鑒別蜂蜜真實(shí)屬性實(shí)時(shí)熒光PCR法的建立

林碧蓮

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(福州)，福建 福州 350000)

蜂蜜是蜜蜂從植物的花中采集花蜜后在蜂巢中釀制、加工的天然滋補(bǔ)品。蜂蜜中含有果糖、葡萄糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和有機(jī)酸類物質(zhì)，以及酚類物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分,具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力，緩解感冒癥狀等促進(jìn)人類健康的作用[1-3]，深受廣大民眾喜愛。我國是世界上最大的蜂蜜生產(chǎn)國和出口國，年產(chǎn)蜂蜜近50萬噸，占全球總生產(chǎn)量的27.5%，歐盟、日本、韓國等國是我國蜂蜜重要的出口市場(chǎng)[4]。

在利益的驅(qū)使下，不法商家以次充好，以假亂真來謀取巨額利益。摻雜摻假蜂蜜不但會(huì)對(duì)人體健康造成一定的威脅,而且對(duì)蜂農(nóng)的利益及整個(gè)蜂蜜市場(chǎng)產(chǎn)生不良影響。很多蜂蜜摻假物質(zhì)成分與蜂蜜中的主要成分相似度高，主要是一些糖漿，如高果玉米糖漿、玉米糖漿、麥芽糖漿、蔗糖糖漿、大米糖漿等，這些糖漿主要含有葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是天然蜂蜜的主要成分，因此摻入這些糖漿后的蜂蜜風(fēng)味變化較小，具有很大的隱蔽性，使蜂蜜摻假檢測(cè)技術(shù)存在很大的難度[5]，據(jù)歐洲委員會(huì)調(diào)查，以外源糖摻假達(dá)到6%[6]?，F(xiàn)在蜂蜜真?zhèn)蔚蔫b別方法主要有感官鑒別法[7]、光譜法[8-10]、氣相色譜法[11-13]等，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如何快速、準(zhǔn)確、高效鑒別蜂蜜摻偽，仍是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。

傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，提供了高特異性的結(jié)果，具有低水平交叉污染和減少分析時(shí)間的優(yōu)越性，成功應(yīng)用于各種源性成分的鑒定，如肉類[14-16]、海鮮[17-19]等動(dòng)物產(chǎn)品的檢測(cè)及果汁、果實(shí)等植物產(chǎn)品[19-21]的檢測(cè)。蜂蜜成分復(fù)雜，含糖量高，蜜源植物多樣性，PCR技術(shù)在蜂蜜真實(shí)屬性的應(yīng)用上還在試探性階段。

蜜蜂在采蜜的時(shí)候，身上粘有大量花粉粒，這些花粉?；蚨嗷蛏俣紩?huì)進(jìn)入蜂蜜里。目前的過濾手段尚不足以將蜂蜜里的花粉完全清除干凈。本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)蜂蜜中的花粉DNA進(jìn)行測(cè)試，選用顯花植物的顯花基因、油菜內(nèi)源基因、龍眼內(nèi)源基因的引物探針，從源頭上鑒別，同時(shí)采用傳統(tǒng)感官檢測(cè)法觀察其花粉，比較兩種方法的優(yōu)劣，探討實(shí)時(shí)熒光PCR法在蜂蜜真實(shí)屬性鑒定技術(shù)的適用性，可為直接摻假蜂蜜的鑒別提供快速有效的檢測(cè)法。

1 材料與方法

1.1 材料

14種顯花植物：玉米、橙、油菜、紫云英、洋槐、椴樹、龍眼、荔枝、菊花、紅棗、桂花、荊條、桉樹、棉花，4種非顯花植物或藻類：野生蕨類植物、苔蘚、紅藻、紫菜，市售或自備；15份蜂蜜含6份龍眼蜂蜜、6份油菜蜂蜜，3份配料表標(biāo)蜂蜜的產(chǎn)品，市售或網(wǎng)購，未知來源。

1.2 試劑

2×Taq PCR Mix預(yù)混液（上海生工生物工程有限公司）；深加工食品DNA提取試劑盒【天根生化科技（北京）有限公司】；乙酸、乙酸酐、硫酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NADH基因、油菜基因和龍眼基因的引物探針選用SN/T 4848.2-2017[22]和SN/T 4848.6-2017[23]的序列，序列見表1，委托上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物探針序列

