駝源莠去津多克隆抗體的制備及間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法的建立

齊 萌,周 惠,霍靜倩,張金林

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，河北 保定 071001）

莠去津?qū)儆谌筋惓輨?，自被開發(fā)以來逐漸成為全球范圍內(nèi)使用量最大的旱田除草劑之一［1-2］。莠去津在開發(fā)和使用過程中是被認為是低毒的除草劑，但是隨著莠去津的連續(xù)長期的使用，莠去津的一些環(huán)境毒性問題慢慢顯露出來，目前在許多國家的環(huán)境樣品中均可檢測出不同濃度的莠去津或其代謝物的殘留［3-5］。雖然距離歐盟禁止使用莠去津類產(chǎn)品已經(jīng)過去了近20 年，但是仍可從環(huán)境中檢測到莠去津［6］。長期接觸莠去津會損害人的身體健康并對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一些風(fēng)險。歐盟早在2004 年限制其登記使用，但在2014 年德國西部地下水監(jiān)測報告中發(fā)現(xiàn)，在1991 年最后1 次使用莠去津的地區(qū)，距地表30 m 深處土壤中檢測到了莠去津［7］。對于水生生物來說，莠去津影響了其正常生長［8］，也會損害魚類的肝臟代謝并產(chǎn)生遺傳毒性損傷［9］，誘導(dǎo)鯉魚嗜血淋巴細胞的凋亡［10-11］。也會影響人類激素的正常產(chǎn)生，造成激素紊亂［12］。有研究表明莠去津可使鵪鶉及植物受到影響［13-14］。同時，殘留在土壤中的莠去津也會對一些非靶標(biāo)敏感作物產(chǎn)生藥害問題，已有研究證明殘留的莠去津會對豆科等作物的生長產(chǎn)生影響［15］。

目前，針對莠去津的檢測方法，比較常見的主要包括以大型儀器為主的儀器分析法和基于抗原-抗體反應(yīng)的免疫分析方法［16-18］。在莠去津的殘留分析中，儀器分析法方法的優(yōu)勢是十分明顯的，檢測靈敏，可以檢測出環(huán)境中痕量的莠去津殘留，但是儀器分析方法也有一定的局限性，例如使用儀器昂貴，檢測成本高，前期投入較大，普適性較差，需要操作人員受過專業(yè)訓(xùn)練，同時需要對樣品進行前處理，不適于現(xiàn)場檢測。而免疫分析方法在這些方面具有優(yōu)勢，無需復(fù)雜的前處理，操作簡單，更利于現(xiàn)場檢測。已有學(xué)者使用免疫分析的方法來對莠去津進行檢測。Sun 等［19］人開發(fā)了針對莠去津的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了檢測莠去津的免疫層系試紙條，輔助手持裝置可用于現(xiàn)場定量檢測。Zumpano 等［20］人使用G 蛋白功能化磁性納米粒子固定莠去津抗體，開發(fā)了檢測莠去津的免疫傳感器。李曉麗［21］等人開發(fā)了一種檢出限為1.972 ng/mL 的針對莠去津的間接競爭免疫分析方法。Chio 等［22］人建立了一種使用熒光偏振免疫分析的方法檢測莠去津，也達到了很好的檢測效果，檢測限為3 ng/mL。Wang 等［23］人開發(fā)了一種針對莠去津的單克隆抗體，并建立了dc-ELISA 和ICG 條帶法檢測丹參等中草藥中的莠去津殘留。

縱觀已開發(fā)的針對莠去津的免疫分析方法，學(xué)者們多是基于兔源、羊源多克隆抗體和單克隆抗體［20,22,24］，并沒有基于駝源的多克隆抗體。駝源多克隆抗體作為生產(chǎn)納米抗體過程中的多克隆抗體，目前鮮有人探討。通過深入研究駝源多克隆抗體，可以初步明確駱駝科動物的免疫效果，為后續(xù)納米抗體的開發(fā)提供基礎(chǔ)，同時由于駱駝科動物體型較大，可以產(chǎn)生大量多克隆抗體，利用該抗體開發(fā)的方法可以實現(xiàn)實驗動物的最大利用，避免試驗動物的浪費。

