苯甲酸對土壤反硝化過程氧化亞氮排放的影響

賈文慧，張新星，李睿琦，高志嶺

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室，河北 保定 071000）

20 世紀，大氣中N2O 的濃度增加了約20%，目前仍在以0.2% ～0.3% 的速率增加［1-2］。聯(lián)合國氣候變化專門委員會第四次評估報告表明［3］，農(nóng)業(yè)源貢獻了全球N2O 排放量的60%。而在中國，農(nóng)業(yè)源貢獻了全國N2O 排放量的92.47%，其中農(nóng)田施肥是農(nóng)業(yè)源N2O 排放的主要來源，約占全國N2O 排放的73.96%［4］。土壤中反硝化過程是N2O 排放的主要途徑，在不同的土壤環(huán)境中可導(dǎo)致25% ～90% 的氮肥損失。反硝化作用不僅會降低農(nóng)田氮肥利用率，同時產(chǎn)生的氮氧化物對環(huán)境也有嚴重的負面影響。因此，抑制土壤反硝化過程、降低N2O 氣體排放是降低環(huán)境污染風險、提高氮素利用率的有效途徑［5-8］。

苯甲酸廣泛存在于植物及畜禽糞便中［9-12］。在植物體內(nèi)苯甲酸是物質(zhì)合成及分解過程中的重要中間產(chǎn)物，可通過根系分泌及組織腐解進入土壤。苯甲酸常作為植物化感物質(zhì)出現(xiàn)，影響植物的生長及生理性狀。研究表明，隨著外源添加苯甲酸濃度的增加，對穿心蓮的生長、西瓜根細胞中氧化物酶（POD）活性及超氧化物歧化酶（SOD）活性由促進轉(zhuǎn)為抑制；添加苯甲酸后會抑制西瓜及黃瓜葉片中硝酸還原酶的活性，降低黃瓜葉片葉綠素含量及西瓜葉片硝態(tài)氮含量［13］。苯甲酸除了具有影響植物生長及生理性狀的作用外，對參與土壤氮循環(huán)轉(zhuǎn)化的微生物的活性及功能也有一定的影響。研究表明，小麥秸稈腐解產(chǎn)生的苯甲酸對反硝化細菌枯草芽孢桿菌的生長與反硝化活性均有抑制作用［14］。此外，苯甲酸還是斷奶仔豬、生長育肥豬的飼料添加劑。苯甲酸進入機體后，在肝臟內(nèi)與甘氨酸結(jié)合形成馬尿酸，之后隨尿液中排出體外［11-12］。有研究表明［12］，牧場尿斑會顯著降低N2O 的排放，這可能是由于動物尿液中馬尿酸分解產(chǎn)生的苯甲酸造成的。針對含有馬尿酸及苯甲酸的合成尿液及尿液的研究證明了苯甲酸具有降低N2O 排放的能力，但在不同土壤條件下結(jié)果并不一致［15-17］，目前尚未有直接的證據(jù)表明苯甲酸可通過影響反硝化過程從而抑制N2O 的排放?；诖?，本研究探索了添加苯甲酸對于黃瓜大棚土壤N2O 的排放和土壤中普遍存在的反硝化細菌銅綠假單胞菌代謝活性的影響，旨在闡明苯甲酸在農(nóng)田土壤N2O 排放控制中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤：潮褐土取于保定市徐水區(qū)黃瓜大棚，取土深度為0 ～20 cm，所有土壤樣品自然風干后過2 mm 篩，備用。供試土壤的容重為1.28 g/cm3，pH 為8.2, 有機質(zhì)和全氮分別為20.36 和1.90 g/kg，NH4+-N 和NO3--N 的含量分別為41.76 和25.4 mg/kg。

供試藥品：苯甲酸，LB 肉湯培養(yǎng)基。

供試菌株：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa（ATCC13985，美國農(nóng)業(yè)部菌種保存中心）。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 苯甲酸對銅綠假單胞菌厭氧代謝活性的影響