Tguide S32全自動(dòng)核酸提取純化儀（天根生化科技有限公司）；ABI 7500熒光PCR儀器(美國Life Tech公司)；Mini spin小型離 心機(jī)(Eppendorf)；IKA MS3 basic渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；Steril GARD III Advance生物安全柜(美國貝克公司)；JJ1000電子天平(美國雙杰兄弟集體有限公司)；Ultrospec 2100 pro紫外/可見光分光光度計(jì)（美國GE公司）；CR22GⅢ落地式冷凍離心機(jī)（日本Hitachi KoKi公司）。

1.4 方法

1.4.1 DNA的提取

蜂蜜樣品50℃水浴20 min至充分融化，上下顛倒混勻。取20 g蜂蜜到50 mL的離心管中，各2管，加40℃的純化水30 mL，振蕩混勻溶解，4 500 rpm/min 10 min離心，去上清，加1 mL的水溶解沉淀，吸出至2 mL離心管中，4 500 rpm/min 10 min離心，再用純化水清洗一遍，4 500 rpm/min 10 min離心，去上清，所得沉淀按試劑盒說明提取DNA。

14種顯花植物和4種非顯花植物或藻類的種子或水果皮、葉子的DNA按試劑盒說明提取DNA。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

兩種實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系總體積25 μL，熒光PCR預(yù)混液2×Mix 12.5 μL，模板DNA 3 μL，引物對(duì)(各10 μmol/L)各1μL、探針(10μmol/L)0.5μL和ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)，CT≤45為陽性。

1.3.3 特異性檢測(cè)

取14種顯花植物的DNA為陽性對(duì)照，4種非顯花植物或藻類的DNA為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，進(jìn)行NADH基因的擴(kuò)增；油菜的DNA為陽性對(duì)照，13種其它顯花植物和4種非顯花植物或藻類的DNA作為陰性對(duì)照，水作為空白對(duì)照，進(jìn)行油菜基因的擴(kuò)增；龍眼的DNA為陽性對(duì)照，13種其它顯花植物和4種非顯花植物或藻類的DNA作為陰性對(duì)照，水作為空白對(duì)照，進(jìn)行龍眼基因的擴(kuò)增。

1.4.4 靈敏度檢測(cè)

提取棉籽的DNA、油菜的DNA、龍眼的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，稀釋到100 ng/μL作為原液，用純化水進(jìn)行梯度稀釋，獲得濃度分別為10 ng/μL、1ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL、0.00001 ng/μL的靈敏度分別進(jìn)行NADH、油菜、龍眼基因的測(cè)試，每個(gè)梯度兩個(gè)平行，純化水作空白對(duì)照。

1.4.5 蜂蜜的檢測(cè)

15份蜂蜜分別采用傳統(tǒng)鑒別方法感官法和實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的準(zhǔn)確性及靈敏度。感官法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23194-2008[7]進(jìn)行蜂蜜中花粉粒的提取、鏡檢觀察：稱取均勻蜜樣25g，加入約40℃的50 mL蒸餾水，使蜂蜜溶解混勻，以2 000 rpm/min離心10 min，去4/5上清液，加入5 mL乙酸拌勻，浸泡2 h；2 000 rpm/min離心10 min，去1/2上清液，加入新鮮配制的乙酸酐和硫酸的混合液（9+1體積比混合）6 mL，并拌勻，然后將離心管放入90℃水浴中加熱7 min；停止加熱后，2 000 rpm/min離心10 min，棄去5 mL上清液，加入10 mL蒸餾水混勻離心，如此水洗3次后去上清液，使試樣溶液留下約1 mL溶液，進(jìn)行鏡檢觀察，每張載玻片觀察十個(gè)視野，兩個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光PCR法則提取蜂蜜中的花粉的DNA，測(cè)試其濃度和純度，并采用建立好的三組基因?qū)崟r(shí)熒光PCR法檢測(cè)，比較兩者方法的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 三組引物探針特異性的檢測(cè)結(jié)果

