3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光致小鼠角膜損傷修復(fù)觀察

尹貽雪，焦路光，王嘉睿，王 超，任子淇，趙乙瓏，鄭 紅，楊在富*

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥 230032；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100039）

處于大氣傳輸窗口的3～5 μm遠(yuǎn)紅外激光在分子光譜學(xué)［1］、環(huán)境遙感［2］、紅外光電對(duì)抗［3］等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來，隨著紅外光參量振蕩器（optical parametric oscillator，OPO）技術(shù)的發(fā)展［4-7］，該波段的激光器已經(jīng)實(shí)現(xiàn)小型化和較高功率輸出，極大地促進(jìn)了該光譜區(qū)段的開發(fā)和應(yīng)用，但其對(duì)人身健康的危害也應(yīng)引起足夠重視。人眼是激光損傷最重要的靶器官。紅外（0.7 μm～1.0 mm）激光具有強(qiáng)烈的“水吸收”作用［8］，人眼受到該波段激光照射時(shí)，輻射能量主要被含水量豐富的角膜組織吸收，通過熱效應(yīng)造成角膜損傷［9］。角膜被紅外激光損傷后可造成混濁、瘢痕、不透明甚至失明，危害嚴(yán)重，是近年來激光損傷防護(hù)研究的重要方向［10-12］。以往的紅外激光角膜損傷研究主要集中在近紅外（0.7～1.4 μm）和中紅外（1.4～3.0 μm）波段，包括波長1.315 μm的氧碘化學(xué)激光（chemical oxygen-iodine laser, COIL）［13］、波長1.319 μm的釔鋁石榴石晶體（yttrium aluminium garnet，YAG）激光［14-16］、波長1.338 μm的YAG激光［10］、波長1.54 μm的鉺（erbium，Er）激光［17-19］、波長2.0 μm的銩（thulium，Tm）激光［20-22］、波長2.94 μm的自由電子激光 （free electron laser，F(xiàn)EL）［23］等。遠(yuǎn)紅外波段（3 μm～1 mm）激光角膜損傷的研究主要集中在波長為10.6 μm的CO2激光上［24］。目前，3～5 μm波段激光角膜損傷的研究尚未見報(bào)道。我們前期通過試驗(yàn)研究確定出了處于該波段的3.74 μm激光兔角膜損傷閾值［25］。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建3.74 μm激光小鼠角膜損傷模型，觀察激光角膜損傷特點(diǎn)和損傷修復(fù)過程，為激光角膜損傷危害評(píng)價(jià)和損傷治療研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象

C57BL/6J小鼠（Mus musculus）30 只，6～8 周齡，體重25～30 g，雌雄不限，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，在軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。經(jīng)裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡檢查，小鼠眼屈光介質(zhì)和眼底均正常。

1.2 儀器

遠(yuǎn)紅外激光器由國防科技大學(xué)提供，波長為3.74 μm。采用光參量振蕩技術(shù)，輸出激光中包含1.06、1.50和3.74 μm三個(gè)波長，發(fā)射方式為連續(xù)輸出。濾除1.06和1.50 μm激光，保留3.74 μm激光，其最大功率為12.8 W。

1.3 光路搭建

3.74 μm激光依次經(jīng)過楔形分束片、凸透鏡、快門、反射鏡后垂直入射到小鼠角膜，光路中所有光學(xué)元件均為適合于遠(yuǎn)紅外透射傳輸?shù)腃aF2材質(zhì)。楔形角為8o的楔形分束片分出的部分激光，照射到激光功率計(jì)1（power meter 1，PM1）上，用于監(jiān)測(cè)激光照射過程中的功率。另一個(gè)激光功率計(jì)2（power meter 2，PM2）測(cè)量到達(dá)小鼠角膜處的激光功率。焦距為500 mm的凸透鏡用于改變光束直徑，調(diào)節(jié)角膜光斑大小，凸透鏡與小鼠眼角膜間的距離為28.3 cm，此處光斑直徑為2 mm。機(jī)械快門控制曝光時(shí)間為0.8 s。兩個(gè)低功率的655 nm激光筆發(fā)射的激光束交叉點(diǎn)與3.74 μm激光光斑中心重合，用于精確指示小鼠角膜位置。試驗(yàn)前先測(cè)出PM2與PM1讀數(shù)的比值即監(jiān)視比，角膜照射時(shí)撤掉PM2，根據(jù)PM1讀數(shù)和監(jiān)視比計(jì)算出實(shí)際輻射功率。通過調(diào)整激光器驅(qū)動(dòng)電流，激光照射角膜的功率可自由改變。