將甘油瓶中的銅綠假單胞菌接種到滅菌的LB肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)過夜，將處于指數(shù)生長期的細菌用9%的NaCl 水溶液重復(fù)洗滌3 次，之后加入50 mL 9%的NaCl 水溶液饑餓培養(yǎng)2 h，以耗竭自身養(yǎng)分。培養(yǎng)結(jié)束后離心，將菌體用LB 肉湯培養(yǎng)基稀釋，并調(diào)整其OD600值到0.1。

代謝強度的測定在含有氧化還原染料氯化四唑的Biology MT2 96 孔板中進行［6-8］，通過氧化還原染料變色程度判斷細菌厭氧呼吸代謝活性強度。每孔中加入OD600為0.1 的菌液97 μL，并以2.5%的添加量將不同濃度的苯甲酸添加到96 孔板中，使各處理中苯甲酸終濃度分別為0.5、1、2、4 mmol/L，并以添加等量水的處理為空白對照（CK）。每個處理設(shè)置4 個重復(fù)孔。為創(chuàng)造反硝化過程發(fā)生的厭氧環(huán)境，在每孔中加入60 μL 礦物油覆蓋。將MT2 平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6 h 在酶標儀590 nm 下進行代謝強度的測定。

1.2.2 苯甲酸對土壤反硝化過程及N2O 排放的影響

（1）室內(nèi)模擬試驗采用靜態(tài)箱法進行測定：試驗裝置為內(nèi)徑11 cm、高度20 cm、底部封底的PVC罐子。將過篩后的風干土填充至10 cm 深，將土壤含水量調(diào)節(jié)為85%土壤孔隙含水量（WFPS）。設(shè)置5個苯甲酸濃度，分別為0、1、2、4 和6 mmol/kg 干土。硝態(tài)氮用量折合田間施氮量約為200 kg/hm2。培養(yǎng)時罐子上覆蓋透氣保水的保鮮膜。每個處理15 個重復(fù)，其中3 個重復(fù)用于N2O 氣體的動態(tài)取樣，其余重復(fù)用土壤理化指標的測定。本試驗在25 ℃下恒溫模擬，每天通過稱重補水以確保含水量恒定。

（2）N2O 采集與測定方法［18］：在整個培養(yǎng)周期內(nèi)（18 d），于每天早上10:00—11:00 采集氣體樣品。采氣時，密封蓋與箱體連接，關(guān)閉箱體上的閥門，使箱體頂部形成1 個密閉的靜態(tài)箱，通過開閉閥門采集N2O 樣品。采集樣品時用蓋子密封箱體，封閉時間為30 min，分別在第0 和30 min 時用50 mL 注射器采集氣體樣品30 mL，注入10 mL 真空瓶。24 h 內(nèi)利用氣相色譜儀（Agilent 6820）測定氣體樣品的濃度。檢測器為ECD，檢測溫度為330 ℃。

（3）土壤樣品采集及測定方法：根據(jù)氣體排放特征，分別于試驗的第1 天、第4 天、第7 天、第13 天和第18 天對土壤進行破壞性取樣，用于土壤pH 值、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及苯甲酸含量的測定。

（4）土壤NH4+-N 和NO3--N 測定：用2 mol/L的KCl 溶液以1∶5 的土液比將土壤和KCl 溶液進行混合，振蕩1 h 后過濾，收集濾液。濾液使用化學(xué)分析儀（SmartChem200）測定NH4+-N 和NO3--N濃度。

（5）土壤苯甲酸含量測定［19］：稱取5 g 樣品置于30 mL 乙酸乙酯中，恒溫30 ℃下160 r/min 振蕩過夜。將振蕩液離心，上清液在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，1.5 mL 色譜純甲醇復(fù)溶，用0.2 μm 有機濾膜過濾后待測。使用安捷倫高效液相色譜進行測定苯甲酸含量，固體相色譜柱為Thermo C18（250*4.6 mm，5 μm）。乙腈和1%的冰乙酸按1∶3 比例混合組成流動相。樣品檢測時，上樣量為10 μL，流速0.9 mL/min，樣品分析過程中，保持柱溫在25 ℃，檢測波長230 nm。

1.3 計算方法與數(shù)理統(tǒng)計

1.3.1 計算方法

N2O 排放速率［18］：

式中：F為N2O 排放速率(mg/m2·h)；dC/dt為觀測時間箱內(nèi)氣體濃度隨時間變化的直線斜率(mg/m3·h)；H為箱體有效高度(m)；T0為標準狀態(tài)下空氣的絕對溫度(K)；T實際空氣溫度(℃)。