18種測(cè)試樣品提取的DNA濃度在30～180 ng/mL，測(cè)試結(jié)果證明三組引物探針具有很好的特異性：14種常見蜜源植物的DNA均有檢出NADH基因；野生蕨類植物、苔蘚、紅藻、紫菜提取的DNA均未檢測(cè)到NADH基因；只有油菜DNA檢出油菜基因，其余均未擴(kuò)增；只有龍眼DNA擴(kuò)增有曲線，其余均未擴(kuò)增；空白對(duì)照均未擴(kuò)增，曲線強(qiáng)度高，典型“S”曲線，具體結(jié)果見圖1-3。

圖1 NADH基因引物探針特異性檢測(cè)擴(kuò)增曲線

圖2 油菜基因引物探針特異性檢測(cè)擴(kuò)增曲線

2.2 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

棉籽的DNA濃度為100ng/μL、10 ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL、0.00001 ng/μL時(shí)NADH基因擴(kuò)增的曲線CT值分別為17.35、20.82、24.30、28.82、34.12、37.67、41.88和未檢出，空白對(duì)照（CK）未檢出，擴(kuò)增曲線見圖4。圖4中曲線1為100 ng/μL，曲線2為10 ng/μL，曲線3為1 ng/μL曲線4為0.1 ng/μL曲 線5為0.01 ng/μL，曲 線6為0.001 ng/μL，曲線7為0.0001 ng/μL，曲線8為0.000 01 ng/μL，CK為 空 白 對(duì) 照，（圖5-6相同）。油菜的DNA濃度為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL、0.000 01 ng/μL時(shí)油菜基因擴(kuò)增的曲線CT值分別為22.02、25.48、29.32、32.14、35.96、未檢出、未檢出和未檢出，空白對(duì)照（CK）未檢出，擴(kuò)增曲線見圖5；龍眼的DNA濃度為100 ng/μL、1 0 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL、0.00001 ng/μL時(shí)油菜基因擴(kuò)增的曲線CT值分別為22.08、25.96、29.32、33.92、未檢出、未檢出、未檢出和未檢出，空白對(duì)照（CK）未檢出，擴(kuò)增曲線見圖6；所以三組引物探針靈敏 度 分 別 為0.0001 ng/μL、0.01 ng/μL、0.1 ng/μL。

圖3 龍眼基因引物探針特異性檢測(cè)擴(kuò)增曲線

圖4 NADH基因引物探針靈敏度測(cè)試擴(kuò)增曲線

圖5 油菜基因引物探針靈敏度測(cè)試擴(kuò)增曲線

圖6 龍眼基因引物探針靈敏度測(cè)試擴(kuò)增曲線

2.3 蜂蜜的檢測(cè)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23194-2008進(jìn)行花粉粒的提取、鏡檢，計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的花粉粒，結(jié)果為15份市售蜂蜜樣品中有1份樣品未觀察到花粉粒，另外14份蜂蜜樣品中鏡檢視野中的花粉粒數(shù)量差異很大，形態(tài)各異，大部分為圓形或橢圓形，因經(jīng)驗(yàn)不足，無法鑒定為何種花粉。提取這16份蜂蜜的花粉DNA，DNA濃度與花粉粒的數(shù)量成正比，DNA提取純度測(cè)試結(jié)果為：260/280值只有兩份樣品低于1.7，表明DNA中蛋白質(zhì)、多酚的殘余量非常少，但有6份樣品的值大于1.9，表明可能污染有RNA；而260/230值只有1份樣品高于2.0，表明大部分樣品的DNA殘存有鹽或其它小分子雜質(zhì)[24]。將提取的DNA進(jìn)行NADH基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果為15份樣品有擴(kuò)增曲線，一份樣品未檢出，該樣品鏡檢10個(gè)視野的花粉粒中計(jì)數(shù)為0，其它樣品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的CT值與花粉粒數(shù)目呈正相關(guān)。15份蜂蜜內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法結(jié)果與傳統(tǒng)感官檢測(cè)法的結(jié)果一致；將6份龍眼蜂蜜和3份未知配料蜂蜜進(jìn)行龍眼基因的檢測(cè)，只有3份檢出龍眼源性成分；將6份油菜蜂蜜和3份未知配料蜂蜜進(jìn)行油菜基因的檢測(cè)，結(jié)果有7份樣品檢出油菜源性成分，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 16份市售蜂蜜的花粉粒計(jì)數(shù)及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

