復(fù)方七芍降壓片對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及左心室肥厚的影響

謝麗圣

(南寧市第二人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

左室肥厚(Left ventricular hypertrophy，LVH)是高血壓研究中新提出的，也最引人矚目的熱點問題之一[1-2]。LVH有相當高的發(fā)病率，Yildiz等[3]研究發(fā)現(xiàn)，相比血壓正常者，血壓高于160/95 mmHg的高血壓患者，LVH的發(fā)病率增高10倍。更有研究發(fā)現(xiàn)，坐位舒張壓在100～115 mmHg之間的高血壓患者中有62%的患者存在LVH。眾多臨床研究證實，LVH不僅是高血壓的并發(fā)癥，而且是高血壓的危險因素[4-8]。復(fù)方七芍降壓片臨床應(yīng)用于治療高血壓十余年，療效較好[9-10]。本文擬通過觀察大鼠血壓、心臟形態(tài)及計算左心室質(zhì)量指數(shù)、相對室壁厚度，查看心肌組織病理特征，檢測心室肥厚血清學(xué)指標、心肌和血漿血管緊張素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)等，探討復(fù)方七芍降壓片治療高血壓左室肥厚的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選用60只11周齡的雄性健康清潔級Wistar-Kyoto大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，且經(jīng)本院醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準開展研究。

1.1.2 藥物與試劑：復(fù)方七芍降壓片(由三七、桑寄生、白芍、杜仲、天麻、羅麻、地龍、丹參、甘草、葛根、炒香附等組成，湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部制劑室生產(chǎn)，批號040519)、纈沙坦片(規(guī)格80 mg/片，北京諾華制藥公司)、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DMEM 干粉培養(yǎng)基(中山公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱(型號SHEL-LAB-2300)，天平(型號PB203-N)，LS3810 液體閃爍儀(Beckman公司)，倒置顯微鏡(型號Axiovert100，德國 Zeiss 公司)，pH計(型號Mettler Toledo-320)，ALc-nibp無創(chuàng)尾動脈壓測量分析系統(tǒng)(上海奧爾特有限責任公司)，BL-820通用8道生物機能系統(tǒng)、BP-6動物無創(chuàng)血壓測試系統(tǒng)(均為成都泰盟科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與分組：將大鼠隨機分組并分別放入飼養(yǎng)籠，每籠15只，對其中3籠大鼠進行高血壓造模[11]，另外1籠大鼠作為空白組。所有大鼠給予普通飼料(組成包括65%碳水化合物、22%蛋白質(zhì)、13%脂肪)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，環(huán)境溫度(20±2)℃，相對濕度(50±5)%，規(guī)律光照(晝夜各12 h)。經(jīng)7 d觀察各組大鼠血壓，造模大鼠血壓持續(xù)性高于正常值，且高于空白組大鼠。

1.2.2 給藥方法：空白組予蒸餾水10 ml/(kg·d)，灌胃，繼續(xù)給予普通飼料(組成包括65%碳水化合物、22%蛋白質(zhì)、13%脂肪)并自由飲水，喂養(yǎng)4周。模型組大鼠給予蒸餾水10 ml/(kg·d)，灌胃4周。復(fù)方七芍降壓片組，根據(jù)MTT法篩選出最佳劑量并以體重60 kg成人為標準，計算大鼠藥物用量，具體為4×(大鼠體表面積/60 kg成人平均體表面積)×復(fù)方七芍降壓片每日用量，溶于蒸餾水中，按10 ml/(kg·d)灌胃4周。將纈沙坦片與蒸餾水配制成濃度為3 mg/ml的纈沙坦片混懸液，按10 ml/(kg·d)的劑量灌胃4周。

1.2.3 血壓測定：實時監(jiān)測清醒大鼠的血壓，采用無創(chuàng)大鼠尾動脈血壓測定系統(tǒng)，取3次檢測的平均值。各組大鼠給藥前測量血壓1次，給藥后每隔1 h測血壓1次，連續(xù)4 h，此后每周測血壓1次。記錄大鼠給藥前、給藥2周、給藥4周時的血壓并稱重，由專人定時測定，減小測定誤差。

1.2.4 超聲心動圖測定大鼠心臟結(jié)構(gòu)：大鼠左側(cè)胸前放置西門子超聲儀，使用15 MHz高頻探頭，借助2D超聲確定左室短軸切面乳頭肌位置，應(yīng)用M模式超聲，記錄左室舒張末內(nèi)徑(Left ventricle diastolic diameter，LVIDd)、左室收縮期后壁厚度(Left ventricular systole posterior wall thickness，LVPWs)、左室收縮末內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter，LVIDs)等相關(guān)數(shù)據(jù)。各項指標計算公式如下：左室短軸縮短率(Left ventricular short axis shortening rate，LVFS)=[(左室舒張末內(nèi)徑-左室收縮末內(nèi)徑)/左室舒張末內(nèi)徑]×100%；左室容積(V)=7/3左室短軸徑÷(2.4+左室短軸徑)；LVM=1.04×[(左室舒張末徑+左心室后壁厚度+IVS)/3-LVEDD/3]-13.6；LVEF(%)=[(舒張末期容積-收縮末期容積)/舒張末期容積]×100%。

