細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)聯(lián)合BRAF（VE1）、CyclinD1表達(dá)在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的應(yīng)用*

戴素娟 李俊韜 郭廣秀 謝訓(xùn)祿

甲狀腺結(jié)節(jié)屬于臨床常見且無特征性臨床表現(xiàn)疾病，根據(jù)結(jié)節(jié)性質(zhì)可分為良惡性，大多數(shù)結(jié)節(jié)為良性，惡性結(jié)節(jié)占5%～15%[1]。隨著我國甲狀腺癌發(fā)病數(shù)量不斷提高，臨床認(rèn)為有必要加強甲狀腺結(jié)節(jié)管理[2]。不同結(jié)節(jié)性質(zhì)選擇的治療策略及預(yù)后也存在一定差異，因此臨床認(rèn)為早期精確診斷結(jié)節(jié)性質(zhì)對治療及預(yù)后尤為重要。目前，超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查（US-FNAB）屬于甲狀腺結(jié)節(jié)早期診斷重要及主要手段之一，具有較高敏感度與特異度，但對于部分微小結(jié)節(jié)其準(zhǔn)確性仍有待提高。近年來有研究顯示，細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）蛋白過表達(dá)、V-Raf 鼠類肉瘤濾過性病毒致癌基因同源體B1（the oncogenic homologue B1 of the murine sarcoma-filtering toxin，BRAF）基因突變與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在密切相關(guān)性，而采用基因檢測技術(shù)，對DNA 提取質(zhì)量及設(shè)備要求較高，且成本昂貴，而采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，具有簡單、快速、成本低、可操作性強等諸多優(yōu)勢[3-5]?；诖耍狙芯繉⒉捎妹庖呒?xì)胞化學(xué)方法檢測BRAF V600E[BRAF（VE1）]和CyclinD1 蛋白表達(dá)，聯(lián)合US-FNAB 對甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行診斷分析，旨在探討其在甲狀腺結(jié)節(jié)早期診斷中的應(yīng)用價值，為臨床治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年1 月-2020 年6 月贛州市人民醫(yī)院就診的200 例擇期行切除手術(shù)的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，男74 例，女126 例；年齡21～74 歲，平均（46.32±12.18）歲；病灶直徑3.0～23.0 mm，平均（11.25±3.47）mm。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》，實性結(jié)節(jié)直徑>1 cm 且同時具備形態(tài)不規(guī)則、邊界不清等可疑惡性超聲影像特征，符合甲狀腺影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）4 類[6]；（2）符合文獻(xiàn)[7]《超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺活檢專家共識及操作指南》US-FNAB 操作條件，且取材涂片滿意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在其他非甲狀腺轉(zhuǎn)移局部腫瘤；（2）既往有頭頸部放射治療或甲狀腺癌家族史；（3）穿刺部位感染或無法配合診斷。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 US-FNAB 儀器：日立二郎神彩超HI VISION Avius L，US-FNAB 操作：引導(dǎo)患者取仰臥位，頭向后仰，頸部墊高，充分暴露穿刺部位。在常規(guī)超聲檢查甲狀腺后對可疑病灶進(jìn)行穿刺定位，找到最佳穿刺面，一般以甲狀腺橫切面進(jìn)行穿刺，病灶位于外側(cè)者需采用由頸中線向外側(cè)穿刺，位于內(nèi)側(cè)者需采用頸外側(cè)向內(nèi)側(cè)穿刺。