本研究利用開發(fā)納米抗體過程中所產(chǎn)生的美洲駝血清開發(fā)了1 種基于多克隆抗體的莠去津酶聯(lián)免疫分析方法，通過棋盤法確定了最佳包被抗原濃度和抗血清稀釋倍及最佳反應(yīng)體系；同時利用其他3種三氮苯類除草劑及常見環(huán)境代謝物進行多克隆抗體的特異性試驗；通過測試環(huán)境中的實際樣品，確定開發(fā)的方法對實際樣品檢測的適應(yīng)性；開發(fā)的檢測方法以期為后續(xù)納米抗體的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全波長多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯貿(mào)易有限公司）；Nanodrop（美國賽默飛世爾科技公司）；高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；過氧化氫（美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；莠去津及類似物及環(huán)境代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品（美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；伴清蛋白（CON，美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；雞卵白蛋白（OVA，美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；HRP 標(biāo)記羊抗駝IgG（美國Jackson Immuno Research Labs 公司）；二甲基亞砜（EMD Millipore）；莠去津的巰基酸結(jié)合物、半抗原2h、半抗原2e 和半抗原4a（由美國加州大學(xué)戴維斯分校Hammock 實驗室前期制備［25］）。

部分緩沖液配方如下：

10×PBS 緩沖液 ： 稱取80 g NaCl、21.7 g Na2HPO4·7H2O、2 g KCl 和2 g KH2PO4，加入800 mL去離子水溶解，定容至1 L。1×PBS 緩沖液：將10×PBS 緩沖液按1∶10 的比例進行倍比稀釋。1×PBST 緩沖液：在1 L 1×PBS 緩沖液中加入0.5 mL Tween-20，混勻備用。TMB 顯色緩沖液（pH 3.8）：稱取46.04 g 檸檬酸二氫鉀水合物和0.10 g 山梨酸鉀于1 L 去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙夂笫覝貎Υ鎮(zhèn)溆?。TMB 儲備液：稱取 375 mg TMB 溶解在30 mL 二甲亞砜（DMSO）中避光室溫保存。顯色液：分別取TMB 顯色緩沖液11 mL，TMB 儲備液200 μL 和1%過氧化氫溶液101 μL，充分混勻后現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 美洲駝免疫及血清效價測定

1.2.1 美洲駝免疫試驗 美洲駝為年齡1 歲6 個月的健康雄性美洲駝，免疫過程由美國Capralogics 公司完成。免疫前收集50 mL 血清作為陰性對照。半抗原2h 偶聯(lián)伴清蛋白（CON）作為免疫原，初次免疫，免疫抗原用量為1 mg（以載體蛋白計算），與等體積的弗氏完全佐劑在注射器中充分乳化后進行皮下注射，加強免疫用量為0.5 mg （以載體蛋白計算）與等體積的弗氏不完全佐劑混合后注射。每3 周免疫1 次，免疫后1 周收集外周血，4 ℃放置2 h 后進行8 000 r/min，5 min 的離心，收集上清即為多克隆抗體。1.2.2 血清效價測定 以半抗原2 h（圖1）偶聯(lián)牛血清白蛋白（2h-BSA）作為包被抗原進行血清效價測定。取濃度為1 μg/mL 的2h-BSA 包被抗原溶液和BSA 溶液各100 μL 包被于96 孔板（Nunc MaxiSorp?），4 ℃孵育16 h；PSBT 洗板3 次并拍干后加入3%脫脂乳粉225 μL 進行室溫封閉處理1 h；PSBT 洗板3 次并拍干后加入經(jīng)1×PBS 緩沖液按1 000、3 000、9 000、27 000 倍稀釋的多克隆抗體，室溫孵育1 h；PSBT 洗板3 次并拍干后加入100 μL 的5 000 倍稀釋的HRP 標(biāo)記羊抗駝IgG 震蕩孵育1 h；PSBT 洗板5 次并拍干后添加100 μL 顯色液，避光震蕩孵育15 min 后，加入100 μL 2 mol/L 硫酸終止反應(yīng)并在450 nm 波長（Infinite M1000 Pro，瑞士帝肯貿(mào)易有限公司）下讀取OD 值。

