要登場了，馬上告辭劉必芒，下樓到了圍觀的人群里。一切虛假的英雄氣概在馬子面前都得現(xiàn)實一點，尤其是沒有泡到的馬子。

大量研究表明，多糖具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗氧化、抗衰老等多種生物活性。多糖通過影響細(xì)胞的分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和衰老，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)抗體生成等，尤其是對人體免疫功能的影響

，可作為免疫增強(qiáng)劑使用。南沙參（Radix Adenophorae）、枸杞（Lycium Barbarum L.）、玫 瑰（Rosa Rugosa）、云 芝（Coriolus Versicolor）以及黃芩（ Scutellaria Baicalensis Georgi）均始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，用藥歷史悠久，為中醫(yī)臨床和中成藥中最為常用的中藥。南沙參當(dāng)中含有的多糖具有低分子量將會呈現(xiàn)出更好的抗氧化活性，并且對血清抗體的水平產(chǎn)生有顯著的提高作用

。表明南沙參多糖成分對小鼠免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用；枸杞多糖在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，表現(xiàn)出一定的抑制免疫反應(yīng)的作用，同樣表明枸杞多糖在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能

；云芝多糖能提高機(jī)體免疫功能增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力；玫瑰多糖具有的抗氧化功效在化妝品領(lǐng)域也被廣泛運用

。多糖是黃芩的重要組成部分，但是目前針對黃芩多糖的研究相對較少，還處于初步階段。但是黃芩當(dāng)中含有黃酮等物質(zhì)基礎(chǔ)，具有良好的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的作用

。

本研究基于多糖的生物學(xué)活性，將南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黃芩多糖進(jìn)行篩選及配方組合，復(fù)配成五種多糖組合物，通過AEW模擬的干皮癥小鼠模型研究該組合物抗干燥、鞏固皮膚屏障的作用機(jī)理。

01 材料與方法

1.1 主要材料、試劑、儀器與試驗動物

超高壓均質(zhì)機(jī) JN-02HC，廣州聚能納米有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK-S22，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；離心機(jī)Z326K，德國賀默公司；數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司。

九水合硫化鈉（≥99.9%），阿法埃莎；生理鹽水（0.9%），廣州美侖生物科技有限公司；丙酮（≥99.5%），無水乙醇，廣州化學(xué)試劑廠 ；多聚甲醛（4%），阿拉??；乙醚（500mL），霍尼韋爾；蒸餾水，實驗室自制。

1.2 天然多糖的制備、篩選及多糖組合物的復(fù)配

參考王淑萍等的實驗方法

取曬干之后的南沙參，粉碎后取20g與200mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液混合，密閉靜置過夜，過夜后過濾加入150mL純化水，置于90℃恒溫水浴鍋恒溫加熱3h，用300目濾袋過濾得懸濁液，靜置2h后將懸濁液用雙層中速定性離心紙過濾，得到植物多糖水溶液，烘干得到植物多糖提取物。枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黃芩多糖的提取方法與南沙參多糖提取方法相同，均為水提醇沉法提取。

提取一定量植物多糖水溶液至100mL容量瓶，用純化水定容至刻度線，移取2mL該溶液至試管，再各加5 %苯酚溶液1.0mL，搖勻，然后加入5.0mL濃硫酸使其充分混勻，置于沸水浴中加熱15min，取出后在冰浴中冷卻至室溫。取100μL溶液于96孔板中，在酶標(biāo)儀中490 nm處對樣品測定吸光值。將吸光度與多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，得出該溶液多糖濃度。

DRGs (Diagnosis Related Groups，DRGs)，即“按疾病診斷相關(guān)分組”，屬于按病種付費方式的一種，它是依據(jù)年齡、疾病診斷、合并癥、并發(fā)癥、治療方式、病癥嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)歸等因素，將患者分入若干診斷組進(jìn)行管理的體系。每個診斷組內(nèi)的醫(yī)療服務(wù)價格相同，根據(jù)患者所屬組別一次性對醫(yī)院進(jìn)行資金補(bǔ)償。DRGs付費方式是當(dāng)今世界上公認(rèn)的比較先進(jìn)的付費方式之一。這種付費方式不僅鼓勵醫(yī)療機(jī)構(gòu)加強(qiáng)醫(yī)療質(zhì)量管理，提高診療水平，同時也促使參保人員一同節(jié)約費用，可以有效控制醫(yī)療保險費用的不合理增長。