N2O 累積排放量［18］：

式中：Q 為試驗期間N2O 排放總量(mg/m2)；n為試驗期間測定總次數(shù)；i為按時間排序的采樣測定時間；Fi為第i次測定事件的N2O 排放速率(mg/m2·h)；Fi+1為第i+1 次測定事件的N2O、NH3或CH4排放速率(mg/m2·h)；ti+1為第i+1 次測定事件的時間(h)；ti為第i次測定事件的時間(h)。

1.3.2 數(shù)理統(tǒng)計

采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，顯著性差異分析采用Duncan 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯甲酸對反硝化銅綠假單胞菌厭氧代謝活性的影響

銅綠假單胞菌廣泛存在于土壤中，具有將NO3-N還原為N2O 的全套基因，對其厭氧代謝活性的影響可在一定程度上反映對土壤反硝化過程的影響。由圖1 可知，各處理細菌厭氧代謝強度與細菌生長曲線趨勢一致，均經(jīng)歷了平緩期、快速增長期及穩(wěn)定期。在培養(yǎng)的0 ～12 h 內(nèi)，添加苯甲酸的處理細菌厭氧代謝活性均顯著低于CK 處理，且隨著添加濃度的增加代謝強度抑制率增加，說明在培養(yǎng)初期苯甲酸的添加抑制了銅綠假單胞菌的生長，12 h 時苯甲酸對細菌代謝活性抑制作用最強，各處理抑制率分別達23.4%、39.2%、44.1% 及52.8%。12 h 后，CK處理細菌代謝活性增幅減慢，24 h 之后代謝強度穩(wěn)定不變；從培養(yǎng)的第18 h 開始，添加苯甲酸對銅綠假單胞菌厭氧代謝活性的影響逐漸由抑制轉(zhuǎn)為促進。

圖1 苯甲酸對反硝化細菌厭氧代謝活性的影響Fig.1 Effect of benzoic acid on anaerobic metabolic activity of denitrifying bacteria

2.2 苯甲酸對土壤N2O 排放的影響

2.2.1 N2O 排放通量 由圖2 可知，添加苯甲酸強烈影響土壤N2O 的排放，且各處理N2O 排放動態(tài)特征存在巨大差異。未添加苯甲酸的CK 處理N2O 排放呈先升高后降低的趨勢。在培養(yǎng)的2 ～4 d，CK處理N2O 排放通量達到峰值2.21 ～2.38 mg/(m2·h)，顯著高于添加苯甲酸2、4 及6 mmol/kg 的處理，之后排放量在2 d 內(nèi)迅速降低至趨近于0。添加苯甲酸1 mmol/kg 及2 mmol/kg 的處理在前5 d 內(nèi)氣體排放通量變化趨勢與CK 處理一致，呈先升高后降低的趨勢，并在培養(yǎng)的2 ～4 d 達到第一個峰值。培養(yǎng)5 d 后，添加苯甲酸1 mmol/kg 及2 mmol/kg 的處理N2O 排放量又逐漸升高，并分別在培養(yǎng)的第9 天及第7 天達到第二個峰值2.87 mg/(m2·h)及1.03 mg/(m2·h)，之后排放量逐漸降低，分別在培養(yǎng)的第13 天及第9 天趨近于0。添加苯甲酸4 mmol/kg 及6 mmol/kg的處理N2O 排放均在培養(yǎng)的第二天達到峰值1.19 mg/(m2·h)及2.10 mg/(m2·h)，之后逐漸降低，至培養(yǎng)的第7 天，排放量逐漸趨近于0。

圖2 不同濃度苯甲酸處理下N2O 排放速率Fig.2 N2O emission rate under different concentrations of benzoic acid treatment

