駑藥液的抗炎作用研究

劉 嬌 梁 瀟 胡 濤 阮婧華 錢海兵*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中醫(yī)藥方證藥理研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 5500253.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001

駑藥液是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科實(shí)驗(yàn)室依據(jù)多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，選用大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜、黑骨藤5味天然草藥組成，在臨床上尤其是苗族地區(qū)被廣泛用于治療膝骨性關(guān)節(jié)炎等疾病，效果良好，副作用較小[1]?，F(xiàn)代研究[2-5]證明，駑藥液中大血藤水提物、乙酸乙酯部位及多糖對(duì)膠原性炎癥、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等炎癥有治療作用，醇提物中綠原酸被認(rèn)為是大血藤發(fā)揮抗炎作用的指標(biāo)性成分。飛龍掌血中有14個(gè)生物堿類成分被認(rèn)為是其發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵活性成分，其中弗林德堿、白屈菜紅堿被報(bào)道具有顯著抗炎作用，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及心肌缺血性炎癥有治療作用[6-10]。透骨香醇提部位和水提部位及揮發(fā)油對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和膠原型關(guān)節(jié)炎有抑制作用，其中水楊酸甲酯和兒茶素是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分[11-14]。白屈菜中生物堿類成分有一定的抗炎作用，對(duì)軟組織損傷、潰瘍性腸炎有一定的治療作用[15-17]；黑骨藤醇提物中咖啡?；鼘幩犷惢衔锞哂幸种迫祟愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(MH7A細(xì)胞)增殖的作用，甾類、萜類、黃酮類，包含杠柳毒甙、蘿藦苷元、熊果酸、胡蘿卜甙等10種活性成分被預(yù)測(cè)為是治療RA的活性成分[18-19]。

根據(jù)前期研究，實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步運(yùn)用二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹方法驗(yàn)證由大血藤、透骨香、白屈菜、飛龍掌血和黑骨藤組成的駑藥液的抗炎作用，以期為開(kāi)發(fā)運(yùn)用于臨床治療炎癥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量為180～220 g；KM小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為 SCXK(湘)2019-0014，許可證號(hào)為 No.430726210100136331。所有動(dòng)物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物及試劑 駑藥液(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)： 20210525)；二甲苯(重慶川東化工有限公司 AR)；角叉菜膠(阿拉丁)；腫瘤壞死因子- α (TNF- α)、前列腺素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素- 6(IL- 6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特科技股份有限公司。

1.3 儀器 游標(biāo)卡尺；酶標(biāo)儀；精密分析天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠 JJ224BF)；XK-400高速離心機(jī)(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；8mm打孔器；烘箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 GZX-9240MBE)。

2 方法

2.1 駑藥液的制備 由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室自制。以原藥液作為高劑量，加0.9%生理鹽水稀釋2倍和4倍分別作為中劑量組和低劑量組。

2.2 動(dòng)物模型建立、分組及給藥

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 選取實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周的KM小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組各10只，分別為模型組、對(duì)照組和駑藥液高、中、低劑量組。實(shí)驗(yàn)前對(duì)小鼠腹部進(jìn)行備皮，備皮區(qū)域?yàn)? cm×2 cm，每日涂抹藥液2次(早晚各1次)，連續(xù)給藥7 d，模型組涂抹等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，于小鼠右耳兩面均勻涂二甲苯 0.05 mL/只致炎，左耳不涂為正常耳。致炎1 h后頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用8 mm打孔器在兩耳對(duì)稱取耳片，于分析天平上稱重，以左右耳片質(zhì)量差值表示炎癥腫脹度，計(jì)算抑制率。

腫脹度(mg)=右耳片重量-左耳片重量

抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%

2.2.2 角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn) 選取實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周的Wistar大鼠30只， 雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組各6只，分別為空白組、模型對(duì)照組和駑藥液高、中、低劑量組。實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠腹部進(jìn)行備皮，備皮區(qū)域?yàn)? cm×2 cm，每日涂抹藥2次(早晚各1次)，連續(xù)給藥7 d，空白組和模型組涂抹等體積蒸餾水。末次給藥后1 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠正常足掌厚度，作為實(shí)驗(yàn)前足腫脹度，每只小鼠右后肢足爪皮下注射0.1%角叉菜膠0.1 mL/只致炎。并于注射后第1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)分別測(cè)量1次，記錄結(jié)果，計(jì)算腫脹度。