圖1 半抗原2h（a）、2e（b）、4a（c）及莠去津（d）的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The molecular structure of hapten 2h, 2e, 4a and atrazine

1.3 基于駝源多克隆抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法的建立

1.3.1 莠去津間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法 間接競爭酶聯(lián)免疫分析的操作步驟與效價測定步驟類似，區(qū)別在于完成封閉并洗板后，間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法要同時加入多克隆抗體和不同濃度的莠去津標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL，其中莠去津標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、0.034 0、0.102、0.305、0.914、2.74、8.23、24.7、74.1、222、667 和2 000 ng/mL。

不含莠去津標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD 值減去最大濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD 值值定義為B0，不含標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值減去其余各濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD 值定義為B，以B/B0 為縱坐標(biāo)，莠去津標(biāo)準(zhǔn)品濃度的log 值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程將靈敏度定義為IC50（B/B0=50%）。

1.3.2 包被抗原的選擇及抗原和抗體濃度的優(yōu)化 采用棋盤法篩選包被抗原及抗體濃度，具體操作步驟與血清效價方法類似，區(qū)別在于進行包被步驟時分別包被不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL） 的2h-BSA、2h-OVA、2e-BSA、2e-OVA 和4a-BSA、4a-OVA 于96 孔板中；封閉且洗板后加入不同的濃度多克隆抗體；最終讀數(shù)后，選擇OD 值為1.5～2.0 左右的包被抗原濃度及抗體濃度為工作濃度。

在確定工作濃度后，進行各組合的莠去津間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法測定，通過IC50確定最佳包被抗原和多克隆抗體組合。

1.3.3 工作溶液的優(yōu)化

（1）離子強度的優(yōu)化：在最佳包被抗原及多克隆抗體的條件下，在PBS 緩沖液的基礎(chǔ)上，配制NaCl 濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mol/L 的PBS緩沖液用于稀釋多克隆抗體和莠去津標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)IC50確定最佳離子強度。

（2）不同pH 對分析方法的影響：分別配制pH為5.0、6.0、7.0、7.4、8.0 和9.0 的PBS 緩沖液用于稀釋多克隆抗體和莠去津標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)IC50確定最優(yōu)pH。

（3）不同甲醇濃度對分析方法的影響：分別配制含有甲醇濃度為0、5%、10%、20%和40%的PBS 緩沖液用于稀釋多克隆抗體和莠去津標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)IC50確定最佳甲醇濃度。

1.4 莠去津多克隆抗體特異性的測定

在優(yōu)化的分析體系下，使用開發(fā)的ic-ELISA分別對莠去津、西瑪津、特丁津、特丁凈、三聚氰酸、去異丙基莠去津、2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、三聚氰氨、2-羥基莠去津、莠去津的巰基酸結(jié)合物進行交叉反應(yīng)試驗。將以上物質(zhì)按一定濃度配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，并計算各自的IC50，按下式計算交叉反應(yīng)：

交叉反應(yīng)（CR%）=IC50（莠去津）/IC50（供試物）

1.5 樣品添加回收實驗

選擇加州大學(xué)戴維斯分校校園河流水、薩克拉門托河和索拉諾湖中的水樣進行樣品添加回收試驗。試驗表明水樣離心并過膜后基本無基質(zhì)效應(yīng)，由高效液相色譜確認水樣中無莠去津［26］。分別在離心并過膜后的水樣中添加不同濃度的莠去津溶液使其終濃度為1、10、50 ng/mL。使用開發(fā)的酶聯(lián)免疫分析方法和高效液相色譜法對水樣中的莠去津進行測試，其中測試委托加州大學(xué)戴維斯分校儀器中心進行。根據(jù)結(jié)果計算各樣品中莠去津的濃度，并計算添加回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 莠去津抗血清效價測定

美洲駝免疫后，利用同源包被抗原2h-BSA 進行效價監(jiān)測，結(jié)果如圖2 所示，隨著免疫次數(shù)的增加，抗血清效價逐漸增加，第5 次免疫后，效價提升緩慢，出于時間和經(jīng)濟成本，使用第6 次免疫后的多克隆抗體建立莠去津間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。