2.2.2 N2O 累積排放量 培養(yǎng)期內(nèi)各處理N2O 累積排放量見圖3。由圖3 可以看出N2O 累積排放量隨苯甲酸添加量的增加呈先顯著升高后顯著降低的趨勢。苯甲酸添加量為1 mmol/kg 的處理 N2O 累積排放量最高，達497 mg/m2，比空白對照CK 處理顯著高1.36 倍；添加量為2 mmol/kg 的處理氣體排放量顯著低于添加量為1 mmol/kg 的處理，但與CK 相比無顯著變化；與CK 相比，添加量為4 mmol/kg 及6 mmol/kg 處理的N2O 累積排放量分別顯著下降了64.1%和43.0%。這表明低濃度苯甲酸可刺激N2O 的排放，但隨著苯甲酸添加量的增加，對N2O 排放的作用由促進逐漸轉(zhuǎn)為抑制。

圖3 不同濃度苯甲酸處理下N2O 累積排放量Fig.3 Cumulative emission of N2O under different concentrations of benzoic acid treatment

2.3 苯甲酸含量動態(tài)變化

苯甲酸可以作為碳源被某些微生物降解。由圖4 可知，CK 處理未檢測出苯甲酸濃度，表明風干土中苯甲酸含量在檢測限以下；添加苯甲酸的處理，苯甲酸的含量隨著培養(yǎng)的進行而降低，在第13 天時，添加苯甲酸1 mmol/kg 及2 mmol/kg 的處理苯甲酸含量趨近于0，培養(yǎng)結(jié)束時4 mmol/kg 及6 mmol/kg 的處理苯甲酸剩余量分別為0.050 g/kg及0.228 g/kg。

圖4 苯甲酸含量動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of benzoic acid content

2.4 土壤pH 值動態(tài)變化

苯甲酸為有機酸，本身具有酸性，添加進土壤后會降低土壤pH 值，由圖5 可知，試驗開始時，與CK 處理相比添加苯甲酸的處理的土壤pH 值降低了0.27 ～0.59 個單位，隨著培養(yǎng)的進行，苯甲酸逐漸分解，加上反硝化過程對H+的消耗，各處理土壤pH 逐漸回升至培養(yǎng)的第12 天后趨于穩(wěn)定。

圖5 不同濃度苯甲酸處理下土壤pH 值動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of soil pH under different concentrations of benzoic acid

2.5 土壤硝態(tài)氮及銨態(tài)氮含量動態(tài)變化

2.5.1 土壤硝態(tài)氮含量動態(tài)變化 硝態(tài)氮是反硝化底物，硝態(tài)氮濃度的變化在一定程度上可反映反硝化進行的程度，由圖6 可知，在試驗的前4 d，添加苯甲酸的處理土壤中硝態(tài)氮的含量均顯著高于空白對照處理(CK)，添加苯甲酸的各處理間硝態(tài)氮降低速率表現(xiàn)為6 mmol/kg＞2 mmol/kg＞1 mmol/kg＞4 mmol/kg，培養(yǎng)7 d 之后至培養(yǎng)結(jié)束，CK 處理硝態(tài)氮剩余量均顯著高于添加苯甲酸的處理。

圖6 土壤硝態(tài)氮含量動態(tài)變化Fig.6 Dynamic change of soil nitrate content

2.5.2 土壤銨態(tài)氮含量動態(tài)變化 圖7 為土壤銨態(tài)氮含量變化趨勢圖。

圖7 土壤銨態(tài)氮含量動態(tài)變化Fig.7 Dynamic change of soil ammonium nitrogen content

由圖可知，各處理銨態(tài)氮含量隨著培養(yǎng)的進行均呈增加的趨勢，且CK 處理銨態(tài)氮含量在培養(yǎng)的第4 天、第7 天、第13 天及第18 天均顯著高于添加苯甲酸的處理(第13 天4 mmol/kg 及6 mmol/kg處理除外)，添加苯甲酸的處理在培養(yǎng)前4 d 銨態(tài)氮的含量無顯著差異，在第7 ～13 天，苯甲酸添加量為1 mmol/kg 的處理顯著低于其余添加量的處理。

