寧夏賀蘭山東麓老齡葡萄園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

潘新宇，李 茜,2， 劉松濤，何 俊,2，孫兆軍,2,4

(1寧夏大學(xué) 地理科學(xué)與規(guī)劃學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2教育部中阿旱區(qū)特色資源與環(huán)境治理國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021； 3寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；4寧夏(中阿)旱區(qū)資源評(píng)價(jià)與環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021)

葡萄作為世界上主要種植果樹之一，在我國的栽培歷史十分悠久。葡萄樹的樹齡平均在60年左右，當(dāng)樹齡超過20～30年后，植株會(huì)陸續(xù)出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，導(dǎo)致生產(chǎn)力下降，影響果農(nóng)的收入[1]。寧夏回族自治區(qū)的葡萄種植已形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，在多年的發(fā)展下，已經(jīng)成為了當(dāng)?shù)氐奶厣珒?yōu)勢產(chǎn)業(yè)[2]。由于受到社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益、栽培結(jié)構(gòu)的約束以及人為栽培習(xí)慣的影響，寧夏地區(qū)葡萄連作的時(shí)間、面積不斷加大[3]。目前，隨著葡萄種植年限的延長，當(dāng)?shù)卦S多老齡葡萄園陸續(xù)出現(xiàn)低產(chǎn)量、高病蟲害等問題，已成為寧夏地區(qū)葡萄種植產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要制約因素[4]。

真菌是土壤中的重要微生物組成，在植物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力維護(hù)方面起著重要的作用[5]。土壤真菌與土壤環(huán)境是否有相同或不同的地理分布格局，以及是哪些驅(qū)動(dòng)因素導(dǎo)致此類格局的出現(xiàn)，是當(dāng)今眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)課題[6]。Benizri等[7]研究發(fā)現(xiàn)，長期種植桃樹會(huì)導(dǎo)致土壤中的病原菌芽孢桿菌(Bacillu)含量顯著增加。Weller等[8]研究指出，細(xì)菌在根際土壤間的相對(duì)豐度較非根際土壤高10～100倍；土壤養(yǎng)分失衡、微生物群落結(jié)構(gòu)紊亂、前茬作物殘留毒害等是目前普遍認(rèn)同的引起葡萄種植問題的主要原因[9]。藺君娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄的不同栽培方式會(huì)引起根際土壤真菌、細(xì)菌數(shù)量變化上的差異；史芳芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄根際土壤真菌豐度組成特征表現(xiàn)為子囊菌門、擔(dān)子菌門真菌所占豐度最高。目前針對(duì)寧夏賀蘭山東麓老齡葡萄根際與非根際土壤不同土層深度真菌群落的組成及多樣性變化尚缺乏系統(tǒng)的研究。

土壤微生物對(duì)葡萄種植能產(chǎn)生生長抑制和促進(jìn)作用，促進(jìn)作用表現(xiàn)為根際土壤中的部分微生物因自身功能可以幫助植物生長代謝，抑制作用則體現(xiàn)在土壤病原菌對(duì)植物生長發(fā)育過程的損害以及由于連作引起的土壤微生物群落、結(jié)構(gòu)改變[12]。為了深入研究寧夏賀蘭山東麓老齡葡萄園土壤真菌群落組成及物種多樣性，本研究對(duì)該地區(qū)種植20年的葡萄園根際與非根際土壤真菌群落進(jìn)行高通量測序，分析長期種植葡萄后根際與非根際土壤真菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，以期為寧夏賀蘭山東麓老齡葡萄園的科學(xué)管理和可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于寧夏回族自治區(qū)賀蘭山東麓青銅峽市甘城子“寧夏西鴿酒莊葡萄種植示范基地”，地處105°55′01″ E，38°03′28″ N。為中溫帶大陸性氣候，年均降水量為185.4 mm，試驗(yàn)地土壤類型為普通灰鈣土[13]。試驗(yàn)區(qū)土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

表1 試驗(yàn)區(qū)土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Soil basic properties in experiment field

