正交試驗優(yōu)選肋柱花中獐牙菜苦苷的提取工藝研究

額尼榮貴 于紅珍 巴根那 付明海*

1.內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.國家藥監(jiān)局中藥(蒙藥)質(zhì)量控制重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028000

肋柱花Lomatogoniumrotatum(L.)Fries ex Nym.是防治各種肝膽疾病的特色傳統(tǒng)內(nèi)服蒙藥材，蒙語名為哈比日跟地格達，全草入藥。味極苦,性寒、鈍、糙、輕、燥，具有去除體內(nèi)“ 協(xié)日”、清除內(nèi)熱、健胃、愈傷的功效。用于“ 協(xié)日”熱、疫癘、流感、肝膽熱、中暑頭熱、皮膚紅腫發(fā)黃等，在蒙醫(yī)臨床上主要用于治療肝膽類消化系統(tǒng)疾病[1]。肋柱花廣泛分布于我國的內(nèi)蒙古、西藏、青海、甘肅、新疆等地的山坡及叢林中[2]。1998年收錄于衛(wèi)生部藥品標準蒙藥分冊，與山苦荬等配伍制成利膽二十八味散，用于降解膽囊“ 協(xié)日”熱[3]。另，因其具有清肝膽熱作用，可以作為君藥配伍組成諸如地格達-15、地格達-20、地格達-25等方劑，用于治療肝膽熱、目膚紅腫發(fā)黃、膽痞和“ 協(xié)日”滯瘀等導致臟器損傷的臨床常見病癥[4]。此外，肋柱花與黃連、梔子、瞿麥配伍組成蒙藥方劑肋柱花四味湯(又稱地格達-4)，用于咽痛、肝膽熱、血熱相搏、口渴煩躁等病癥[2]。據(jù)統(tǒng)計肋柱花入藥蒙藥方劑共有24種，其中肋柱花以君藥入藥方劑有3種，以臣藥入藥4種，以佐藥入藥16種，以使藥入藥1種，是有別于其他民族醫(yī)藥用藥習慣的特色蒙藥道地藥材[4]?，F(xiàn)代研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，肋柱花主要藥理作用有保肝護膽、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌、減肥消脂作用。其化學成分主要以黃酮類、三萜類、環(huán)烯醚萜及裂環(huán)烯醚萜為主[9]。裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物是一類具有保護肝臟、降低體內(nèi)血脂血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、對神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)有保護作用的天然活性分子[10]。獐牙菜苦苷屬環(huán)烯醚萜類化合物，是肋柱花主要苦味活性成分?，F(xiàn)代藥理研究[11-12]表明，獐牙菜苦苷具有保護肝臟、調(diào)節(jié)血脂異常、抗糖尿病、抗炎鎮(zhèn)痛和降脂等多種藥理作用，可能是肋柱花藥材的主要藥效指標性成分。而目前對肋柱花活性成分的提取工藝和質(zhì)量控制研究仍未見報道。文獻顯示，乙醇濃度、提取液用量、提取次數(shù)和時間是影響環(huán)烯醚萜類提取物的重要因素，可直接影響有效成分在提取物中的提取效果。因此，本文以獐牙菜苦苷作為活性指標成分，結(jié)合HPLC法和乙醇濃度、提取液用量、提取時間、提取次數(shù)等4個單因素考察結(jié)果，設計正交L9(34)試驗，確定肋柱花中獐牙菜苦苷的最佳提取工藝，為特色蒙藥材肋柱花進一步應用和開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器 本研究所用的主要儀器有Agilent 1260 Infinity ii液相色譜儀，SQP型十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，KQ-800E型超聲波清洗器，SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵，KDM型調(diào)溫電熱套。

1.2 主要藥品與試劑 肋柱花藥材采集于錫林郭勒盟(2020年9月25日)，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院拉西那木吉拉教授鑒定為龍膽科肋柱花Lomatogoniumrotatum(L.)Fries ex Nym的干燥全草(如圖1所示)。獐牙菜苦苷標準品(批號B21644 純度≥98%)，購自原葉生物。甲醇，磷酸，無水乙醇為分析純，水為超純水。

