基于高通量測(cè)序的5種蜘蛛所攜帶的細(xì)菌多樣性比較

高 瑛,韓 瑜,王玥琪,ALI Abid,2,崔淑艷,鄭 國(guó)

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)遼寧 沈陽(yáng) 110034;2.費(fèi)薩拉巴德農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系，巴基斯坦費(fèi)薩拉巴德 38040)

細(xì)菌廣泛分布于自然界,并普遍存在于動(dòng)物的各器官、組織和細(xì)胞。細(xì)菌種類豐富、群落構(gòu)成復(fù)雜,參與宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝、生殖健康及對(duì)生境的適應(yīng)等諸多生命活動(dòng)[1～4],對(duì)真核生物的多樣性和演化有十分重要的影響[5～6]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)動(dòng)物體微生物的多樣性、群落組成及其功能的認(rèn)識(shí)逐步深入。目前,針對(duì)昆蟲微生物及其功能的相關(guān)研究工作較多[6～9]。關(guān)于蜘蛛微生物的研究,早期工作多集中于內(nèi)共生菌的感染[10～13]以及內(nèi)共生菌對(duì)宿主生殖和行為影響的研究[14～15]。近期,針對(duì)蜘蛛微生物群落的研究逐漸增多,如:蜘蛛整體細(xì)菌群落研究[16～17],基于組織、器官和種群水平的細(xì)菌多樣性分析[18～21],蜘蛛腸道微生物與其獵物微生物多樣性比較[18,22]等。但是,我國(guó)北方地區(qū)蜘蛛細(xì)菌群落的比較研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

環(huán)境因素對(duì)昆蟲共生菌的傳播起著非常重要的作用[23]。蜘蛛是重要的農(nóng)林害蟲天敵,廣泛存在于陸地生態(tài)系統(tǒng),易于攜帶大量的共生菌和其他細(xì)菌等微生物[17]。不同蜘蛛對(duì)蛛絲的利用和捕食方式有所區(qū)別,所處的生境和取食的獵物也存在一定差異,因此,其所攜帶微生物的多樣性和群落組成也將受到不同程度的影響。本研究基于16S rRNA測(cè)序方法,比較了利氏貓蛛(Oxyopeslicenti;貓蛛科Oxyopidae)、星豹蛛(Pardosaastrigera;狼蛛科Lycosidae)、金黃逍遙蛛(Philodromusaureolus;逍遙蛛科Philodromidae)、三突伊氏蛛(Misumenopstricuspidatus;蟹蛛科Thomisidae)和園蛛(Araneus)sp.1(園蛛科Araneidae)共5種蜘蛛的細(xì)菌群落,以期了解蜘蛛所攜帶細(xì)菌的多樣性和群落組成與其捕食方式及生存環(huán)境的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

蜘蛛樣本于2020年10月中旬采自沈陽(yáng)市沈北新區(qū)蒲河沿岸的社區(qū)公園(41°56＇N,123°22＇E)。本研究涉及的5種蜘蛛根據(jù)捕食方式不同分屬5個(gè)功能群[24],其中,利氏貓蛛(其他游獵Ⅰ型)、金黃逍遙蛛(其他游獵Ⅱ型)、三突伊氏蛛(伏擊型)和園蛛sp.1(圓網(wǎng)型)使用掃網(wǎng)法采自灌木叢,星豹蛛(地表游獵型)使用管扣法采自地表層。5種蜘蛛均屬于非瀕危和非保護(hù)物種。每種蜘蛛選取體型接近的10頭個(gè)體,單頭保存在小廣口瓶(高5 cm,直徑3 cm)中,瓶中放入浸水的棉花保濕,瓶口塞上干燥的棉花。饑餓兩周之后,將蜘蛛經(jīng)無(wú)水乙醇固定,于-20℃冰箱保存[16]。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

按照DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN公司,美國(guó))試劑盒的說(shuō)明書,每種蜘蛛分別提取10頭個(gè)體的整體DNA。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和完整性,同時(shí)使用Nanodrop NC 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó))檢測(cè)DNA濃度和純度(OD260/OD280比值)。之后隨機(jī)選取兩頭同種蜘蛛提取的DNA等摩爾量匯合為一個(gè)樣本,以減少測(cè)序數(shù)據(jù)的偶然性[16],每種蜘蛛得到5個(gè)DNA樣本。

每個(gè)DNA樣本使用16S rRNA V3～V4區(qū)通用引物 338F(5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3＇)和 806R(5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系共25 μL:5 μL 5×reaction buffer,5 μL 5× GC buffer,2 μL dNTP(2.5 mmol/L),1 μL forward primer(10 μmol/L),1 μL reverse primer(10 μmol/L),2 μL DNA template,0.25 μL Q5 DNA polymerase,8.75 μL ddH2O。PCR 的反應(yīng)條件為:98℃預(yù)變性2 min;98℃變性15 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)25次;72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收目標(biāo)片段,合格的產(chǎn)物通過(guò)Illumina NovaSeq PE 250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海派森諾生物有限公司),用于評(píng)估細(xì)菌多樣性[25]。