1.2.5 相對室壁厚度、左心室質(zhì)量指數(shù)及心臟大體形態(tài)：大鼠采用斷頭法處死后，開胸迅速取出心臟，心臟殘余的血液用PBS緩沖液沖洗干凈，殘余的液體再用濾紙吸干凈，觀察心臟大體形態(tài)，調(diào)整心臟位置，使心尖豎直向下，拍照比對各大鼠心臟形態(tài)。全心重量(HW)用電子天平精確稱量，并將心臟放置于冰塊上，去除心包組織及大血管，沿室間隔去除右心室、右心房，保留左心室及室間隔。左心室質(zhì)量(Left ventricular mass，LVM)用電子天平精確稱量，然后計算心臟質(zhì)量指數(shù)(Heart Mass Index，HMI)和左心室心肌質(zhì)量指數(shù)(Left Ventricular Mass Index，LVMI)；HMI=全心重/體重，LVMI=左心室重量/體重。測量舒張末期左室后壁厚度(Left ventricular posterior walldepth，LVPWTd)，舒張末期左室內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)，舒張末期室間隔厚度(Interventricular septal depth，IVSTd)，相對室壁厚度(Relative wall thickness，RWT)=(LVP-WTd+IVSTd)/LVEDD。

1.2.6 心肌組織病理檢查：心肌組織用10%甲醛固定，經(jīng)過洗漆、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、晾干或烘烤后，采用HE染色方法染色，置切片盒內(nèi)備用，然后進行病理檢查。

1.2.7 心室肥厚血清學(xué)指標及心肌和血漿Ang-Ⅱ檢測：處死大鼠前抽取大鼠靜脈血，分離血清，置于-20℃低溫冰箱。用放射免疫法測定(試劑盒由上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心提供) 血清Ⅲ型前膠原(Procollagen Ⅲ，PCⅢ)、層粘連蛋白(Laminin，LN)、透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)等指標。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，先進行正態(tài)性檢驗，滿足方差分析條件時，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗，不滿足方差分析條件時，采用Mann-Whitney U檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時間點收縮壓比較 見表1。模型組、復(fù)方七芍降壓片組、纈沙坦組大鼠給藥前收縮壓比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且均高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥后，復(fù)方七芍降壓片組、纈沙坦組大鼠收縮壓較治療前均下降，且均低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥后，復(fù)方七芍降壓片組和纈沙坦組同時間點收縮壓比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠不同時間點收縮壓比較(mmHg)

2.2 復(fù)方七芍降壓片對大鼠心臟功能的影響 見圖1。通過西門子超聲儀M型檢測高血壓左室肥厚大鼠，復(fù)方七芍降壓片組、纈沙坦組大鼠的心臟功能均有改變；給藥后兩組大鼠在LVEF、LVPWs、LVFS方面均升高，LVIDs、LVIDd均減少；計算左心室心肌質(zhì)量指數(shù)后發(fā)現(xiàn)，治療后左室重量/體重指數(shù)增加，提示高血壓左室肥厚大鼠在給予復(fù)方七芍降壓片、纈沙坦治療后心臟功能有所恢復(fù)。

A：模型組；B：復(fù)方七芍降壓片組；C：纈沙坦組圖1 超聲檢測藥物對模型大鼠心臟功能的影響

2.3 各組大鼠心臟大體形態(tài)學(xué)、心肌細胞橫截面積HE染色比較 模型組較空白組大鼠的心臟明顯增大。模型組心肌細胞體積變大、形態(tài)不規(guī)則，且排列松散、紊亂、胞核畸形、核仁模糊(圖2)。模型組心肌細胞橫截面積大于空白組，復(fù)方七芍降壓片組、纈沙坦組大鼠心臟較模型組心臟體積、心肌細胞橫截面積縮小(圖3)?？瞻捉M心肌肌原纖維細胞胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整且排列致密、整齊(圖4)。

A：空白組；B：模型組；C：復(fù)方七芍降壓片組；D：纈沙坦組圖2 各組大鼠心臟形態(tài)圖

A：空白組；B：模型組；C：復(fù)方七芍降壓片組；D：纈沙坦組圖3 各組大鼠心肌細胞橫截面積(HE染色，×1)

A：空白組；B：模型組；C：復(fù)方七芍降壓片組；D：纈沙坦組圖4 各組大鼠心肌病理學(xué)比較(HE染色，×40)

2.4 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)、相對室壁厚度比較 見表2。模型組大鼠的LVMI、RWT均大于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)方七芍降壓片組、纈沙坦組大鼠LVMI、RWT均小于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而復(fù)方七芍降壓片組大鼠的LVMI、RWT均大于纈沙坦組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠LVMI、RWT比較