蜂蜜摻假降低了蜂蜜的質(zhì)量，降低了蜂蜜的市場(chǎng)價(jià)值，降低了消費(fèi)者的信任度，需嚴(yán)厲打擊摻假摻雜行為，也說明研究不同的蜂蜜摻假方法、摻假物質(zhì)和相對(duì)應(yīng)檢測(cè)方法的重要性。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者開始嘗試使用PCR技術(shù)來檢測(cè)蜂蜜的摻雜摻假，如Sg A等人用傳統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)蜂蜜中米糖蜜進(jìn)行定量檢測(cè)，表明DNA技術(shù)可以用于蜂蜜中米糖漿的檢測(cè)[25]，馬麗等人采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定麥盧卡蜂蜜，確定該方法可在麥盧卡蜂蜜真實(shí)屬性檢測(cè)中推廣使用[26]。PCR技術(shù)在蜂蜜摻假的檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒃絹碓降玫街匾暎苑涿壑械幕ǚ蹫檠芯繉?duì)象，檢測(cè)蜂蜜是否含有花粉DNA來鑒別蜂蜜，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)。

蜂蜜本身不含植物DNA，提取蜂蜜的DNA其實(shí)提取的是蜜蜂采蜜過程中帶入的花粉粒DNA。在過去的幾十年里，花粉鑒別法一直是蜂蜜中最常見的鑒別方法，需要在顯微鏡下觀察花粉，在很大程度上，需要依靠專家的能力和判斷力，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)只需熟練的儀器操作技術(shù)，就能得到直觀的結(jié)果分析；花粉鑒別法采用化學(xué)試劑乙酸、乙酸酐和硫酸處理蜂蜜，去掉蜂蜜中的糖分和雜質(zhì)獲得較純的花粉，這三種試劑均會(huì)揮發(fā)，吸入后對(duì)鼻、喉和呼吸道有刺激性，對(duì)眼睛有強(qiáng)烈刺激作用，甚至可能誘發(fā)慢性咽炎、鼻炎和支氣管炎等疾病的發(fā)生，相比，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)從DNA提取到PCR擴(kuò)增采用較溫和的試劑，且主要是儀器密閉運(yùn)行，安全系數(shù)高。

蜜蜂采集的蜜源植物非常廣，所有的顯花植物都有可能是它們的采蜜對(duì)象，因此本研究尋找顯花植物的共有基因NADH，檢測(cè)蜂蜜中是否含有花粉來判斷蜂蜜的真假。蜂蜜提取的DNA濃度、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)CT值與花粉粒數(shù)目呈正相關(guān)，由于蜂蜜中糖分含量大，成分復(fù)雜，DNA純度一般，提取方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。

15份蜂蜜樣品中有一份樣品鏡檢和內(nèi)參基因NADH實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性，直接摻假率高達(dá)6.67%；6份龍眼蜂蜜中只有3份檢出龍眼內(nèi)源基因，未檢出有可能是龍眼花粉粒過少，低于龍眼檢出限，也有可能蜂蜜中的花粉不是龍眼，有作假嫌疑。本次購買的蜂蜜價(jià)格比較便宜，有些甚至是市面上三無產(chǎn)品，檢出率比較高。

4 結(jié)論

NADH基因檢測(cè)蜂蜜中有無顯花植物花粉，判斷蜂蜜是否真的含花粉蜂蜜；油菜基因和龍眼基因檢測(cè)單花蜂蜜中是否含有油菜花粉和龍眼花粉，判斷蜂蜜是否為真的油菜蜂蜜和龍眼蜂蜜。三組實(shí)時(shí)熒光PCR體系特異性強(qiáng)，靈敏度高，且方法安全性好、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀。能夠鑒別完全摻假蜂蜜，可應(yīng)用于蜂蜜的真實(shí)性檢測(cè)。