干巴菌菌種培養(yǎng)基碳源和氮源篩選

李方橋 譚愛(ài)華* 喻 敏 何成忠 望宏端

（1湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌 443000；2宜昌山野味農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社，湖北宜昌 443100）

干巴菌（Thelephora ganbajun Zang）又名干巴革菌[1]，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）革菌目（Thelephorales）革菌科（Thelephoraceae）革菌屬（Thelephora），是一類風(fēng)味獨(dú)特的高等可食用真菌[2]。干巴菌主要分布在滇中高原，主產(chǎn)地為云南昆明、玉溪、曲靖、楚雄，其次為云南思茅、麗江、保山、大理，貴州西部、四川南部[3]、福建武夷山及湖北西部的局部地區(qū)也有少量分布，多生長(zhǎng)于海拔600～2 500 m的松林地帶[4]。湖北省干巴菌主要分布在宜昌市夷陵區(qū)和興山水月寺境內(nèi)。

干巴菌是野生食用菌中的上品。其菌香濃郁、生嘗微甘，似有海藻氣味，肉質(zhì)堅(jiān)韌，有腌牛肉干（民間俗稱“干巴”）的濃郁香味，因而得名干巴菌。干巴菌含有鈣、鐵、蛋白質(zhì)、維生素B1等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及抗氧化物質(zhì)，具有清除人體內(nèi)自由基、延緩衰老、強(qiáng)身健體等功效[4]，是一種極具開發(fā)潛力的珍稀食用菌。干巴菌屬于外生菌根食用菌，目前尚未人工栽培成功，市場(chǎng)上的干巴菌均來(lái)自野生[5]。由于具有生長(zhǎng)環(huán)境獨(dú)特、經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值較高以及難以人工栽培等特點(diǎn)，其自然資源極其有限。本研究主要針對(duì)采集于我國(guó)湖北省宜昌市夷陵區(qū)的野生干巴菌菌株，通過(guò)利用不同碳源、氮源配方的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察干巴菌菌絲生長(zhǎng)情況，開展菌種培養(yǎng)基碳源、氮源篩選試驗(yàn)，以期為后期根據(jù)野生干巴菌生物學(xué)特性擇點(diǎn)進(jìn)行仿野生人工栽培研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年7月，課題組在湖北省宜昌市夷陵區(qū)下堡坪鄉(xiāng)麥子山村采集干巴菌子實(shí)體，在湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離、純化培養(yǎng)并保存，編號(hào)Tg2018-1。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

本試驗(yàn)?zāi)阜N培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)在湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，栽培種培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)在宜昌山野味農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社的菌種廠進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 母種培養(yǎng)基碳源、氮源的篩選。首先制備松針?biāo)?，即稱取松針200 g，加入1 000 mL蒸餾水，煮沸30 min后用4層紗布過(guò)濾，取上清液備用。

母種培養(yǎng)基主要碳源分別為馬鈴薯、糙米、紅薯、芋頭，均去皮切碎。每種碳源各稱取200 g，分別加1 000 mL松針?biāo)蠓?0 min至熟而不爛，4層紗布過(guò)濾取汁，然后各加葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀 2 g、硫酸鎂 0.5 g、硫酸亞鐵 0.5 g、瓊脂15 g，待瓊脂完全融化后，分別補(bǔ)松針?biāo)? 000 mL，混勻，pH值自然。同時(shí)，以馬鈴薯為主要碳源，其他成分同上，所有用水改松針?biāo)疄檎麴s水作為對(duì)照組（CK1）。

母種培養(yǎng)基主要氮源分別為蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨和酵母粉1∶1的混合物。每種氮源各取2 g，分別添加馬鈴薯（去皮）200 g，加1 000 mL松針?biāo)蠓?0 min至熟而不爛，4層紗布過(guò)濾取汁，然后各加葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.5 g、瓊脂15 g，待瓊脂完全融化后，分別補(bǔ)松針?biāo)? 000 mL，混勻，pH值自然。同時(shí)，以蛋白胨為主要氮源，其他成分同上，所有用水改松針?biāo)疄檎麴s水作為對(duì)照組（CK2）。

以上培養(yǎng)基配好后，用20 mm×200 mm試管常規(guī)分裝，121℃高壓滅菌40 min，制作成試管斜面培養(yǎng)基；無(wú)菌操作接入干巴菌菌種后，置于25℃恒溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，觀察記載干巴菌母種在不同碳源試管培養(yǎng)基和不同氮源試管培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)等情況。每種培養(yǎng)基接種10支試管。