常規(guī)消毒后，穿刺針（22G，巴光）于探頭內(nèi)緣在超聲儀器實時引導(dǎo)下沿探頭長軸進(jìn)針，先迅速穿刺至甲狀腺包膜上方，停頓調(diào)整后，顯示針尖與病灶在同一切面上，再迅速進(jìn)針穿刺至病灶內(nèi)，清晰顯示針尖在病灶區(qū)后，拔出針芯少許形成人工負(fù)壓，然后在不同針道來回提插5～7 次后拔出穿刺針，用充滿空氣的5 mL注射器將細(xì)針內(nèi)的細(xì)胞推注于APES 涂膠片上，涂片3～5 張，用于HE 染色，用有可疑惡性細(xì)胞的涂片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda 分類法，Ⅰ類表示標(biāo)本無法準(zhǔn)確判斷，Ⅱ類表示標(biāo)本患者為良性病變，Ⅲ類表示標(biāo)本患者為意義不明確的非典型病變，Ⅳ類表示標(biāo)本患者為可疑或明確濾泡性腫瘤，Ⅴ類表示標(biāo)本患者為可疑惡性腫瘤，Ⅵ類表示標(biāo)本患者為惡性腫瘤，剔除Ⅰ類無診斷患者，其中Ⅳ類及以下（良性、未定性、可疑濾泡腫瘤）歸入陰性，而Ⅴ類及以上歸入陽性[8]。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 儀器：LUMATAS、PathCom 全自動免疫組化儀。具體操作如下：將細(xì)胞推注于APES 涂膠片上，涂片3～5 張，用于HE 染色，對HE 染色有可疑惡性細(xì)胞的涂片2 張進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測。用鉆石筆刻號后裝入染色架并泡入二甲苯Ⅰ 10 min，去掉蓋玻片，將涂片泡入二甲苯Ⅱ5 min，二甲苯Ⅲ 5 min，無水乙醇Ⅰ 3 min，無水乙醇Ⅱ 3 min，95%乙醇1 min，70%乙醇1 min，自來水稍洗，1%鹽酸酒精脫色，鏡下控制至切片幾近無色，約需5 min，2%草酸水溶液浸潤3～5 min，自來水稍洗，蒸餾水洗3 min。褪色后的涂片經(jīng)蒸餾水洗后3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫15～20 min。用免疫組化油筆將涂片劃好區(qū)域，并分別滴加相應(yīng)的一抗BRAF（VE1）和CyclinD1，室溫下孵育2 h。1×PBS 室溫漂洗3 次，2 min/次，擦干組織周圍水滴，在組織上滴加二抗，于濕盒中室溫孵育15～18 min，1×PBS 室溫漂洗3 次，2 min/次，滴加DAB 液，于濕盒中室溫顯色5 min。甲狀腺癌分子標(biāo)志物診斷標(biāo)準(zhǔn)：BRAF（VE1）陽性表達(dá)主要分布為細(xì)胞質(zhì)上，CyclinD1 蛋白陽性表達(dá)主要分布于細(xì)胞核上，均呈現(xiàn)棕黃色顆粒。評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)著色強度及陽性細(xì)胞率評估，0、1、2、3 分依次表示無著色、淡黃、棕黃、棕褐色，陽性細(xì)胞中0、1、2、3 分依次表示著色細(xì)胞<5%、5%～25%、26%～50%、>50%。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：綜合評分≥2 分即為陽性（2～3 分為弱，4～6 分為中，>6 分為強），0～1 分表示為陰性。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn) 統(tǒng)計不同技術(shù)陰陽性檢出情況，并分析不同技術(shù)的診斷價值：以術(shù)后組織病理學(xué)結(jié)果作為甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)判斷的金標(biāo)準(zhǔn)，分析US-FNAB 檢查、ICC 技術(shù)[BRAF（VE1）和CyclinD1 蛋白檢測]及聯(lián)合策略技術(shù)（同時滿足US-FNAB、ICC 技術(shù)診斷陽性或陰性，若存在一陰一陽或診斷不明確均納入陰性）判斷甲狀腺結(jié)節(jié)惡性的敏感度（診斷技術(shù)真陽性例數(shù)與病理診斷陽性例數(shù)比值）、特異度（診斷技術(shù)真陰性例數(shù)與病理診斷陰性例數(shù)比值）、陽性預(yù)測值（診斷技術(shù)真陽性例數(shù)與診斷技術(shù)陽性篩查出的總樣本比值）、陰性預(yù)測值（診斷技術(shù)真陰性例數(shù)與診斷技術(shù)陰性篩查出的總樣本比值）、準(zhǔn)確率（診斷技術(shù)真陽與真陰性之和與總樣本數(shù)比值）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（）表示；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷結(jié)果 收集術(shù)后組織病理學(xué)資料及隨訪資料，結(jié)果顯示200 例甲狀腺結(jié)節(jié)患者，惡性結(jié)節(jié)63 例，均為甲狀腺癌；良性結(jié)節(jié)137 例，分別為甲狀腺腺瘤27 例，橋本甲狀腺炎23 例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫87 例。