對于夫妻雙方同為相同致病基因攜帶者的家庭，在夫妻雙方充分知情并同意情況下進(jìn)行產(chǎn)前診斷，經(jīng)超聲介導(dǎo)行絨毛穿刺術(shù)或羊膜腔穿刺術(shù)取得胎兒樣本，進(jìn)行產(chǎn)前基因檢測。

船舶靠離泊航行過程中，會受到多種因素的影響，導(dǎo)致航行安全受到威脅，在船舶靠離泊航行過程中，為保障航行安全，應(yīng)當(dāng)首先對安全事故成因加以明確，強(qiáng)化船舶港口及泊位優(yōu)化建設(shè)，并充分發(fā)揮拖輪的有效協(xié)助作用

多糖組合物包括復(fù)配：枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖組合形成復(fù)配1；黃芩多糖、南沙參多糖、云芝多糖組合形成復(fù)配2；南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖組合形成復(fù)配3；黃芩多糖、云芝多糖、玫瑰多糖組合形成復(fù)配4；黃芩多糖、枸杞多糖、南沙參多糖組合形成復(fù)配5。以上五種復(fù)配的多糖質(zhì)量濃度均為0.5%（w/v）。

1.3 AEW干燥動物模型、分組及給藥方法

參考Miyamoto T等的實驗方法[2] BALB/c雄性小鼠80只，5周齡，體重20～25g，購自廣東省醫(yī)學(xué)試驗動物中心（動物批號：SCXK(粵)2016-0041）。小鼠標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫維持在（24±0.2）℃，保持晝夜12 h節(jié)律，自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后進(jìn)行實驗。70只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、復(fù)配1、2、3、4、5組（共7組，每組10只）。實驗前一周剔除小鼠背部毛發(fā)（面積約2cmX2cm），直至皮膚完全顯露。每天固定于上午 9 時和下午 5 時涂抹 AE 和水溶液，制備小鼠干皮癥模型。模型組：用浸泡 AE 溶液 （丙酮和乙醚等體積混合） 的棉片在剃毛處涂抹15s，再用浸泡蒸餾水的棉片于同一部位涂抹 30s，連續(xù) 7d。處理之后 90min，將5種復(fù)配組分別涂抹于小鼠背部200μL/只，連續(xù)處理7d?？瞻捉M小鼠皮膚涂抹蒸餾水，時間頻率與模型組相同，第 7 天處死小鼠，取裸露的背部皮膚組織保存在-80℃冰箱，用于后續(xù)實驗。

1.4 PASI評分

觀察各組小鼠每天的背部皮損變化情況，依據(jù) PASI 評分標(biāo)準(zhǔn)給予小鼠皮損處紅斑(erythema)、鱗屑(scales)和浸潤增厚程度( thickness)0～4 的積分: 0，無; 1，輕度; 2，中度; 3，重度;4，極重度。將三者積分相加得到總積分(0～12) ，對各組小鼠積分取平均值后繪制趨勢線。

1.5 H&E染色

將耳部及背部皮膚組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水后，石蠟包埋。將修整好的蠟塊放置在石蠟切片機(jī)上切成厚度為4 μm的切片。切片漂浮于攤片機(jī)40 ℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進(jìn)60 ℃烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆?。切片于顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍照并測量其厚度。

1.6 甲苯胺藍(lán)染色測定皮膚肥大細(xì)胞密度

通過對小鼠背部皮膚HE染色，測量其背部皮膚厚度，結(jié)果如圖2所示。與空白組比較，模型組小鼠背部表皮厚度增厚；與模型組比較，各多糖復(fù)配組的小鼠背部表皮厚度均顯著下降。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