圖2 多克隆抗體效價Fig.2 The titer of polyclonal antibody

2.2 基于莠去津多克隆抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法的建立

2.2.1 最佳包被抗原及抗血清濃度 當(dāng)包被抗原為2h-BSA 和2h-OVA 時的最佳包被抗原濃度為0.8 μg/mL，多克隆抗體稀釋倍數(shù)為60 000 倍。當(dāng)包被抗原為2e-BSA 和2e-OVA 時最佳包被抗原濃度為1 μg/mL，多克隆抗體稀釋倍數(shù)為50 000 倍；由于2e 為異源包被抗原，其在三氮苯環(huán)的R2 位與免疫原有差異，但是差異并不大，因此抗體用量較高。當(dāng)包被抗原為4a-BSA 和4a-OVA 時最佳包被抗原濃度為1 μg/mL，多克隆抗體稀釋倍數(shù)為1 000 倍；由于4a 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與免疫原2 h 在載體蛋白偶聯(lián)部位存在很大差異，因此抗體用量最高。在最佳工作濃度的基礎(chǔ)上，分別測試了不同包被抗原條件下的IC50（圖3），結(jié)果表明當(dāng)包被抗原為2e-BSA 時靈敏度最高，IC50為15.10 ng/mL，因此后續(xù)方法基于2e-BSA 建立。

圖3 不同包被抗原對靈敏度的影響Fig.3 Effects of different coating antigen on sensitivity

2.2.2 最佳工作溶液 離子強度的優(yōu)化結(jié)果表明，隨著NaCl 濃度的升高，靈敏度逐漸先升高后降低，當(dāng)濃度超過0.6 mol/L 時抗體結(jié)合減弱，過低或過高的NaCl 濃度均不利于檢測，因此最適的NaCl 濃度0.2 mol/L（圖4-a）。不同pH 值的優(yōu)化結(jié)果表明，過低或過高的pH 值使吸光度值發(fā)生了明顯的下降，影響了抗體與抗原的結(jié)合力，當(dāng)pH 值為7 和7.4時，靈敏度最好，但是考慮空白孔的吸光度值，選擇pH7.4 為最適pH 值（圖4-b）。甲醇濃度優(yōu)化的結(jié)果表明，隨著甲醇濃度的提高，吸光度和靈敏度均降低，說明過量的甲醇會對抗體的結(jié)合產(chǎn)生影響，而少量的甲醇有助于提高莠去津標(biāo)準(zhǔn)品在反應(yīng)中的溶解度和穩(wěn)定性［27］，當(dāng)甲醇濃度為5%，靈敏度最好（圖4-c）。

圖4 工作溶液的優(yōu)化Fig.4 Effects of different factors on sensitivity

2.2.3 基于美洲駝多克隆抗體的ic-ELISA 的靈敏性評價 在最佳條件下，繪制的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線如圖5，IC50值為12.13 ng/mL，線性檢測范圍為5.982 ～32.48 ng/mL，最低檢測限為0.051 6 ng/mL。

圖5 莠去津ic-ELISA 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線Fig.5 Calibration curve of indirect ELISA for atrazine

2.3 莠去津多克隆抗體的特異性評價

使用開發(fā)的ic-ELISA 分別對莠去津和一些結(jié)構(gòu)類似物及代謝產(chǎn)物進行了交叉反應(yīng)試驗。結(jié)果如表1 所示。由于莠去津與西瑪津、特丁津和去異丙基莠去津的結(jié)構(gòu)類似，因此交叉反應(yīng)率較高，對特丁津的交叉反應(yīng)率達到95.8%，對西瑪津和去異丙基莠去津的交叉反應(yīng)率也大于50%，對其他化合物交叉反應(yīng)＜0.1%。這主要是由于免疫原的載體蛋白偶聯(lián)在三嗪環(huán)的R3 位置，因此抗體識別區(qū)域在R1 和R2 位置，而莠去津與西瑪津、特丁津和去異丙基莠去津的在R1 和R2 位置結(jié)構(gòu)類似，因此產(chǎn)生了較高的交叉反應(yīng)性。

