響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)木聚糖酶耐熱菌株的發(fā)酵條件

王瑞君，袁 欣

(宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

半纖維素是自然界中含量?jī)H次于纖維素的可再生資源，半纖維素的主要成分為木聚糖，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分之一，占植物細(xì)胞干重的30-40%。[1]自然界中木聚糖含量豐富，但因其難以降解而無(wú)法被人類(lèi)充分利用。在高等植物中木聚糖是主鏈以木糖殘基通過(guò)β-1，4糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性分子，木聚糖的降解離不開(kāi)木聚糖酶。

木聚糖酶是一類(lèi)能夠降解木聚糖為木寡糖、木糖的復(fù)合酶系，木聚糖酶可應(yīng)用于能源、飼料、醫(yī)藥、食品、造紙、生物脫膠等領(lǐng)域。[2-3]木聚糖酶加入面粉中可以延緩了面包的水分遷移速率和失水速率、增強(qiáng)面包抗老化能力。[4]王茜等[5]在研究復(fù)合菌群脫膠效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，脫膠效果較好的復(fù)合菌系的組合中木聚糖酶的活力也較高。木聚糖酶可用于紙漿漂白，芬蘭森林公司在1988年首次進(jìn)行木聚糖酶工廠(chǎng)化制漿實(shí)驗(yàn)。[6]木聚糖酶來(lái)源廣泛，可來(lái)源于動(dòng)物、植物、微生物。[7-8]因微生物產(chǎn)生的木聚糖酶因具有多樣性和微生物生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的木聚糖酶大部分來(lái)源于微生物。[9-10]

產(chǎn)木聚糖酶菌株的環(huán)境來(lái)源廣泛，可來(lái)源于土壤[11]、也可來(lái)源于水體[12]，或者腐爛的植物[13]以及某些動(dòng)物的腸道[14]。本文從江西宜春溫湯溫泉水淤泥中分離到一株產(chǎn)耐熱木聚糖酶菌株，對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，有利于為木聚糖酶的進(jìn)一步工業(yè)化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

木聚糖(sigma)、玉米芯木聚糖(成都)、燕麥木聚糖(sigma)、麩皮(購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))，其他主要試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%。

木聚糖酶菌株篩選培養(yǎng)基：普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1%的木聚糖。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮15 g/L，蛋白胨5 g/L，1000 mL蒸餾水。

1.1.3 DNS溶液[15]

10g 3，5-二硝基水楊酸、16g NaOH、5.0g苯酚、5.0g亞硫酸鈉、300g酒石酸鉀鈉、超純水定容1L。

1.2 方法

1.2.1 菌株富集及篩選

從江西宜春溫湯的溫泉中取帶有淤泥的溫泉水，混勻，50 mL加入無(wú)菌錐形瓶中，同時(shí)加入1 g木聚糖，放入搖床中，55℃，180 r/min，培養(yǎng)12 h進(jìn)行產(chǎn)木聚糖酶菌株的富集。

富集液10倍梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)『线m濃度的稀釋液100 μL涂布于木聚糖酶菌株篩選培養(yǎng)基，放于生化培養(yǎng)箱，在55℃下培養(yǎng)24h。測(cè)量并記錄各菌落直徑d1、透明圈直徑d2，計(jì)算出透明圈與菌落直徑之比(d2/d1)。挑取透明圈與菌落直徑之比較大的菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)，55℃下培養(yǎng)24h。重復(fù)上述操作3次，最后挑取單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)純化菌株，以用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

按表1加入不同體積的1 mg/mL木糖溶液和蒸餾水后，在各試管中加入1 mL的DNS試劑，煮沸5 min，流水迅速冷卻，加入8 mL的蒸餾水，混勻，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的光吸收值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，木糖濃度(質(zhì)量)為橫坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=1.982X-0.03，(R2=0.999)。

表1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液的配制

1.2.3 木聚糖酶酶活力的測(cè)定

將發(fā)酵液在10000 r/min、4℃條件下離心5 min，所得上清液為粗酶液。木聚糖酶粗酶液200 μL加入到800 μL的用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的1%木聚糖底物溶液中，60℃水浴反應(yīng)5 min，采用DNS法測(cè)定所釋放的還原糖。

酶活力單位(U)定義為：在合適的條件下，單位時(shí)間(以每分鐘表示)內(nèi)水解木聚糖釋放1μg還原糖(以木糖表示)所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。[16]

即：酶活力(U)=1000M × N/(T×L)

公式中M為還原糖(木糖)的質(zhì)量(mg)，N代表酶液稀釋倍數(shù)，T為反應(yīng)時(shí)間(min)，L為反應(yīng)酶液的體積(mL)。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)

最適溫度：木聚糖溶于pH5.5的0.1M的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，配制1%的木聚糖底物溶液。800μL的底物溶液分別放置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃溫度條件下保溫10min后添加200μL粗酶液在相應(yīng)的溫度條件下反應(yīng)5min，測(cè)定酶活。