實驗結(jié)果采用單因素方差分析，采用GraphPad軟件作圖。使用Image J軟件處理甲苯胺藍(lán)染色圖片，所有數(shù)值均用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差”。各組間差異比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進(jìn)行組間兩兩多重比較。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

檢測皮膚組織中 IL-6 mRNA、FLG mRNA、MCP-1 mRNA、cAMP mRNA的表達(dá)。使用總 RNA 提取試劑盒從小鼠皮膚組織中提取 mRNA，測定 RNA 含量、純度符合要求。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以GADPH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt 算法進(jìn)行各組 mRNA 表達(dá)量檢測。引物由廣州賽維爾生物科技有限公司合成，總RNA提取試劑盒購自賽維爾，貨號：G3013。引物序列見表1。

02 結(jié)果

2.1 多多糖提取及含量測定結(jié)果

5種植物提取的多糖如表2所示，其中枸杞多糖固重達(dá)到8.77g，多糖含量達(dá)到43.85%；黃芩多糖固重達(dá)到7.10g，多糖含量達(dá)到35.50%。

2.2 AEW模型小鼠背部皮膚PASI評分

各多糖組合物復(fù)配對AEW模型小鼠背部皮膚干燥狀況抑制情況如圖1(A)所示。與空白組比較，模型組小試背部皮膚出現(xiàn)干燥、脫皮等癥狀；與模型組比較，各多糖復(fù)配組干燥、脫皮等癥狀明顯好轉(zhuǎn)；其PASI評分如圖1(B)所示。各多糖復(fù)配組的第17天PASI評分均明顯低于模型組。

我訕訕地冷笑，心想，我哪里買得起房，我拿什么買呀。但我沒說話。雖然我沒說話，但我臉上的氣色顯然把我的心理活動暴露出來了。

創(chuàng)業(yè)教育的根本目的在于培養(yǎng)受教育者的創(chuàng)業(yè)意識、正確認(rèn)識創(chuàng)業(yè)在社會中的作用與自我雇用的好處、提供創(chuàng)辦與經(jīng)營企業(yè)所需的知識和技能、提高就業(yè)能力。創(chuàng)業(yè)教育和市場營銷專業(yè)教育是辯證統(tǒng)一的，教師首先對創(chuàng)業(yè)教育的這一本質(zhì)有正確深刻的認(rèn)識，樹立全新的創(chuàng)業(yè)教育理念，不斷提高自身的綜合素養(yǎng)，在教學(xué)內(nèi)容設(shè)計、教學(xué)方法選擇、教學(xué)手段利用等過程中注重專業(yè)知識與實踐相結(jié)合，以塑造應(yīng)用型人才的綜合素質(zhì)。

2.3 AEW模型小鼠背部皮膚厚度測量及統(tǒng)計

參照許靜等

方法測定皮膚肥大細(xì)胞活化水平。用于實驗的石蠟切片的皮膚組織用曲別針反貼固定在硬質(zhì)塑料卡上，防止組織固定時卷曲。經(jīng)10%福爾馬林固定后，進(jìn)行石蠟包埋和常規(guī)切片，甲苯胺藍(lán)染色法對小鼠皮膚組織石蠟切片進(jìn)行染色，觀察各組小鼠患部皮膚組織中肥大細(xì)胞數(shù)量變化。使用ImageJ 1.48軟件在放大倍率200X下進(jìn)行肥大細(xì)胞計數(shù)。

2.4 各天然多糖組合物復(fù)配對小鼠背部炎癥皮膚組織中肥大細(xì)胞密度抑制情況

與空白組比較，模型組肥大細(xì)胞密度顯著升高；與模型組比較，各多糖復(fù)配組肥大細(xì)胞密度均顯著降低，見圖3。

社會學(xué)上認(rèn)為同輩群體在青少年的社會化過程中發(fā)揮著非常重要的作用，在與同輩群體的頻繁互動中，青少年極容易習(xí)得其他成員的價值觀和行為方式。同輩群體的亞文化以及非正式的制約力也會對青少年形成非常大的壓力，讓青少年服從同輩群體的行為規(guī)范。如果身邊有一群吸毒的朋友，那么吸毒就會成為行為規(guī)范，如果不吸毒就會和他們無話可說，被他們排斥。這種情況下，很多青少年都會選擇吸毒。因此，青少年一定要慎重地結(jié)交朋友，遇到吸毒的朋友一定要遠(yuǎn)離。