1.3.2 栽培種培養(yǎng)基碳源、氮源的篩選。碳源篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)了5個(gè)處理，分別為4個(gè)加40%松針、添加不同碳源的處理和1個(gè)不加松針、以棉籽殼為碳源的對(duì)照組（CK3），具體培養(yǎng)基配方見表1。氮源篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)了5個(gè)處理，分別為4個(gè)加40%松針、添加不同氮源的處理和1個(gè)40%棉籽殼代替松針、以麩皮為主要氮源的對(duì)照組（CK4），具體見表2。

表1 干巴菌栽培種不同碳源培養(yǎng)基配方

表2 干巴菌栽培種不同氮源培養(yǎng)基配方

制作栽培種培養(yǎng)基時(shí)，各配方中麥粒或者玉米芯、棉籽殼、糯米均提前一天按照配方稱量，用水浸泡24 h后撈出瀝干水分，再加入其他主料、輔料，充分拌勻，調(diào)節(jié)pH值和含水量；裝入規(guī)格為15 cm×28 cm×40 μm 的耐 126℃高溫、符合 GB 9688—1988衛(wèi)生規(guī)定的聚丙烯塑料袋內(nèi)，每袋裝干料0.30 kg；用LDZF-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓滅菌2 h，冷卻到28℃以下后無(wú)菌接種。每個(gè)處理接種10袋，置于25℃左右的恒溫培養(yǎng)室內(nèi)避光培養(yǎng)，相對(duì)濕度65%～70%。

1.4 觀察內(nèi)容與測(cè)定方法

連續(xù)培養(yǎng)3 d后，在干巴菌菌落邊緣，用記號(hào)筆在試管或菌袋上畫起始線。長(zhǎng)到試管或者菌袋1/2之前每2 d觀察記錄一次，1/2之后每天觀察記錄一次，觀察記錄各培養(yǎng)基中干巴菌菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)。待母種菌絲充滿試管、栽培種菌絲充滿菌袋后，再用記號(hào)筆畫終點(diǎn)線，用游標(biāo)卡尺測(cè)量起止點(diǎn)間菌絲體長(zhǎng)度，計(jì)算菌絲體的平均生長(zhǎng)速度和滿管（袋）天數(shù)，并進(jìn)行差異顯著性分析。試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種培養(yǎng)基中干巴菌菌絲的生長(zhǎng)情況

2.1.1 不同碳源培養(yǎng)基中母種菌絲生長(zhǎng)情況。母種在不同碳源培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況見表3。由表3可知，干巴菌菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度不同，由快到慢依次為馬鈴薯（4.530 mm/d）、紅薯（4.190 mm/d）、芋頭（3.450 mm/d）、糙米（3.280 mm/d）、馬鈴薯對(duì)照組（2.850 mm/d）。所有用松針?biāo)呐囵B(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度均快于用蒸餾水的對(duì)照組（CK1），而且差異顯著。

表3 母種不同碳源培養(yǎng)基干巴菌菌絲生長(zhǎng)情況

在加松針?biāo)?個(gè)配方中，以馬鈴薯為碳源與以紅薯為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度差異不顯著，但均與分別以糙米、芋頭為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著。表明干巴菌在分別以馬鈴薯、紅薯為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度較快，馬鈴薯和紅薯是干巴菌母種制備中碳源的首選。從菌落形態(tài)看，各處理菌落均為圓形，但干巴菌菌絲在分別以馬鈴薯、糙米為碳源的培養(yǎng)基中菌落邊緣均整齊，在分別以紅薯、芋頭為碳源的培養(yǎng)基中邊緣均不太整齊。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲密度看，干巴菌菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)從強(qiáng)到弱依次為馬鈴薯、紅薯、芋頭、糙米，與生長(zhǎng)速度次序一致；在分別以馬鈴薯、糙米和紅薯為碳源的培養(yǎng)基中菌絲均比較粗壯、濃密，在以芋頭為碳源的培養(yǎng)基中菌絲較細(xì)、密度小一些，同時(shí)在分別以紅薯和芋頭為碳源的培養(yǎng)基中菌絲密度不太均勻。從菌絲顏色看，在4種培養(yǎng)基中，干巴菌菌絲均為白色，外緣較淡。綜合來(lái)看，干巴菌母種培養(yǎng)基以馬鈴薯作碳源較好，配制培養(yǎng)基用松針?biāo)Ч黠@。