最適pH：配制pH5、pH5.5、pH6、pH6.5的0.1M的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液與pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液。木聚糖溶于不同酸堿度的緩沖液中配制不同pH的1%的木聚糖底物溶液。60℃測(cè)定不同pH值條件下的木聚糖酶活。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

最適碳源及最適添加量：在產(chǎn)酶培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨、pH7.0±0.2的基礎(chǔ)上，改變碳源，分別添加10g/L的麩皮、燕麥木聚糖、玉米芯木聚糖、苧麻半纖維素，接種2%發(fā)酵液，在60 ℃，180r/min的條件下發(fā)酵24h，然后測(cè)定發(fā)酵液的酶活，確定最佳碳源。確定最佳碳源后，在氮源不變的基礎(chǔ)上，改變最適碳源的濃度，分別設(shè)定添加量為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L，60 ℃，180r/min的條件下發(fā)酵24h，然后測(cè)定發(fā)酵液的酶活，確定最佳碳源的最適濃度。

最適氮源及最適添加量：在產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳源為麩皮、pH7.0±0.2的基礎(chǔ)上，改變氮源，分別添加1%的酵母浸粉、蛋白胨、尿素、NH4Cl，接種2%發(fā)酵液，在60 ℃，180r/min的條件下發(fā)酵24h，然后測(cè)定發(fā)酵液的酶活，確定最佳氮源。確定最佳氮源后，在碳源不變的基礎(chǔ)上，改變最適氮源的濃度，分別設(shè)定添加量為1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L，60 ℃，180r/min的條件下發(fā)酵24h，然后測(cè)定發(fā)酵液的酶活，確定最佳氮源的最適濃度。

發(fā)酵時(shí)間的檢測(cè)：利用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，培養(yǎng)12h后，每間隔4h取10mL發(fā)酵液，離心后測(cè)定上清液的酶活，確定最適發(fā)酵時(shí)間。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分析單因素試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，以木聚糖酶活(Y)為響應(yīng)值對(duì)麩皮濃度(A)、氯化銨濃度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的原理，將數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合并分析其變化情況，以確定該菌株產(chǎn)酶的最適組合。

2 結(jié)果分析

2.1 耐熱菌株的篩選

在選擇培養(yǎng)基上挑選到4株透明圈與菌落直徑比較大的菌株(結(jié)果見(jiàn)表2)，產(chǎn)酶量與比值呈正相關(guān)，可見(jiàn)菌株XY1菌株產(chǎn)酶量較大，對(duì)XY1分離純化并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 透明圈與菌落大小

2.2 木聚糖酶的酶學(xué)特性

2.2.1 木聚糖酶的最適溫度和最適pH值

圖1(a)為酶活力隨溫度變化趨勢(shì)圖。從圖1可以看出，在一定的溫度范圍內(nèi)，木聚糖酶的酶活力隨著溫度的升高而升高，60℃時(shí)酶活力達(dá)到最大，溫度高于60℃后，隨著溫度的升高，酶活力急劇下降，結(jié)果顯示，該酶的最適溫度為60℃。在55～65℃的溫度范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力(以酶活最高者為100%)達(dá)到最適溫度酶活的70%以上。不同pH值下的木聚糖酶變化圖1(b)所示，數(shù)據(jù)表明，在pH5.5時(shí)，木聚糖酶的酶活最高，該酶最適反應(yīng)pH為5.5，屬于弱酸性水解酶。在pH5-7.0的范圍，相對(duì)酶活達(dá)到最適酶活的65%以上。

圖1 溫度和pH值對(duì)木聚糖酶活力的影響

2.3 產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源及用量對(duì)酶活的影響

在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，替換不同碳源(添加量為1%)(苧麻半纖維參考文獻(xiàn)[17]制備)進(jìn)行試驗(yàn)。由圖2(a)可知當(dāng)碳源為麩皮時(shí)酶活力最高，燕麥木聚糖次之，苧麻半纖維素為底物時(shí)，木聚糖酶的活力最低。麩皮為制備面粉時(shí)的副產(chǎn)物，為重要的農(nóng)業(yè)廢棄物，作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)可充分利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)高附加值的木聚糖酶，因此在后續(xù)的發(fā)酵研究中選擇麩皮為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。以麩皮為碳源改變其添加量進(jìn)行發(fā)酵，圖2(b)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)麩皮添加量為20 g/L時(shí)菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，增大麩皮的添加量，酶活反而降低。這可能是由于麩皮添加量較高時(shí)體系中溶氧過(guò)低導(dǎo)致的。

圖2 不同碳源和氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3.2 氮源及用量對(duì)酶活的影響

固定其他因素，替換不同氮源(添加量均為1%)，由圖2(c)可知氯化銨為氮源時(shí)，菌株發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酶能力較好，蛋白胨次之。尿素為氮源時(shí)，產(chǎn)酶能力最低?？赡苁怯捎诼然@為速效氮源，易于吸收。改變氯化銨添加量為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L分別進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，圖2(d)結(jié)果顯示，木聚糖酶的酶活在氯化銨濃度為5 g/L時(shí)酶活達(dá)到最高值。