2.5 CAMP、FLG、MCP-1、IL-6表達(dá)量

實時熒光定量pcr結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織中FLG在mRNA中的表達(dá)量均有顯著下降。與模型組相比，給予多糖復(fù)配2的小鼠皮膚組織中CAMP mRNA的表達(dá)量顯著升高，多糖復(fù)配4組的小鼠皮膚組織中FLG mRNA的表達(dá)量明顯升高，如圖4所示。

與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織中MCP-1 mRNA及IL-6 mRNA的表達(dá)量均有顯著升高。與模型組相比，多糖復(fù)配1、3、4組的小鼠皮膚組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)量明顯降低，多糖復(fù)配4組的小鼠皮膚組織中IL-6 mRNA的表達(dá)量明顯降低，如圖4所示。

（3）做好文書檔案管理的基礎(chǔ)性工作。文書檔案管理工作失誤的影響力不容忽視，做好文書檔案管理工作必須先從檔案的基礎(chǔ)性工作入手，保證現(xiàn)有檔案準(zhǔn)確無誤，同時要對原有檔案進(jìn)行核查，防止失誤，發(fā)現(xiàn)錯誤時應(yīng)及時采取補(bǔ)救措施以使損失降到最低。

03 討論

小鼠干皮癥伴發(fā)的慢性炎癥在外周依賴于JAKSTAT信號通路

，IL-6等依賴于JAK-STAT信號通路的細(xì)胞因子最終可以導(dǎo)致涉及JAK-STAT信號通路下游的Th2炎癥因子增多，打破機(jī)體Th1/Th2平衡

。AEW干皮癥小鼠、特應(yīng)性皮炎等患者均表現(xiàn)出IL-6炎癥因子的表達(dá)升高。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的穩(wěn)態(tài)主要依賴于腺苷酸環(huán)化酶(AC)的合成和cAMP-磷酸二酯酶(PDEs)的水解, 增加c AMP水平可以抑制和調(diào)節(jié)炎癥

。在免疫系統(tǒng)中，c AMP 被公認(rèn)為是先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能的有效調(diào)節(jié)劑。研究表明，cAMP參與了多種重要炎癥信號通路的調(diào)控，如 MAPKs、NF-κB、JAK-STAT等通路。而依賴于NF-κB 通路的MCP-1因子在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移過程中起著較為關(guān)鍵的作用，可以促進(jìn)細(xì)胞因子釋放導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇

。依賴于MAPKs通路的FLG具有調(diào)節(jié)角質(zhì)層的屏障功能的作用，通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-1的交叉連接作用參與角化包膜的形成并調(diào)節(jié)表皮的水分平衡

。

本研究通過成功模擬干皮癥伴隨的慢性炎癥模型。觀察統(tǒng)計表明，通過給予多糖復(fù)配的小鼠皮膚狀況顯著好轉(zhuǎn)，明顯抑制了小鼠背部皮膚干燥發(fā)炎的狀況。在機(jī)理方面，給予多糖組合物的小鼠IL-6mRNA的表達(dá)量明顯降低，說明南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖組合物抑制了IL-6的表達(dá)，調(diào)節(jié)了機(jī)體Th1/Th2平衡；并且通過提升cAMP在脊髓中的表達(dá)，同時調(diào)節(jié)MAPKs、NF-κB通路中MCP-1及FLG的表達(dá)，最終降低了肥大細(xì)胞的活化，修復(fù)了受損細(xì)胞，調(diào)節(jié)了皮膚屏障功能，緩解了干皮癥伴隨的慢性炎癥。

綜上，多糖組合物（南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖）能夠有效地緩解干皮癥伴隨的慢性炎癥，緩解皮膚損傷，調(diào)節(jié)皮膚免疫功能。但cAMP調(diào)節(jié)MAPKs、NF-κB、JAK-STAT等通路的具體作用機(jī)制還需要深入的研究。

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