1.4 構(gòu)建小鼠角膜激光損傷模型

試驗(yàn)前30 min，30 只C57BL/6J小鼠采用5%水合氯醛（750 mg/kg）腹腔注射全身麻醉，然后用鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉。將小鼠固定在升降臺(tái)上，微調(diào)小鼠眼的位置和角度使激光束照射角膜中心。根據(jù)本研究前期試驗(yàn)結(jié)果［23］，光照時(shí)間為1.0 s、光斑直徑為1.5 mm的條件下，3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光致兔角膜損傷閾值為7.91 J/cm2。依據(jù)該數(shù)據(jù)，預(yù)試驗(yàn)分別用大約2 倍、3 倍、4 倍閾值劑量激光照射小鼠角膜，每個(gè)照射劑量1 只小鼠，摸索可導(dǎo)致熱凝固損傷但不會(huì)發(fā)生角膜缺損或穿孔（中度損傷）的激光照射條件，得出能量密度為23.2 J/cm2，對(duì)應(yīng)的激光照射功率為0.91 W。正式試驗(yàn)時(shí)，每只眼僅照射一個(gè)光斑，照射位置盡量靠近角膜中心。對(duì)照組為3只小鼠，試驗(yàn)組為照后3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d等8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只小鼠。

1.5 大體觀察

在激光損傷后各觀察時(shí)間點(diǎn)，肉眼或借助放大鏡觀察小鼠角膜損傷斑情況，用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。

1.6 裂隙燈顯微鏡觀察

在激光損傷后各觀察時(shí)間點(diǎn)，用TOPCON裂隙燈顯微鏡觀察小鼠角膜損傷情況，觀察方法包括大光斑斜照法以及窄裂隙照明法，評(píng)估角膜混濁程度、損傷深度，并拍照記錄。

1.7 光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography, OCT）

在激光損傷后各觀察時(shí)間點(diǎn)，采用光學(xué)相干斷層掃描儀（Cirrus HD-OCT 5000）對(duì)小鼠角膜損傷區(qū)進(jìn)行斷層掃描，并進(jìn)行拍照記錄。用Cirrus HD-OCT系統(tǒng)自帶標(biāo)尺測(cè)量損傷中心的角膜厚度，用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 組織病理觀察

在激光損傷后各觀察時(shí)間點(diǎn)，頸椎脫臼處死小鼠，摘取眼球，快速置入甲醛-乙酸固定液（10%中性甲醛80 mL，乙酸20 mL）固定24 h［26］，固定后標(biāo)本經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯使之透明，石蠟包埋后制作4 μm切片，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE），中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理切片的觀察和拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSSv23.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)Cirrus HD-OCT測(cè)得的損傷中心角膜厚度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Student’sttest比較損傷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與損傷前厚度是否有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大體觀察

圖1 3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光致小鼠角膜損傷光路示意圖Fig. 1 Schematic drawing of 3.74 μm laser set up for the mice corneal exposure

如圖2所示，C57BL/6J小鼠正常角膜表面光滑，清澈透明。3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光所致角膜損傷即刻可見為灰白色凝固斑，損傷后3～12 h角膜表面凹凸不平，角膜混濁程度隨時(shí)間逐漸加重，1 d時(shí)最重，3～7 d逐漸減輕，14 d再次加重，21 d角膜仍不透明，未恢復(fù)正常。另外，激光損傷后12 h可見上下眼瞼腫脹和分泌物增多，1 d時(shí)癥狀最為明顯，其后逐漸消退。

圖2 3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光損傷角膜后損傷斑的變化Fig. 2 Corneal lesions under digital camera after 3.74 μm laser irradiation

2.2 裂隙燈顯微鏡觀察

大光斑斜照法觀察（圖3a）正常角膜透明度高，其后方的虹膜和瞳孔清晰可見。3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光損傷后，角膜混濁非常明顯，后方虹膜和瞳孔被遮擋不可分辨，角膜混濁隨時(shí)間的變化特性與大體觀察一致。損傷后6 h混濁區(qū)擴(kuò)展至損傷斑周邊，1 d時(shí)混濁面積達(dá)到頂峰，3～7 d混濁面積明顯減小，14 d混濁再次加重，21 d角膜未恢復(fù)正常。