2.5 各組大鼠心室肥厚血清學(xué)指標比較 見表3。模型組大鼠的心室肥厚血清學(xué)指標包括血清PCⅢ、LN、HA，均高于空白組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)方七芍降壓片組、纈沙坦組大鼠的心室肥厚血清學(xué)指標均小于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而復(fù)方七芍降壓片組的心室肥厚血清學(xué)指標稍高于纈沙坦組大鼠，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠心室肥厚血清學(xué)指標比較(μg/L)

2.6 各組大鼠心肌和血漿Ang-Ⅱ值比較 見表4。模型組大鼠的心肌和血漿Ang-Ⅱ值均高于空白組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)方七芍降壓片組、纈沙坦組大鼠的心肌和血漿Ang-Ⅱ值均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而復(fù)方七芍降壓片組大鼠的心肌和血漿Ang-Ⅱ值均高于纈沙坦組大鼠，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠心肌和血漿Ang-Ⅱ值比較(pg/g)

3 討 論

高血壓患者中約有30%會出現(xiàn)左室肥厚，部分患者LVH甚至先于高血壓出現(xiàn)，并已經(jīng)嚴重影響高血壓患者生活質(zhì)量、生存時間。逆轉(zhuǎn)左心室肥厚對于降低心室僵硬度，改善心室充盈，增加冠脈儲備，改善心肌血液供應(yīng)，減少室性心律失常發(fā)生都有重要作用[12-14]。在高血壓防治指南中LVH已被列為靶器官損害的評價指標，逆轉(zhuǎn)LVH成為高血壓治療的最終目標。Verdecchia等[15]指出，左室重量下降帶來的發(fā)生心血管事件危險下降獨立于基礎(chǔ)的左室重量、動態(tài)血壓值以及血壓下降程度。

高血壓歸屬中醫(yī)學(xué)“風?！薄把灐薄邦^痛”等范疇，其病位在絡(luò)脈，陰虛陽亢是其基本病機，瘀血貫穿于高血壓病的整個病程中。因此，臨床治療高血壓病應(yīng)緊扣陰虛、陽亢、瘀血這三個病理環(huán)節(jié)[16-17]。復(fù)方七芍降壓片系湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療高血壓病的院內(nèi)制劑，全方由三七、桑寄生、白芍、杜仲、天麻、羅麻、地龍、丹參、甘草、葛根、炒香附等組成，具有養(yǎng)陰柔肝，化瘀通絡(luò)的功效，臨床使用多年療效較好。譚元生等[18]通過對復(fù)方七芍降壓片的臨床研究證明，復(fù)方七芍降壓片能提高高血壓患者一氧化氮水平，降低其內(nèi)皮素水平，并在降壓同時，具有降低血脂作用。

目前研究認為，復(fù)方七芍降壓片逆轉(zhuǎn)左室肥厚機制如下：①通過抑制心臟CYPIIB2基因轉(zhuǎn)錄，抑制心臟醛固酮自分泌過程，目前研究已證明，醛固酮水平升高可導(dǎo)致過多膠原聚集，引起心肌纖維化，醛固酮水平與左室重量指數(shù)明顯相關(guān)[19-21]；②抑制Ang-Ⅱ介導(dǎo)的Ca2+增加，具有鈣拮抗劑作用[22-25]；③通過降低血黏度，抑制血小板聚集、介質(zhì)釋放，增加心肌組織血液灌流量，改善局部組織微循環(huán)障礙，減少自由基生成，預(yù)防和遏止心肌纖維化、心肌肥大[26-28]；④通過降低IL-6、TNF-α作用預(yù)防和逆轉(zhuǎn)高血壓LVH[29-31]。本研究結(jié)果說明復(fù)方七芍降壓片有較好的降壓效果。通過超聲檢測發(fā)現(xiàn)，高血壓左室肥厚大鼠給予復(fù)方七芍降壓片、纈沙坦治療后，LVIDd、LVIDs均減少，LVPWs增加，提示心肌肥厚減輕，心臟功能有所恢復(fù)。取出大鼠心臟可以看出，模型組大鼠較空白組大鼠心臟明顯增大，心肌細胞體積明顯增大，橫截面積大于空白組，而復(fù)方七芍降壓片、纈沙坦治療后的大鼠心臟體積和心肌細胞橫截面積明顯縮小。模型組大鼠LVMI、RWT均大于正常大鼠，復(fù)方七芍降壓片、纈沙坦治療后大鼠的LVMI、RWT均降低，證實復(fù)方七芍降壓片能逆轉(zhuǎn)高血壓左室肥厚。進一步檢測血清PCⅢ、LN、HA發(fā)現(xiàn)，治療后大鼠各指標均下降。大鼠在接受復(fù)方七芍降壓片、纈沙坦治療后，心肌和血漿Ang-Ⅱ值均小于模型組大鼠，這與既往研究類似[32-34]。

綜上所述，復(fù)方七芍降壓片能逆轉(zhuǎn)高血壓左室肥厚，降低心臟局部和血漿中Ang-Ⅱ，抑制心臟局部和全身腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)有關(guān)。