2.1.2 不同氮源培養(yǎng)基中母種菌絲生長(zhǎng)情況。母種在不同氮源培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況見表4。由表4可知，干巴菌菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度不同，由快到慢依次為50%蛋白胨+50%酵母粉（5.060 mm/d）、蛋白胨（4.820 mm/d）、酵母粉（3.840 mm/d）、牛肉膏（3.580 mm/d）、蛋白胨對(duì)照組（3.140 mm/d）。 所有用松針?biāo)呐囵B(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度均快于用蒸餾水的對(duì)照組（CK2），而且差異顯著。在加松針?biāo)?個(gè)配方中，以50%蛋白胨+50%酵母粉為氮源與以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)差異不顯著，但均與分別以牛肉膏、酵母粉為氮源的培養(yǎng)基差異顯著。從菌落形態(tài)看，各處理菌落均為圓形，除以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中菌落邊緣不太整齊外，其他培養(yǎng)基中菌落邊緣均整齊。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲密度看，也只有以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)勢(shì)弱、不夠濃密、不太均勻。從菌絲顏色看，各培養(yǎng)基中沒(méi)有明顯差別。綜合來(lái)看，干巴菌母種培養(yǎng)基以50%蛋白胨+50%酵母粉作氮源較好，配制培養(yǎng)基用松針?biāo)Ч黠@。

表4 母種不同氮源培養(yǎng)基干巴菌菌絲生長(zhǎng)情況

2.2 栽培種培養(yǎng)基中干巴菌菌絲的生長(zhǎng)情況

2.2.1 不同碳源培養(yǎng)基中栽培種菌絲生長(zhǎng)情況。栽培種在不同碳源培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況見表5。由表5可知，干巴菌菌絲在不同處理培養(yǎng)基中菌絲滿袋時(shí)間由快到慢依次為處理 4（39 d）、處理 1（47 d）、處理 3（48 d）、處理 2（50 d）、CK3（56 d），菌絲生長(zhǎng)速度由快到慢的次序與滿袋時(shí)間一致，所有添加松針的培養(yǎng)基（處理 1、2、3、4）中菌絲生長(zhǎng)速度均明顯快于不添加松針的對(duì)照組（CK3），而且差異顯著。在4個(gè)添加松針的供試培養(yǎng)基中，處理4與處理1、2、3相比，滿袋時(shí)間及菌絲生長(zhǎng)速度均存在顯著性差異。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲密度看，處理4明顯優(yōu)于處理1、2、3及CK3。從菌絲顏色看，各處理相差不大，均為白色。綜合來(lái)看，以處理4效果最好，即干巴菌栽培種培養(yǎng)基以糯米作主要碳源，而且添加40%的松針。

表5 栽培種不同碳源培養(yǎng)基干巴菌菌絲生長(zhǎng)情況

2.2.2 不同氮源培養(yǎng)基中栽培種菌絲生長(zhǎng)情況。栽培種在不同氮源培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況見表6。由表6可知，干巴菌菌絲在不同處理培養(yǎng)基中菌絲滿袋時(shí)間由快到慢依次為處理D（40 d）、處理A（47 d）、處理 B（49 d）、處理 C（55 d）、CK4（60 d），菌絲生長(zhǎng)速度由快到慢的次序與滿袋時(shí)間一致，所有添加松針的培養(yǎng)基（處理A、B、C、D）中菌絲生長(zhǎng)速度均明顯快于不添加松針的對(duì)照組（CK4），而且差異顯著。在4個(gè)添加松針的供試培養(yǎng)基中，處理D與處理A、B、C相比，滿袋時(shí)間及菌絲生長(zhǎng)速度均存在顯著性差異。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲密度看，處理D明顯優(yōu)于處理A、B、C。從菌絲顏色看，各處理相差不大，均為白色。綜合來(lái)看，以處理D效果最好，即干巴菌栽培種培養(yǎng)基以麩皮作主要氮源，而且添加40%的松針。

表6 栽培種不同氮源培養(yǎng)基干巴菌菌絲生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同碳源、氮源的培養(yǎng)基對(duì)干巴菌菌絲生長(zhǎng)的影響較大。干巴菌的母種培養(yǎng)基用松針?biāo)渲?，栽培種培養(yǎng)基中添加40%的松針，其菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)、密度均優(yōu)于對(duì)照組。綜合菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲密度來(lái)看，干巴菌母種培養(yǎng)基最適合的主要碳源是馬鈴薯，最適合的主要氮源是蛋白胨與酵母粉1∶1的混合物；干巴菌栽培種培養(yǎng)基最適合的主要碳源是糯米，最適合的主要氮源是麩皮。本試驗(yàn)中其他條件和因素均采用常規(guī)食用菌菌種培養(yǎng)配方和條件，針對(duì)干巴菌各級(jí)菌種生產(chǎn)的最佳配方和條件還需進(jìn)一步研究。

外生菌根真菌需要與其宿主植物共生才能完成生長(zhǎng)發(fā)育，如果要得到干巴菌子實(shí)體，必然要先合成菌根或進(jìn)行人工促繁，而培養(yǎng)優(yōu)良外生菌根真菌菌種是建立菌根化技術(shù)的重要前提[6]。本課題組目前已培養(yǎng)得到大量干巴菌栽培種，使下一步的仿野生栽培干巴菌成為可能。