窄裂隙照明法觀察發(fā)現(xiàn)（圖3b）：正常角膜光散射弱，為厚薄均勻的淡灰白色條帶，虹膜清晰可見；角膜受損后光散射顯著增強(qiáng)，為亮白色條帶，損傷累及角膜全層，損傷區(qū)角膜增厚，虹膜模糊；白色條帶隨時(shí)間先增強(qiáng)后減弱，1 d時(shí)條帶最顯著，21 d時(shí)角膜厚薄仍不均勻，未恢復(fù)正常。

圖3 裂隙燈顯微鏡觀察3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光損傷角膜后損傷斑的變化Fig. 3 Corneal lesions under slit lamp microscope after 3.74 μm laser exposure

2.3 OCT觀察

OCT觀察正常角膜為亮度均勻的高反射光帶。3.74 μm激光損傷后，損傷區(qū)角膜反射光帶增強(qiáng)，角膜凸起明顯；反射光帶增強(qiáng)區(qū)域隨時(shí)間先擴(kuò)大后逐漸縮小，1 d時(shí)反射光帶增強(qiáng)區(qū)域達(dá)到最大，21 d時(shí)角膜損傷區(qū)反射光帶仍較強(qiáng)，未恢復(fù)正常（圖4）。此外，損傷后6 h～1 d可觀察到虹膜與角膜黏連（但無法判斷虹膜是否與晶狀體黏連）。

圖4 OCT觀察3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光損傷角膜后的損傷區(qū)的變化Fig. 4 Corneal lesions under OCT after 3.74 μm laser exposure

激光損傷引起角膜腫脹，角膜厚度隨時(shí)間先增大后減小，12 h時(shí)最厚，達(dá)（218.30±8.18）μm，約為正常角膜厚度的2 倍；21 d角膜厚度基本恢復(fù)正常（圖5）。

圖5 3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光損傷后角膜厚度的變化Fig. 5 The thickness of corneal after injury induced by 3.74 μm laser

2.4 組織病理觀察

HE染色觀察發(fā)現(xiàn)：正常小鼠角膜組織結(jié)構(gòu)清晰，上皮層由4～5 層上皮細(xì)胞構(gòu)成，排列規(guī)整；基質(zhì)層纖維規(guī)則排列，包含梭形基質(zhì)細(xì)胞；內(nèi)皮層為單層內(nèi)皮細(xì)胞均勻分布。3.74 μm激光致C57BL/6J小鼠角膜損傷后3 h，上皮細(xì)胞核固縮深染，成拉伸狀，基質(zhì)細(xì)胞核染色質(zhì)大部分脫失，僅有少量殘存，內(nèi)皮細(xì)胞完全脫落；6 h上皮細(xì)胞核染色變淡，基質(zhì)細(xì)胞核染色質(zhì)消失，出現(xiàn)無核區(qū)，后表面平整；12 h上皮層不再平整，出現(xiàn)皺褶，上皮細(xì)胞核染色消失，基質(zhì)層出現(xiàn)浸潤細(xì)胞，基質(zhì)后表面皺褶彎曲；1 d壞死上皮脫落，1～2 層新生上皮細(xì)胞完全覆蓋損傷區(qū)，細(xì)胞排列不規(guī)則，基質(zhì)層浸潤細(xì)胞增多，基質(zhì)后表面出現(xiàn)零星橢圓形核的內(nèi)皮細(xì)胞；3 d上皮層細(xì)胞增多，出現(xiàn)單層扁平上皮，表面恢復(fù)平整，基質(zhì)層浸潤細(xì)胞進(jìn)一步增多，且多集中在深層，內(nèi)皮層橢圓形內(nèi)皮細(xì)胞增多；7 d新生上皮增加到3～4 層細(xì)胞，大量細(xì)胞呈空泡狀，基質(zhì)浸潤細(xì)胞多集中在淺層，扁平內(nèi)皮細(xì)胞呈單層分布，恢復(fù)平整；14 d 上皮層有少量空泡細(xì)胞，排列趨向規(guī)整，基質(zhì)層浸潤細(xì)胞減少；21 d上皮層基本恢復(fù)正常，厚薄均勻，由4～5 層排列規(guī)整的上皮細(xì)胞構(gòu)成，單層內(nèi)皮細(xì)胞均勻分布，鋪滿內(nèi)皮層，基質(zhì)層浸潤細(xì)胞進(jìn)一步減少，基質(zhì)層出現(xiàn)空隙，基質(zhì)纖維排列仍不規(guī)則，未恢復(fù)正常（圖6）。