1.2 土壤樣品采集

選取賀蘭山東麓種植20年的釀酒葡萄“赤霞珠”葡萄園，在園內(nèi)挑選3個(gè)植株長勢相對(duì)均勻的樣地(樣地面積200 m×200 m，同時(shí)避開田埂和道路)，每個(gè)樣地按對(duì)角線法選取5株生長健壯的葡萄植株，采用抖落法[14]，于2021年6月中旬分別采集0～20，20～40，40～60 cm土層植株根際土壤和非根際土壤。采集根際土壤時(shí)，先抖落葡萄根系上的大塊土粒，再使用毛刷將吸附在根系上的殘留土壤刷落收集，收集的5株土樣混合為一個(gè)樣品，3個(gè)樣地3次重復(fù)，0～20，20～40，40～60 cm土層根際土壤依次記為CS20、CS40和CS60；采集非根際土壤時(shí)，選擇距主根1.5 m處無葡萄根系分布且未受人為影響的區(qū)域垂直挖取，收集的5株土樣混合為一個(gè)樣品，3個(gè)樣地3次重復(fù)，0～20，20～40，40～60 cm土層的非根際土壤依次記為NCS20、NCS40、NCS60。將采集到的土壤樣本收集到滅菌的冷凍離心管置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃低溫保存用于高通量測序[15]。

1.3 土壤真菌檢測方法

根據(jù)CTAB法[16]進(jìn)行土壤樣品基因組DNA的提取，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，使用無菌水將樣品稀釋至1 ng/μL；以所獲取的基因組DNA 作為模板，使用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間(ITS1-ITS2)的特異性引物(ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGAAGTAA-3′;ITS2：5′-GCTG-CTGCGTTCTTCATCGATGGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxn建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后進(jìn)行上機(jī)測序。

使用Cutadapt(V1.9.1)對(duì)讀長(reads)進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切、過濾、嵌合體序列比對(duì)等操作后，得到最終的有效數(shù)據(jù)(clean reads)[18-19]。使用Uparse(v7.0.1001)對(duì)所有樣品全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%一致性將序列聚類成OTUs(Operational Taxonomic Units)[20]，使用QIIME(v1.9.1)軟件進(jìn)行物種注釋分析[21]，確定真菌物種組成(門、綱、目、科、屬)及其相對(duì)豐度等信息，進(jìn)一步采用α多樣性(alpha diversity)分析樣品真菌群落的豐富度(Chao1、ACE)和多樣性(Shannon、Simpson);采用花瓣圖分析不同土樣共有的OTUs;采用β多樣性(beta diversity)分析樣品真菌群落的結(jié)構(gòu)特征(Weighted Unifrac距離)，挖掘樣品之間的差異[22]。PCR擴(kuò)增及測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS2 6.0軟件對(duì)α多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(one way ANOVA,Tukeyt-test)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣測序質(zhì)量分析

對(duì)葡萄根際土壤與非根際土壤18個(gè)樣品(每個(gè)土樣3次重復(fù))進(jìn)行測序后，共獲得1 483 999對(duì)讀長(reads)，通過篩選后得到1 442 891條有效數(shù)據(jù)，其中根際土壤獲得721 321條有效數(shù)據(jù)，非根際土壤獲得721 570條有效數(shù)據(jù)。以97%一致性對(duì)所有樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，共獲得1 056個(gè)用于分類的OTUs。根際土壤中用于分類的真菌OTUs為911個(gè)，非根際土壤中用于分類的真菌OTUs為955個(gè)。稀釋曲線是從樣品中隨機(jī)抽取定量數(shù)據(jù)，用來直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性。由圖1可知，當(dāng)抽取的序列數(shù)超過19 944條時(shí)曲線平緩，表明測序結(jié)果合理可靠。

圖1 賀蘭山東麓老齡葡萄根際與非根際土壤真菌 OTUs數(shù)量稀釋曲線Fig.1 Dilution of OTUs number of aged grape rhizosphere and non-rhizosphere soil fungi at the eastern foot of Helan Mountain