表1 多克隆抗體與莠去津結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)試驗Table 1 Cross-reactivity of the serum against triazines analytes and metabolites

續(xù)表：

2.4 樣品添加回收實驗

為了驗證開發(fā)的方法對實際樣品對檢測情況，進行了樣品的添加回收試驗，從美國加州大學(xué)戴維斯分校附近選擇3 處取樣點，分別為加州大學(xué)戴維斯分校校園內(nèi)河流、薩克拉門托河和索拉諾湖。根據(jù)預(yù)實驗，經(jīng)過離心后的水樣基本無基質(zhì)效應(yīng)，因此將水樣離心過膜后，分別在樣品中添加不同濃度的莠去津溶液使其終濃度為1、10、50 ng/mL，直接進行檢測。同時使用高效液相色譜對水樣中的莠去津進行測試，測試委托加州大學(xué)戴維斯分校儀器中心進行。添加回收結(jié)果如表2 所示，添加回收率在90.1%～114.2%之間，變異系數(shù)在1.04%～4.66%之間，說明開發(fā)的莠去津ic-ELISA 方法可用于檢測環(huán)境實際樣品，也符合IUPAC 中對ELISA 評價的標(biāo)準(zhǔn)要求［28］。

表2 樣品添加回收實驗Table 2 Detection results of the recovery test

續(xù)表：

3 討論與結(jié)論

抗體本質(zhì)上是機體內(nèi)由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種特殊的呈“Y”型形狀的免疫球蛋白，用于識別和中和細菌和病毒等異物，抗體特異性識別的這些異物，被稱為抗原?？贵w又分為多克隆抗體、單克隆抗體和納米抗體。多克隆抗體多來源于免疫后的動物血清；單克隆抗體在免疫動物基礎(chǔ)上，進行細胞融合、選擇性培養(yǎng)、雜交瘤細胞篩選等步驟，最后進行單克隆抗體的大量制備；而納米抗體是駱駝科和鯊魚科體內(nèi)產(chǎn)生的獨特天然缺失輕鏈的抗體，通過對駱駝科動物免疫，外周血中提取淋巴細胞利用分子生物學(xué)手段開發(fā)納米抗體，但是駱駝科動物在產(chǎn)生重鏈抗體時，體內(nèi)同樣會產(chǎn)生大量的多克隆抗體，而目前針對此部分的研究較少。Feng Wang 等［29］人利用駱駝多克隆抗體開發(fā)了用于檢測果汁中的萘甲酸霉菌毒素的檢測方法，為后續(xù)納米抗體開發(fā)的開發(fā)提供了經(jīng)驗和基礎(chǔ)。

通過對比開發(fā)的美洲駝多克隆抗體與其他動物抗體在靈敏度的差異，本方法的靈敏度與其他學(xué)者開發(fā)的兔及綿羊的多克隆抗體的結(jié)果類似并低于某些學(xué)者的研究結(jié)果［30-32］，分析原因是由于駱駝科動物體型較大，產(chǎn)生免疫反應(yīng)需要更多的抗原刺激同時體液基數(shù)大，因此抗體效價相對低，后續(xù)可通過多克隆抗體純化確定抗體濃度后進一步確定此猜想。開發(fā)的多克隆抗體對西瑪津、特丁津和去異丙基莠去津的交叉反應(yīng)率較高，分析原因之一是這3 種化合物與莠去津的結(jié)構(gòu)極為相似，此外，由于多克隆抗體是針對多個抗原決定簇的混合抗體，特異性差也是其主要缺點之一。本研究結(jié)果與其他學(xué)者開發(fā)的莠去津多克隆抗體的特異性結(jié)果相一致［24,33,34］，雖然在一定程度上限制了開發(fā)的免疫分析方法，但是結(jié)合施藥歷史并使用儀器分析方法對待測區(qū)域進行初步分析，可有效規(guī)避此補足，本研究進一步促進了具有優(yōu)異性能的納米抗體的發(fā)展。