圖1 肋柱花全草圖

2 方法

2.1 標準溶液的配置 精密稱取獐牙菜苦苷標準品2.18 mg裝置25 mL量瓶中加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度搖勻。超聲波脫氣 10 min 后再通過 0.45 nm 水系膜過濾，制成1 mL含0.0872 mg的溶液，進樣量為10 μL，以獐牙菜苦苷質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2 色譜條件 采用高效液相色譜法；色譜柱： ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm)5-Micron；流動相： 水-0.1%磷酸水溶液梯度洗0→70∶30,15→65∶35,25→50∶50；流速： 1.0 mL·min-1；檢測波長： 254 nm；柱溫： 30 ℃。采用正交設計助手計算實驗結(jié)果及方差分析。

2.3 樣品中獐牙菜苦苷含量的測定 將肋柱花粉碎制成粉末，精確稱取肋柱花藥粉5 g，按照L9(34)表格按照不同因素回流提取得浸膏并冷凍干燥。干燥粉末加適量甲醇溶解后，用 0.45 μL 濾膜過濾備用，按照色譜條件進行分析并計算苦味素的百分含量。

2.4 肋柱花獐牙菜苦苷提取工藝單因素實驗 藥材陰涼處晾干粉碎后，設計乙醇濃度×料液比×提取時間×提取次數(shù)4個因素的正交試驗，獲得獐牙菜苦苷的最佳提取工藝(表1)。

表1 單因素水平表

2.5 正交實驗及驗證 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇適宜的乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)并進行L9(34)表設計正交實驗(表2)。

表2 正交試驗的因素與水平表

3 結(jié)果

3.1 肋柱花獐牙菜苦苷含量測定方法學驗證 由圖2～4可知，獐牙菜苦苷保留時間為6.775 min，得到回歸方程：y=641.66x+5.2603，線性范圍在0.213～1.298 mg/mL，相關系數(shù)為R2=0.9997；精密度實驗中RSD為0.26%，表明儀器的精密度良好；穩(wěn)定性實驗中24 h內(nèi)獐牙菜苦苷含量測定結(jié)果的RSD為0.002%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；重復性實驗中RSD為0.026%，表明重復性良好；加樣回收率實驗中RSD為0.084%。表明該法符合含量測定要求，綜上所述均滿足測定的要求。

圖2 肋柱花供試品(A)和獐牙菜苦苷標準品(B)HPLC圖譜

圖3 獐牙菜苦苷標準曲線圖

圖4 各因素對指標成分含量的影響圖

3.2 肋柱花獐牙菜苦苷提取工藝單因素試驗

3.2.1 乙醇濃度的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取次數(shù)3次，提取時間2.0 h，分別設50%、60%、70%、80%、90%乙醇 5個濃度進行提取，計算獐牙菜苦苷峰面積含量， 結(jié)果如圖4 A所示，獐牙菜苦苷含量在乙醇濃度為60%時達到峰值，故選擇60%乙醇為提取溶劑。

3.2.2 提取次數(shù)的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取濃度50%，提取時間2.0 h，分別設1、2、3、4、5個次數(shù)進行提取，計算獐牙菜苦苷峰含量。如圖4 D所示，獐牙菜苦苷含量在次數(shù)2時達到峰值，故選擇2次。

3.2.3 提取時間的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取濃度50%，提取次數(shù)為1次，分別設0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h等 5個時間進行提取，計算獐牙菜苦苷含量。如圖4 C所示，獐牙菜苦苷含量在時間2.0 h 時達到峰值，故選擇2.0 h為提取時間。

3.2.4 提取溶劑量的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，提取時間為2.0 h，提取濃度50%，提取次數(shù)為1次，分別設1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比進行提取，計算獐牙菜苦苷含量。如圖4 B所示，獐牙菜苦苷含量在倍數(shù)1∶10時達到峰值，故選擇1∶10倍量乙醇提取。

3.3 正交實驗結(jié)果 正交實驗方案及結(jié)果見表3，方差分析表見表4。結(jié)果表明，從R值和表4方差分析得知提取時間的影響最為顯著。且提取最佳工藝為A2B1C2D1，即提取濃度60%，料液比1∶10，提取時間2.0 h，提取次數(shù)2。