2.2 葡萄根際與非根際土壤真菌α多樣性分析

賀蘭山東麓老齡赤霞珠葡萄根際與非根際土壤真菌的α多樣性指數(shù)如表2所示，其中Chao1、ACE指數(shù)和Shannon、Simpson指數(shù)分別為表征群落分布的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)。由表2可見，CS20、CS40、CS60的ACE指數(shù)平均值分別為1 296.32，1 141.76和1 161.90，而NCS20、NCS40、NCS60的ACE指數(shù)平均值分別為870.21，920.83和847.87，表明群落分布豐富度ACE指數(shù)在各垂直土層中均表現(xiàn)為根際土壤>非根際土壤，且根際土壤與非根際土壤間均存在顯著性差異(P<0.05)。Chao1指數(shù)的變化規(guī)律與ACE指數(shù)一致。CS20、CS40、CS60的Shannon指數(shù)平均值分別為7.15，6.49和6.04，而NCS20、NCS40、NCS60的Shannon指數(shù)平均值分別為6.61，6.52和6.09，表明在0～20 cm土層中，根際土壤真菌群落多樣性顯著高于非根際土壤，而在20～40和40～60 cm土層中二者差異不顯著。

表2 賀蘭山東麓老齡葡萄根際與非根際土壤0～60 cm土層真菌α多樣性指數(shù)的比較Table 2 Comparison of α diversity index of aged grape rhizosphere and non-rhizosphere soils in 0-60 cm soil layers at eastern foot of Helan Mountain

花瓣圖可以直接反映不同土樣之間共有和特有的OTUs。賀蘭山東麓老齡赤霞珠葡萄根際土壤與非根際土壤真菌OTUs花瓣圖如圖2所示。圖2顯示，經(jīng)測序分析共得到1 056個(gè)OTUs，各樣本間共有OTUs數(shù)量為360個(gè)。其中CS20、NCS20特有OTUs數(shù)量分別為193和135個(gè)；CS40、NCS40特有OTUs數(shù)量分別為124和221個(gè)；CS60、NCS60特有OTUs數(shù)量分別為234和239個(gè)。綜合α多樣性指數(shù)和OTUs花瓣圖，可以發(fā)現(xiàn)葡萄根際土壤與非根際土壤真菌組成較為豐富，但在真菌組成結(jié)構(gòu)、豐富度上存在一定差異。

2.3 葡萄根際與非根際土壤垂直土層真菌組成分析

物種組成分析可以反映樣本在分類學(xué)上的群落結(jié)構(gòu)[11]。物種注釋分析表明，賀蘭山東麓老齡赤霞珠葡萄根際與非根際土壤樣本中的真菌分屬17門、47綱、109目、211科、346屬。圖3展示了門水平上物種相對(duì)豐度排在前10位的分類結(jié)果，分別為子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉菌門(Mortierellomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、毛霉亞菌門(Mucoromycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、Aphelidiomycota門、Calcarisporiellomycota門、芽枝霉菌門(Blastocladiomycota)和Rozellomycota門，其中子囊菌門、被孢霉菌門和擔(dān)子菌門在所有土壤樣品中都屬于優(yōu)勢菌門，其平均相對(duì)豐度分別為51.04%，5.68%，4.89%，在CS20中的相對(duì)豐度分別為44.16%，11.20%和8.37%，在NCS20中的相對(duì)豐度分別為52.28%，1.06%和5.15%，在CS40中的相對(duì)豐度分別為43.91%，11.80%和6.38%，在NCS40中的相對(duì)豐度分別為43.05%，3.38%和3.37%，在CS60中的相對(duì)豐度分別為57.52%，5.95%和3.27%，在NCS60中的相對(duì)豐度分別為65.30%，1.43%和2.82%。

對(duì)比分析根際土壤與非根際土壤可以發(fā)現(xiàn)，被孢霉菌門在CS20、CS40、CS60中的相對(duì)豐度分別是NCS20、NCS40、NCS60的10.57，3.49和4.16倍；擔(dān)子菌門在CS20、CS40、CS60中的相對(duì)豐度分別是NCS20、NCS40、NCS60的1.63，1.89和1.16倍；子囊菌門在CS40中的相對(duì)豐度是NCS40的1.02倍，在NCS20、NCS60中的相對(duì)豐度分別是CS20、CS60的1.18和1.14倍。該結(jié)果表明，被孢霉菌門和擔(dān)子菌門在根際土壤各垂直土層中均有富集，而子囊菌門僅在20～40 cm土層根際土壤(CS40)中富集。

圖2 賀蘭山東麓老齡葡萄根際與 非根際土壤真菌OTUs花瓣圖Fig.2 OTUs petals of aged grape rhizosphere soil and non-rhizosphere soil fungi at the eastern foot of Helan Mountain