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活的影響

圖3結(jié)果顯示XY1菌株在發(fā)酵28h時(shí)其酶活達(dá)到最高值之后逐漸降低，經(jīng)spss26.0軟件對(duì)兩組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在24h和28h的酶活數(shù)據(jù)沒(méi)有明顯差異(p>0.05)，故選擇24h作為該酶的最適發(fā)酵時(shí)間。

圖3 相對(duì)酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，令麩皮濃度(A)、氯化銨濃度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)為自變量，木聚糖酶酶活力(Y)為響應(yīng)值，以Box-Behnken設(shè)計(jì)的原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面，其因素與水平見(jiàn)表3，Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 回歸模型方差分析

利用軟件Design-Expert對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出Y木聚糖酶酶活(U/mL)關(guān)于A麩皮(g/L)、B氯化銨(g/L)、C發(fā)酵時(shí)間(h)的回歸方程為：

Y=+133.87+9.34A+3.30B+12.37C-0.99AB-2.37AC-3.20BC-19.18A2-21.34B2-21.63C2

根據(jù)表5可知p<0.0001，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)p = 0.2017>0.05，不顯著，說(shuō)明該回歸方程較準(zhǔn)確，可以用作發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)化模型。R2=0.9508，調(diào)整R2=0.9897，說(shuō)明該方程擬合度較高，且該模型可以解釋98.97%數(shù)據(jù)的變化。由于表中BC的p<0.05，而AB、AC的p值大于0.05，說(shuō)明氯化銨與發(fā)酵時(shí)間的交互影響較為顯著，而麩皮與氯化銨、麩皮與發(fā)酵時(shí)間的交互影響相對(duì)之下不顯著。同時(shí)表中A2、B2、C2均對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生較為顯著的影響(p<0.0001)。

圖4是木聚糖酶酶活(Y)對(duì)應(yīng)各因素麩皮(A)、氯化銨(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)形成的三維空間曲面圖。令某一因素不變，圖8(A)結(jié)果顯示，在麩皮濃度不變時(shí)，酶活隨著氯化銨濃度的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，氯化銨濃度不變時(shí)，麩皮濃度增大時(shí)，酶活也出現(xiàn)先增大后減小的情形。圖4(B)與圖4(C)表明麩皮與發(fā)酵時(shí)間、氯化銨與發(fā)酵時(shí)間的交互影響同樣使得酶活出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)Design-Expert優(yōu)化，分析得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為：麩皮22.25 g/L，氯化銨5.05 g/L，發(fā)酵時(shí)間為26.16 h。在此優(yōu)化條件下所產(chǎn)木聚糖酶酶活理論值為136.68 U/mL。

A麩皮與氯化銨交互作用的等高線(xiàn)圖與三維圖

2.6 模型驗(yàn)證

為了確定該模型的準(zhǔn)確性，在軟件給出的優(yōu)化條件下實(shí)驗(yàn)3次，比對(duì)分析。測(cè)得木聚糖酶酶活的平均值為139.37 U/mL，與理論值誤差僅有1.96%，由結(jié)果可知此發(fā)酵條件能夠適用于該菌株發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶。

3 討論與結(jié)論

常用于微生物發(fā)酵條件優(yōu)化的方法有單因素法、正交實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法等。單因素法可篩選出影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素，但無(wú)法反映最佳因素組合，正交實(shí)驗(yàn)法可以找出最佳因素水平之間的組合，但難以尋找到因素與組合之間的回歸方程，無(wú)法考查各因素之間的交互作用。響應(yīng)面法可以得到高精度的回歸方程，在微生物的發(fā)酵優(yōu)化中應(yīng)用越來(lái)越多。Shakir等[23]用響應(yīng)面法優(yōu)化提高一株芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)量。Vijayaraghavan[24]利用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基提高了稻黃單胞菌IND3產(chǎn)纖溶酶的活性。

在本研究中，首先采用單因素法確定碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間等因素，然后利用響應(yīng)面法確定各因素的最佳值，得到了最佳發(fā)酵條件：麩皮22.25 g/L、氯化銨5.05 g/L、發(fā)酵時(shí)間26.16 h，在此優(yōu)化的發(fā)酵條件下產(chǎn)酶的最大值為139.37 U/mL，比本文中單因素試驗(yàn)最大值提高了29.05%，證明根據(jù)響應(yīng)面法所得的回歸方程以及據(jù)此優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝條件是有效的。

通常情況下，篩選的野生菌株發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酶水平不高，本文通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件，XY1菌株所產(chǎn)酶活達(dá)到139.37 U/mL。粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH為5.5。該系列結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)木聚糖酶具有進(jìn)一步研究的價(jià)值和一定工業(yè)應(yīng)用潛力。