2.2 不同診斷策略檢查結(jié)果 US-FNAB 檢查結(jié)果，陽性47 例，陰性126 例，誤診11 例，漏診16 例，見表1；ICC 技術(shù)檢查結(jié)果，陽性40 例，陰性121 例，誤診16 例，漏診23 例，見表2；聯(lián)合策略檢查結(jié)果，陽性54 例，陰性129 例，誤診8 例，漏診9 例，見表3。

表1 US-FNAB檢查結(jié)果（例）

表2 ICC技術(shù)檢查結(jié)果（例）

表3 聯(lián)合策略檢查結(jié)果（例）

2.3 不同技術(shù)診斷價值分析 三種診斷策略特異度、陽性預(yù)測值對比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而三種診斷策略敏感度、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率對比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；且聯(lián)合策略敏感度（85.71%）、陰性預(yù)測值（93.48%）、準(zhǔn)確率（91.50%）均最高。見表4。

表4 不同技術(shù)診斷價值分析（%）

3 討論

US-FNAB 為當(dāng)前評估甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)常用診斷技術(shù)，其操作可以提高FNAB 操作取材成功率和診斷準(zhǔn)確率，但由于該技術(shù)操作與病理醫(yī)生經(jīng)驗水平相關(guān)，此外臨床認(rèn)為該檢查技術(shù)為定性檢查，缺乏客觀指標(biāo)，仍存在部分結(jié)節(jié)難以準(zhǔn)確定性[9-10]。因此臨床提出US-FNAB 無法準(zhǔn)確判斷者可聯(lián)合檢測甲狀腺癌分子標(biāo)志物提高診斷精確度[11]。

CyclinD1 又被稱為甲狀旁腺腺瘤基因，細(xì)胞生長因子可以通過適量c-myc 誘導(dǎo)其過表達(dá)，而過量c-myc 誘導(dǎo)將會抑制CyclinD1 表達(dá)，當(dāng)CyclinD1 表達(dá)出現(xiàn)異常將會導(dǎo)致細(xì)胞失去對生長因子依賴性，出現(xiàn)下?lián)茉鲋尺^度，繼而誘發(fā)甲狀腺細(xì)胞惡變。目前已有研究顯示，CyclinD1 過表達(dá)與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)，可作為甲狀腺結(jié)節(jié)良、惡性及評估甲狀腺侵襲、轉(zhuǎn)移能力的分子指標(biāo)之一[12]。BRAF 基因是Raf 基因家族的重要一員，有報道顯示BRAF 基因突變與甲狀腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，突變主要發(fā)生在第15 號外顯子上第1 799 位點[13]。目前識別BRAF V600E 突變的方法包括實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析、焦磷酸測序、桑格測序等，這些方法有高度敏感性，但其要求高質(zhì)量的實驗室環(huán)境和特殊的設(shè)備，操作復(fù)雜、周轉(zhuǎn)時間長、成本昂貴、專用技術(shù)人員等，大多數(shù)基層醫(yī)院尚不能開展。Rashid 等[14]指出，免疫組織化學(xué)中VE1 抗體是檢測甲狀腺癌BRAF V600E 突變特異和敏感的方法。免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子和同位素）顯色來確定細(xì)胞內(nèi)抗原的成分（主要是多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性、定量的研究。

本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合策略的敏感度（85.71%）、陰性預(yù)測值（93.48%）、準(zhǔn)確率（91.50%）均最高。說明US-FNAB、CyclinD1 蛋白過表達(dá)、BRAF（VE1）聯(lián)合檢測是鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的有效指標(biāo)，更有利于判斷惡性結(jié)節(jié)。US-FNAB 仍存在一定應(yīng)用局限性，對于部分分化不良組織、囊性或穿刺技術(shù)較差操作者，其診斷效能將會受到較大影響[15-16]。而ICC 技術(shù)具有原理清晰、操作簡單等優(yōu)勢，通過不同檢測途徑提高診斷精確度[17-20]。本研究的創(chuàng)新之處在于聯(lián)合US-FNAB 及ICC 技術(shù)，檢測BRAF（VE1）和CyclinD1 蛋白表達(dá)，為病理診斷提供客觀指標(biāo)，對甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行診斷分析，探討其在甲狀腺結(jié)節(jié)早期診斷中的應(yīng)用價值，有助于甲狀腺癌臨床預(yù)后預(yù)測，便于制訂個體化的診治方案，盡量避免誤診及過度治療，且當(dāng)前此領(lǐng)域的研究在省內(nèi)尚屬空白。但由于聯(lián)合策略[USFNAB+CyclinD1+BRAF（VE1）]診斷研究報道相對較少，且本研究樣本數(shù)量較少，其結(jié)果可能存在偏倚，仍有待更多試驗證實。

綜上所述，聯(lián)合策略[US-FNAB+CyclinD1+BRAF（VE1）]應(yīng)用于甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)診斷中價值較高，可提高單一診斷敏感度、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率，降低漏診、誤診風(fēng)險。