圖3 賀蘭山東麓老齡葡萄根際與非根際真菌門水平相對(duì)豐度的比較Fig.3 Comparison of horizontal relative abundance of phyla between rhizosphere soil and non-rhizosphere soil of aged grape at the eastern foot of Helan Mountain

由圖4可以發(fā)現(xiàn)，在綱、目、科、屬水平上，20年赤霞珠葡萄根際與非根際土壤樣品真菌在群落組成和豐度上存在不同。

在綱水平上，糞殼菌綱(Sordariomycetes)是CS20、CS40、CS60中的第一優(yōu)勢菌種，其相對(duì)豐度分別為28.09%，26.55%和34.77%；其次是被孢霉菌綱(Mortierellomycetes)，其相對(duì)豐度分別為11.20%，11.08%和5.95%；再次是錘舌菌綱(Leotiomycetes)，其相對(duì)豐度分別為2.49%，9.65%和9.65%。作為子囊菌門(Ascomycota)中的第一大綱，糞殼菌綱相對(duì)豐度在葡萄根際土壤不同土層中差異較大，其在CS60中的相對(duì)豐度是CS40與CS20的1.31和1.24倍(圖4-A)。

在目水平上，肉座菌目(Hypocreales)是CS20、CS40、CS60中的第一優(yōu)勢菌種，其相對(duì)豐度分別為25.25%，23.84%和29.23%；其次是被孢霉菌目(Mortierellales)，其相對(duì)豐度分別為11.20%，11.08%和5.95%；再次是Thelebolales目，其相對(duì)豐度分別為1.90%，6.34%和5.24%(圖4-B)。

在科水平上，叢赤殼菌科(Nectriaceae)是CS20、CS40、CS60中的第一優(yōu)勢菌種，其相對(duì)豐度分別為20.17%，20.51%和24.63%；其次是被孢霉菌科(Mortierellaceae)，其相對(duì)豐度分別為11.20%，11.08%和5.94%；再次是嗜熱囊菌科(Pseudeurotiaceae)，其相對(duì)豐度分別為0.68%，2.23%和6.94%(圖4-C)。

圖4 賀蘭山東麓老齡葡萄根際與非根際土壤真菌綱(A)、目(B)、科(C)和屬水平(D)的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of fungi at class (A),order (B),family (C) and genus level (D) of aged grape rhizosphere soil and non-rhizosphere soil at the eastern foot of Helan Mountain

在屬水平上，新叢赤殼菌屬(Neonectria)是CS20、CS40、CS60中的第一優(yōu)勢菌種，其相對(duì)豐度分別為3.60%，9.48%和18.33%；其次是被孢霉菌屬(Mortierella)，其相對(duì)豐度分別為7.05%，10.35%和5.46%；再次是Dactylonectria屬，其相對(duì)豐度分別為8.11%，6.82%和3.41%。其中，新叢赤殼菌屬和Dactylonectria屬真菌群落相對(duì)豐度在CS20、CS40、CS60間發(fā)生了明顯變化。CS60中新叢赤殼菌屬的相對(duì)豐度是CS40和CS20的1.93和5.09倍，Dactylonectria屬在CS40和CS20的相對(duì)豐度是CS60的2.38和2.00倍(圖4-D)。另外，測序分析發(fā)現(xiàn)，在0～20，20～40和40～60 cm土層根際土壤中，小球腔菌屬(Leptosphaeria)真菌相對(duì)豐度分別為0.67%，2.22%和6.48%，可知其相對(duì)豐度在根際土壤垂直土層中呈遞增趨勢。

在綱水平上，NCS20、NCS40和NCS60的第一優(yōu)勢菌種均為糞殼菌綱，其相對(duì)豐度分別為36.32%，24.56%和37.21%；其次是散囊菌綱(Eurotiomycetes)，其相對(duì)豐度分別為6.67%，4.09%和17.64%；再次是座囊菌綱(Dothideomycetes)，其相對(duì)豐度分別為6.97%，8.40%和4.26%(圖4-A)。

在目水平上，NCS20、NCS40和NCS60的第一優(yōu)勢菌種均為肉座菌目，其相對(duì)豐度分別為21.73%，11.37%和31.29%；其次為散囊菌目(Eurotiales)，其相對(duì)豐度分別為6.55%，3.52%和17.30%；再次為格孢腔菌目(Pleosporales)，其相對(duì)豐度分別為5.96%，7.65%和3.10%(圖4-B)。