圖6 3.74 μm中紅外激光照射角膜損傷病理切片F(xiàn)ig. 6 Corneal histological sections after 3.74 μm laser exposure

組織病理顯示：損傷后6 h虹膜與角膜黏連；12 h虹膜組織碎裂，部分與角膜黏連，部分與晶狀體黏連；1 d可見虹膜與角膜緣黏連，偶見與晶狀體黏連（圖7），說明虹膜也已經(jīng)受損。上述虹膜與角膜黏連的特征與OCT觀察結(jié)果一致。

圖7 3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光致角膜損傷后組織黏連的病理切片F(xiàn)ig. 7 Iris adhesion to the cornea or lens revealed by histological sections after 3.74 μm laser exposure

3 討論

本研究中，我們構(gòu)建了3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光致C57BL/6J小鼠角膜熱凝固損傷模型，損傷累及小鼠角膜全層，損傷后角膜腫脹增厚，混濁隨時(shí)間加重，隨著受損上皮細(xì)胞脫落以及水腫消退，角膜變薄，混濁減輕。新生上皮細(xì)胞遷移覆蓋損傷區(qū)，先形成1～2 層細(xì)胞組成的薄層上皮，然后逐漸增厚形成接近完整的正常上皮；基質(zhì)層受損基質(zhì)細(xì)胞核染色質(zhì)消失，出現(xiàn)浸潤細(xì)胞，其自房水途經(jīng)受損內(nèi)皮進(jìn)入基質(zhì)深層，進(jìn)而遷移至基質(zhì)淺層。21 d浸潤細(xì)胞退去，基質(zhì)層膠原纖維未恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)；受損內(nèi)皮細(xì)胞脫落，新生內(nèi)皮細(xì)胞遷移覆蓋損傷區(qū)，形成均勻分布的單層扁平結(jié)構(gòu)。

與本試驗(yàn)中3 倍閾值劑量造成小鼠角膜全層損傷特征不同，該激光致新西蘭白兔角膜閾值損傷研究的觀察只持續(xù)到24 h。在閾值水平損傷僅累及角膜上皮層，損傷后上皮壞死脫落，24 h上皮層即可恢復(fù)正常［25］。2 倍閾值劑量的損傷累及角膜上皮層和淺層基質(zhì)，損傷后6 h上皮壞死脫落，淺層基質(zhì)細(xì)胞核染色質(zhì)大部分脫失；24 h可見上皮層基本恢復(fù)正常，淺層基質(zhì)細(xì)胞核染色質(zhì)消失，未恢復(fù)正常［25］。本試驗(yàn)眼損傷明顯偏重，原因一方面是激光照射劑量高，另一方面是小鼠角膜厚度低。

就動(dòng)物模型的選擇上，角膜損傷閾值研究多以兔作為動(dòng)物模型［13-24］，而角膜損傷修復(fù)研究則多以小鼠作為動(dòng)物模型［27-29］。3～4月齡兔角膜厚度在350～380 μm［30］，而6～8 周齡C57BL/6J小鼠的角膜厚度為85～95 μm［31］。3.74 μm激光在1.97 倍損傷閾值條件下?lián)p傷累及兔角膜上皮層和基質(zhì)淺層，損傷深度約是兔角膜厚度的一半［25］；按損傷深度推斷，本試驗(yàn)所用照射劑量不僅能損傷小鼠角膜全層，還包括角膜后組織。因此，在損傷修復(fù)中觀察到虹膜與角膜黏連，或者虹膜與晶狀體黏連的現(xiàn)象?？傊?，本研究通過觀察3.74 μm遠(yuǎn)紅外激光在23.2 J/cm2的劑量下致小鼠角膜損傷后的修復(fù)過程，為紅外激光角膜損傷修復(fù)研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。