3 討論

3.1 對細菌厭氧代謝強度的影響

在缺氧狀態(tài)下，反硝化細菌以硝酸根離子為電子受體進行厭氧呼吸，因此厭氧代謝強度與細菌反硝化過程息息相關(guān)。本研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)初期苯甲酸具有抑制細菌代謝強度的能力，且抑制效果具有劑量依賴性，隨著培養(yǎng)時間的延長，添加苯甲酸的處理抑制作用逐漸降低并依據(jù)濃度由低到高依次由抑制作用轉(zhuǎn)化為促進作用。造成上述現(xiàn)象的原因可能與培養(yǎng)初期培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)pH 值及細菌對苯甲酸的代謝有關(guān)。苯甲酸具有酸性，研究中設(shè)置的處理初始溶液pH 值隨苯甲酸添加量的增加而降低，整體在5.8 ～7.0 范圍內(nèi)（未發(fā)表數(shù)據(jù)），而該細菌最適生長pH 范圍為6.8 ～7.4［20］。初期較低的pH值抑制了銅綠假單胞菌的代謝生長，隨著培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)反硝化過程的進行，氫離子消耗［21-22］，添加苯甲酸濃度較高的處理pH 值逐漸回升到適宜細菌生長的范圍，其代謝活性被刺激增強。

3.2 苯甲酸對土壤反硝化過程及N2O 排放的影響

本研究中，培養(yǎng)前期，添加苯甲酸處理的硝態(tài)氮明顯高于CK，而在培養(yǎng)結(jié)束時，卻顯著低于CK處理，且添加苯甲酸處理間無顯著差異，這可能是培養(yǎng)前期苯甲酸對反硝化過程抑制強烈，而后期由于降解或轉(zhuǎn)化為苯甲酸鹽，對土壤反硝化過程的影響減弱所致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與CK 處理相比苯甲酸添加量為1 mmol/kg 時顯著促進土壤N2O 排放，≥4 mmol/kg時，N2O 排放量顯著低于CK 及添加1 mmol/kg 的處理，這與前人研究苯甲酸濃度為3.9 mmol/kg 時N2O 排放被抑制的結(jié)果一致［16］。推測其原因能是：（1）添加低濃度苯甲酸時，由于土壤堿性組分和苯甲酸結(jié)合，引起苯甲酸的抑菌作用大幅下降和土壤pH 的降低，可能一定程度促進了反硝化過程和N2O 排放；而在添加高濃度時，強烈的抑菌作用可能超過pH 下降對反硝化過程的促進作用，因此導(dǎo)致N2O 排放下降。（2）土壤反硝化過程中N2O 的生成量受亞硝酸鹽還原酶（Nir）、一氧化氮還原酶（Nor）及氧化亞氮還原酶（Nos）活性的影響，在消耗相同底物的前提下，Nos 活性越高時，N2O還原為N2的過程更強烈。Nos 相較于其余3 種酶結(jié)合電子的能力較弱，尤其是在供碳量不足的情況下［23］。研究表明，部分土壤反硝化細菌可以將低濃度苯甲酸作為碳源，因此不同土壤反硝化微生物對苯甲酸響應(yīng)的差異可能是導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因之一。（3）此外，土壤中氮素的轉(zhuǎn)化也會對N2O 的排放產(chǎn)生影響。例如，本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)期內(nèi)土壤NH4+-N含量呈升高的趨勢，推測可能是在缺氧條件下NO3-異化還原為NH4+，進而降低了N2O 產(chǎn)生的底物［24-25］。由此可見，還需進一步進行開展宏基因組研究，深入揭示苯甲酸對土壤氮素轉(zhuǎn)化和N2O 排放的影響機制。

4 結(jié)論

通過外源添加苯甲酸進行了室內(nèi)細菌及土壤純培養(yǎng)試驗，本研究研究發(fā)現(xiàn)：（1）土壤N2O 排放特征受苯甲酸添加量影響顯著，其中在低濃度時呈現(xiàn)“雙峰”、高濃度時呈“單峰”的特征；（2）苯甲酸對土壤N2O 累積排放量的影響表現(xiàn)為低濃度促進、高濃度抑制的特征；（3）苯甲酸對土壤NO3-轉(zhuǎn)化表現(xiàn)為前期抑制、后期促進的特征，與其對典型反硝化細菌銅綠假單胞菌的影響特征相吻合。因此，合理應(yīng)用苯甲酸具有降低土壤N2O 排放的潛力，但其適宜用量與N2O 減排機理仍需進一步研究。