在科水平上，NCS20、NCS40和NCS60的第一優(yōu)勢菌種均為叢赤殼菌科，其相對(duì)豐度分別為19.45%，9.63%和29.91%；其次為曲霉菌科(Aspergillaceae)，其相對(duì)豐度分別為6.53%，3.48%和16.73%(圖4-C)。

在屬水平上，NCS20、NCS40和NCS60的第一優(yōu)勢菌種均為鐮刀菌屬(Fusarium)，其相對(duì)豐度分別為11.34%，6.91%和26.50%；其次為青霉菌屬(Penicillium)，其相對(duì)豐度分別為6.29%，3.12%和16.27%；再次為Zopfiella屬，其相對(duì)豐度分別為3.89%，4.11%和0.30%。非根際土壤中，青霉菌屬相對(duì)豐度在0～20，20～40和40～60 cm土層間發(fā)生了明顯變化，其在NCS60中的相對(duì)豐度分別是NCS40和NCS20的5.21和2.59倍(圖4-D)。

2.4 葡萄根際與非根際土壤水平土層真菌組成分析

由圖4可知，真菌群落相對(duì)豐度不僅在垂直深度間存在差異，而且各水平土層間也存在差異。在0～20 cm土層的根際與非根際土壤之中，鐮刀菌屬、新叢赤殼菌屬、青霉菌屬、被孢霉菌屬、Zopfiella屬真菌的相對(duì)豐度均發(fā)生了明顯改變。其中NCS20中的青霉菌屬和Zopfiella屬真菌的相對(duì)豐度是CS20的104.83和389.00倍，CS20中的新叢赤殼菌屬和被孢霉菌屬真菌的相對(duì)豐度是NCS20的60.00和6.78倍。說明在0～20 cm土層根際土壤中，青霉菌屬和Zopfiella屬真菌豐度急劇降低，新叢赤殼菌屬和被孢霉菌屬真菌明顯富集。

由圖4還可知，在20～40 cm土層的根際與非根際土壤中，真菌屬水平的物種豐度發(fā)生了明顯變化。NCS40中的青霉菌屬和Zopfiella屬真菌的相對(duì)豐度分別是CS40的31.20和411.00倍，CS40中的新叢赤殼菌屬和被孢霉菌屬真菌的相對(duì)豐度分別是NCS40的189.60和3.24倍。說明在20～40 cm土層中，青霉菌屬和Zopfiella屬真菌主要富集在非根際土壤中，而新叢赤殼菌屬和被孢霉菌屬真菌主要富集在根際土壤中。

由圖4還可知，在40～60 cm土層的根際與非根際土壤中，NCS60中的青霉菌屬真菌相對(duì)豐度是CS60的95.71倍；CS60中的新叢赤殼菌屬和被孢霉菌屬真菌相對(duì)豐度分別是NCS60的216.86和4.20 倍。此外，CS60與NCS60中的鐮刀菌屬、小球腔菌屬和Dactylonectria屬真菌相對(duì)豐度也發(fā)生了明顯變化。NCS60中的鐮刀菌屬真菌的相對(duì)豐度是CS60的18.15倍，CS60中的小球腔菌屬和Dactylonectria屬真菌的相對(duì)豐度分別是NCS60的162.00和113.67倍。該結(jié)果說明，長期種植葡萄引起了同一深度根際與非根際土壤中真菌物種豐度的改變，與非根際土壤相比，根際土壤中鐮刀菌屬、青霉菌屬、Zopfiella屬真菌的相對(duì)豐度均有不同程度降低，而新叢赤殼菌屬、被孢霉菌屬、小球腔菌屬和Dactylonectria屬真菌的相對(duì)豐度均有所提高，其中小球腔菌屬和Dactylonectria屬真菌相對(duì)豐度在40～60 cm土層中變化最為明顯。

綜上可知，在老齡葡萄根際與非根際土壤之間，土壤真菌的平均相對(duì)豐度在屬水平上發(fā)生了顯著變化。其中，根際土壤中新叢赤殼菌屬、Dactylonectria屬、小球腔菌屬、假裸囊球菌屬真菌的平均相對(duì)豐度分別是非根際土壤的174.5，122.2，156.0和133.3倍，而非根際土壤中鐮刀菌屬、青霉菌屬、Zopfiella屬真菌的平均相對(duì)豐度分別是根際土壤的4.4，77.8和277.0倍。