表3 正交實驗方案及結(jié)果

表4 方差分析

4 討論

肋柱花屬于地格達類蒙藥，蒙語為哈比日干地格達，是一類特色道地蒙藥材，組方或單方用于治療肝膽疾病。以肋柱花為君藥的地格達-4湯更是應用廣泛，臨床療效顯著。肋柱花主要化學成分獐牙菜苦苷為環(huán)烯醚萜類化合物，是含量最高的有效成分之一，占總比30.98%，具有保護肝臟、調(diào)節(jié)血脂異常、抗糖尿病、抗炎鎮(zhèn)痛和降脂等作用[7]。由于環(huán)烯醚萜通常以苷的形式存在，采用不同提取溶劑或者提取方法都對藥材中的物質(zhì)有影響，環(huán)烯醚萜類易被水解，性質(zhì)活躍，極性較大，易溶于水、乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等，故常用含水乙醇進行提取。郭小存等[13]在使用不同萃取法獲得了龍膽中總環(huán)烯醚萜苷的工藝后發(fā)現(xiàn)回流提取法顯著優(yōu)于其他方法，并以回流提取法為基礎,通過正交實驗確認了最佳的萃取工藝為提取溶劑70%乙醇，提取時間2 h，料液比1∶15。黎珊等[14]通過設計的單因素和正交試驗，優(yōu)選出在雞蛋花中總環(huán)烯醚萜的最佳萃取工藝為提取溶劑60%乙醇，提取時間1 h，料液比1∶25。張軻等[15]以平均回收率和總環(huán)烯醚萜的平均存在量為指標，經(jīng)過正交試驗的驗證得出白花蛇舌草中總環(huán)烯醚萜苷的最佳萃取工藝是提取溶劑90%乙醇，料液比1∶8，提取時間2 h，提取次數(shù)2次。因此本實驗選擇乙醇濃度，提取用量，提取時間，提取次數(shù)4個因素進行單因素實驗分析，并采用正交實驗優(yōu)化肋柱花中獐牙菜苦苷最佳提取工藝。

從單因素實驗結(jié)果來看，乙醇濃度考察中峰面積在60%時達到峰值，隨后逐漸下降。該結(jié)果與上述環(huán)烯醚萜類化合物的乙醇提取濃度接近，表明此類化合物在60%乙醇提取時含量可能最高。此外，提取次數(shù)2次時達到峰值，隨著提取次數(shù)增多含量變少，故表明此類成分可能對熱不穩(wěn)定，加熱時間越長含量越少。提取時間在0.5～1.5 h之間呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，在2.0 h時達到峰值，表明在此時間段為最佳提取時長。料液比在1∶10時到達峰值，但隨著比重的增加含量逐漸降低。正交實驗結(jié)果得出最佳提取條件為乙醇提取濃度60%，料液比1∶10，回流提取1次，每次提取時間2 h。各因素影響力順序為提取時間>乙醇濃度>提取用量>提取次數(shù)，其中提取時間和提取濃度的影響最為顯著。但因為藥物成份的復雜性，即使同一藥材不同提取物中的環(huán)烯醚萜苷含量也會出現(xiàn)不同[15]。環(huán)烯醚萜類及苷類的化學性質(zhì)并不穩(wěn)定，回流加熱時間過長也會對肋柱花中獐牙菜苦苷含量有一定的影響[16]。準確測定提取物中的含量以及篩選出準確專一的方法，還有待進一步完善。

5 結(jié)論

肋柱花作為蒙藥特色道地藥材，單用或組方使用在治療肝膽疾病具有顯著療效，但對其主要有效成分獐牙菜苦苷的最佳制備工藝研究較少。本實驗以獐牙菜苦苷的含量為指標，結(jié)合單因素考察和正交實驗，對影響肋柱花中獐牙菜苦苷萃取的因素與條件加以優(yōu)化，得到最佳提取工藝為乙醇提取濃度60%，料液比1∶10，回流提取1次，每次提取時間2 h，為進一步綜合開發(fā)利用肋柱花藥材打下了基礎。