腫脹度(mm)=致炎后足腫脹度-致炎前足腫脹度

2.3 大鼠血清中TNF- α、PGE2、IL- 6水平測(cè)定 腫脹度測(cè)量結(jié)束后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)進(jìn)行麻醉。實(shí)驗(yàn)大鼠在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置 30 min 使血液分層。6000 r/min 下離心 10 min，分裝血清，按試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)血清中炎癥因子 TNF-α、PGE2、IL-6 含量。在 550 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)量各孔 OD 值即吸光度，繪制酶標(biāo)曲線，計(jì)算樣本濃度。

3 結(jié)果

3.1 駑藥液對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 二甲苯致炎后各組小鼠右耳隨即出現(xiàn)高度紅腫現(xiàn)象。與模型組比較，駑藥液高劑量組、駑藥液中劑量組和駑藥液低劑量組對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹均有抑制作用，抑制率分別為33.00%、29.00%、23.00%(P<0.05)。腫脹抑制率隨駑藥液給藥劑量的增加逐漸升高(見(jiàn)表1)，說(shuō)明駑藥液的抗炎作用具有一定的量效關(guān)系。

表1 駑藥液對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

3.2 駑藥液對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響 與空白組相比，模型組大鼠在注射角叉菜膠1 h、2 h、4 h、6 h后，1～6 h內(nèi)足腫脹度明顯，在4 h時(shí)到達(dá)最大值，有顯著性差異(P<0.05)，模型建立成功；與模型組相比，在0～1 h、2～6 h 內(nèi)，駑藥液高、中、低劑量組對(duì)均能顯著的抑制大鼠足腫脹(P<0.05)，效果不持續(xù)(見(jiàn)表2)。

表2 駑藥液對(duì)腳叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

3.3 駑藥液對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹血清TNF- α、PGE2、IL- 6水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、PGE2、IL-6水平含量明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，駑藥液高劑量、駑藥液中劑量及駑藥液低劑量對(duì)大鼠血清中IL-6水平有明顯的抑制作用，有顯著性差異(P<0.05)；駑藥液高劑量和駑藥液低劑量對(duì)大鼠血清中PGE2水平有明顯的抑制作用，有顯著性差異(P<0.05)，駑藥液中劑量對(duì)大鼠血清中PGE2水平無(wú)影響。駑藥液高劑量、駑藥液中劑量和駑藥液低劑量對(duì)大鼠血清中TNF-α水平無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 駑藥液對(duì)角叉菜膠致足腫脹大鼠血清中IL-6、TNF-α、PGE2 含量的影響

4 討論

苗醫(yī)藥講究將藥物分為： 領(lǐng)頭藥(主藥： 針對(duì)主要癥狀發(fā)揮主要作用)、鋪底藥(配藥： 針對(duì)次要病癥和次要癥狀，加強(qiáng)主藥作用)、監(jiān)護(hù)藥(引藥： 促進(jìn)領(lǐng)頭藥和監(jiān)護(hù)藥的藥性，到達(dá)病變部位)，與中藥組方配伍中“ 君、臣、佐、使”有異曲同工之妙。駑藥液由大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜、黑骨藤五味苗藥組成，臨床上常用于治療膝骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，駑藥液中領(lǐng)頭藥當(dāng)數(shù)黑骨藤，以舒筋活血，祛風(fēng)除濕；其中鋪底藥為大血藤、黑骨藤、透骨香等，加強(qiáng)領(lǐng)頭藥的祛風(fēng)除濕的功效，兼?zhèn)浠钛猍20]?，F(xiàn)代研究顯示，駑藥液中大血藤醇提物，飛龍掌血、白屈菜的生物堿，透骨香、黑骨藤醇提物等具有良好的抗炎作用[5-6,21-23]。本實(shí)驗(yàn)主要從駑藥液的抗炎作用方面進(jìn)行探究，采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)初步探討駑藥液的抗炎作用。

二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，駑藥液能降低小鼠耳廓腫脹程度與大鼠足腫脹的程度。PGE2屬于花生四烯酸代謝產(chǎn)物，由炎癥反應(yīng)刺激后產(chǎn)生，可導(dǎo)致發(fā)熱、疼痛、血管擴(kuò)張、通透性升高等炎癥反應(yīng)；細(xì)胞因子IL-6可引起急性炎癥的發(fā)熱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，駑藥液對(duì)大鼠血清中IL-6和PGE2產(chǎn)生有抑制作用，對(duì)TNF-α無(wú)影響。二甲苯和角叉菜膠能通過(guò)化學(xué)刺激，引起局部血管擴(kuò)張、通透性增加，進(jìn)而引起局部滲出、水腫，屬急性和亞急性炎癥反應(yīng)，駑藥液發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制可能與抑制促炎因子IL-6和PGE2表達(dá)有關(guān)。

綜上，駑藥液對(duì)急性或亞急性炎癥有良好的作用，為其臨床主要應(yīng)用于膝骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療提供了一定的藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。