2.5 葡萄根際與非根際土壤真菌β多樣性分析

在β多樣性研究中，常用Weighted Unifrac距離指標(biāo)來衡量2個(gè)樣品間的相異系數(shù)，其值越小，表示這2個(gè)樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。賀蘭山東麓老齡赤霞珠葡萄根際與非根際土壤Weighted Unifrac距離的比較結(jié)果見表3。

表3 賀蘭山東麓老齡赤霞珠葡萄根際與非根際土壤Weighted Unifrac距離的比較Table 3 Comparison of Weighted Unifrac distance between aged grape rhizosphere soil and non-rhizosphere soil at the eastern foot of Helan Mountain

表3結(jié)果表明，種植20年葡萄根際土壤真菌物種多樣性隨著土層深度的增加差異逐漸變大。與非根際土壤相同深度土層相比，根際土壤CS20、CS40和CS60間的物種多樣性指數(shù)(0.640，0.643，0.797)均小于1，表明根際土壤垂直方向各土層間真菌物種多樣性差異更小。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的分解者和消費(fèi)者，伴隨著自然界各圈層間復(fù)雜的物質(zhì)能量流動(dòng)過程，因此土壤微生物多樣性能反映土壤的性質(zhì)[23]，土壤中的微生物也能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)土壤環(huán)境的變化產(chǎn)生大幅度反應(yīng)[24]。根際土壤指植物根系范圍內(nèi)狹窄區(qū)域上的土壤，既是植物根系與土壤環(huán)境直接接觸的狹小界面，也是與植物生長發(fā)育最為密切的外部環(huán)境[25]。土壤微生物是植物根際土壤中最為活躍的組成成分，同時(shí)也是評(píng)價(jià)土壤養(yǎng)分狀況的指標(biāo)之一。土壤中的優(yōu)勢真菌群落是決定某一微生物群落生態(tài)平衡的關(guān)鍵因素，直接影響著微生物群落的組成、群落結(jié)構(gòu)和群落的演替[12]；此外，根際土壤中真菌群落變化對(duì)植株影響明顯，如腐生型真菌對(duì)動(dòng)植物凋落物有分解作用[26]，外生型真菌與植物產(chǎn)生共生作用[27]，病原菌可使植株患病幾率增加[28]。

賀蘭山東麓種植20年的釀酒葡萄赤霞珠陸續(xù)表現(xiàn)出衰老現(xiàn)象，已成為當(dāng)?shù)仄咸旬a(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的制約因素，本研究對(duì)其根際與非根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行的高通量測序結(jié)果顯示，根際土壤真菌群落分布的豐富度指數(shù)Chao1和ACE大于非根際土壤，說明在長期種植葡萄后，根際土壤真菌群落豐度在各垂直土層中均發(fā)生富集，其中0～20 cm土層表現(xiàn)最為明顯，這與王曉雯等[29]和楊景成等[30]的研究結(jié)果相似。群落分布多樣性指數(shù)Shannon和Simpson在20～60 cm土層根際與非根際土壤間差異不顯著，二者僅在0～20 cm土層的根際與非根際土壤間存在顯著差異，且根際土壤中真菌群落多樣性大于非根際土壤，說明葡萄長期種植后引起了耕作層土壤真菌群落分布的改變，這與李坤等[31]和趙興鴿等[32]的研究結(jié)果一致。

本研究對(duì)賀蘭山東麓種植20年的赤霞珠葡萄不同垂直深度根際和非根際土壤真菌多樣性的分析表明，供試土壤樣本中真菌分屬17門、47綱、109目、211科、346屬。其中子囊菌門、被孢霉菌門和擔(dān)子菌門真菌在葡萄根際與非根際土壤門水平中均為優(yōu)勢菌群，這與Pinto等[33]和陳偉等[34]的研究結(jié)果相似。子囊菌門真菌對(duì)環(huán)境具有較高的適應(yīng)性，且多為腐生菌[35]，但在本試驗(yàn)中，與非根際土壤相比，在0～20和40～60 cm 土層中葡萄根際土壤中的子囊菌門真菌相對(duì)豐度均出現(xiàn)了不同程度的降低，其中耕作層(0～20 cm)表現(xiàn)最為明顯，下降幅度達(dá)8.12%，這可能與人為耕作、施肥及冬季覆土防凍等行為導(dǎo)致土壤機(jī)械結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，最終使子囊菌門真菌的生長繁殖受到了抑制[36]。長期種植葡萄還改變了土壤真菌屬水平的群落組成及結(jié)構(gòu)，本研究檢測到的優(yōu)勢真菌屬分別為新叢赤殼菌屬、被孢霉菌屬、Dactylonectria屬、小球腔菌屬、假裸囊菌屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬和Zopfiella屬。其中，新叢赤殼菌屬、Dactylonectria屬、小球腔菌屬、假裸囊菌屬真菌在各土層非根際土壤中的相對(duì)豐度均較低，而在葡萄各土層根際土壤中相對(duì)豐度明顯提高，CS60中的新叢赤殼菌屬、小球腔菌屬真菌相對(duì)豐度分別是NCS60的261.86和162.00倍，CS60中的Dactylonectria屬真菌相對(duì)豐度是NCS60的113.67倍；而鐮刀菌屬、青霉菌屬、Zopfiella屬真菌的相對(duì)豐度在根際土壤中出現(xiàn)了不同程度的降低，這與王海英等[37]、馬玉彤等[38]和劉芳[39]的研究結(jié)果相似，主要原因可能與各類菌群的最適生長環(huán)境不同有關(guān)[40]。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、物種豐度變化對(duì)植物病害存在關(guān)鍵性影響[41]。據(jù)葉清桐等[42]研究報(bào)道，常見葡萄病害的發(fā)生主要與隱球殼菌屬(Cryptosphaeria)、鐮刀菌屬、Dactylonectria屬、鏈格孢霉菌屬(Alternaria)真菌等病原菌相關(guān)。也有研究表明，鐮刀菌屬真菌對(duì)葡萄霜霉病能夠起到預(yù)防作用[43]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度在賀蘭山東麓種植20年葡萄根際土壤各垂直土層中均呈下降趨勢，下降幅度達(dá)3.21%～25.04%，這可能導(dǎo)致葡萄患霜霉病的幾率增加。Dactylonectria屬真菌隸屬于糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、赤殼菌科(Nectriaceae)，Weber等[44]首先報(bào)道Dactylonectria屬真菌是植株黑根病的主要致病菌，目前在16個(gè)國家均有相關(guān)報(bào)道[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，Dactylonectria屬真菌在研究區(qū)葡萄根際土壤各垂直土層中均已成為優(yōu)勢菌屬，且相對(duì)豐度較非根際土壤明顯提高，提高幅度可達(dá)1.37%～5.57%，表明賀蘭山東麓種植20年赤霞珠葡萄的黑根病患病幾率可能增大。葡萄潰瘍病目前在中國國內(nèi)11個(gè)省份均有報(bào)道，且叢赤殼菌科、新叢赤殼菌屬真菌是引起“紅地球”、“夏黑”、“赤霞珠”等葡萄品種的主要致病菌[45]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，叢赤殼菌科真菌在研究區(qū)葡萄20～40 cm土層根際土壤中的相對(duì)豐度是非根際土壤的2.13倍；CS60中新叢赤殼菌屬真菌的相對(duì)豐度達(dá)18.33%，是NCS60的261.86倍。

本研究結(jié)果表明，寧夏賀蘭山東麓老齡葡萄園根際土壤與非根際土壤真菌多樣性存在顯著差異，其中，各垂直土層中根際土壤Chao1、ACE指數(shù)均顯著高于非根際土壤。Weighted Unifrac距離指標(biāo)分析表明，各土層根際土壤間物種多樣性與非根際土壤相比差異更小，物種多樣性組成結(jié)構(gòu)更相似，不利于維持根際土壤真菌群落的微生態(tài)平衡。根際土壤鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度降低，Dactylonectria屬和新叢赤殼菌屬真菌等病原菌相對(duì)豐度提高，這種變化使葡萄植株患病風(fēng)險(xiǎn)加大，應(yīng)進(jìn)一步深入研究。