通過(guò)QIIME 2軟件(2019.4)[26]中的Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2(DADA2)插件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體[27],以100%相似度進(jìn)行變異擴(kuò)增子序列(amplicon sequence variant,ASV)聚類[28],然后根據(jù)Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)[29],在Naive Bayes分類器中使用classifysklearn算法對(duì)每個(gè)ASV特征序列進(jìn)行物種注釋[30]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)ASVs進(jìn)行抽平處理后計(jì)算每個(gè)樣本的α多樣性,并通過(guò)R 3.3.1繪圖進(jìn)行可視化。α多樣性采用Chao1豐富度指數(shù)[31]、Shannon多樣性指數(shù)[32]、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)[33]和Pielou均勻度指數(shù)[34]進(jìn)行評(píng)估,使用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)和Dunn’s test檢驗(yàn)差異的顯著性。通過(guò)線性判別分析效應(yīng)量[linear discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe]揭示差異顯著且能有效解釋細(xì)菌群落差異的指示類群(LDA＞4,P＜0.05)[35],采用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)檢測(cè)組間豐度差異的類群,同時(shí)通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證顯著性,最后通過(guò)線性判別分析(LDA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維并評(píng)估差異顯著的物種的影響力。通過(guò)CANOCO 5.0分別在門和屬兩個(gè)分類水平對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),探討蜘蛛所攜帶細(xì)菌的群落組成與其宿主功能群的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

所有樣本共獲得4 645 487條原始序列,經(jīng)過(guò)DADA2進(jìn)行質(zhì)控后得到4 219 367條有效序列,平均每個(gè)樣本獲得168 775條有效序列。所有的測(cè)序結(jié)果被分為16 092個(gè)ASVs,共34門421科948屬細(xì)菌(表1)。其中,采于地表的星豹蛛劃分到的ASVs及注釋到的細(xì)菌各分類水平的數(shù)量均最多,游獵于灌木叢的金黃逍遙蛛的數(shù)量均最少(表 1)。

表1 5種蜘蛛所攜帶細(xì)菌的16S rRNA測(cè)序基本信息Table 1 Sequence analysis of bacterial 16S rRNA genes from five species of spiders

2.2 不同蜘蛛所攜帶細(xì)菌的群落組成分析

在門分類水平上,5種蜘蛛所攜帶細(xì)菌的群落組成表現(xiàn)出了較大差異。變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是5種蜘蛛共有的核心菌門(＞1%)。其中,變形菌門的相對(duì)豐度最高,在金黃逍遙蛛中占比高達(dá)74.78%,在星豹蛛中的占比最低,但也達(dá)到了47.10%;擬桿菌門的相對(duì)豐度在5種蜘蛛中較均勻,在利氏貓蛛中最高,為23.85%,在三突伊氏蛛中最低,為15.08%;厚壁菌門的相對(duì)豐度在利氏貓蛛、星豹蛛和三突伊氏蛛中超過(guò)10.46%,在另兩種蜘蛛中也超過(guò)了5.04%。此外,放線菌門(Actinobacteria)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)的相對(duì)豐度在星豹蛛中分別高達(dá)16.18%和1.41%,而在其他4種蜘蛛中最高分別僅為2.90%和0.43%;軟壁菌門(Tenericutes)的相對(duì)豐度在園蛛sp.1中高達(dá)12.64%,而在其他4種蜘蛛中最高僅為1.31%(圖1A)。

在屬分類水平上,5種蜘蛛所攜帶細(xì)菌的群落組成也表現(xiàn)出了較大差異。相對(duì)豐度大于1%的有17屬,土壤桿菌屬(Sediminibacterium)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、無(wú)氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和溶桿菌屬(Lysobacter)是共有的核心菌屬(＞1%)。其中,土壤桿菌屬和蒼白桿菌屬是除金黃逍遙蛛以外的其他4種蜘蛛中相對(duì)豐度最高的兩個(gè)菌屬,占比分別在13.97%～22.15%和12.75%～20.40%,這兩個(gè)屬在金黃逍遙蛛中的相對(duì)豐度也分別高達(dá)16.74%和14.93%;無(wú)氧芽孢桿菌屬、貪銅菌屬和溶桿菌屬的相對(duì)豐度在三突伊氏蛛中均最高(11.77%、7.98%和6.54%),在金黃逍遙蛛中均最低(2.03%、1.60%和1.27%)。此外,立克次氏體屬(Rickettsia)和沃爾巴克氏菌屬(Wolbachia)的相對(duì)豐度在金黃逍遙蛛中分別高達(dá)28.63%和17.57%,在其他4種蜘蛛中均小于0.01%;微桿菌屬(Microbacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對(duì)豐度在星豹蛛中分別為3.58%、3.59%和2.68%,在其他4種蜘蛛中最高分別為0.09%、0.02%和0.56%(圖1B)。

2.3 不同蜘蛛所攜帶細(xì)菌的α多樣性分析

本文基于ASVs水平比較了5種蜘蛛所攜帶細(xì)菌的α多樣性。分析結(jié)果表明:Chao1指數(shù)在5種蜘蛛間不存在顯著差異(P＞0.05)。星豹蛛的Shannon指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)極顯著高于金黃逍遙蛛(P＜0.01),顯著高于園蛛sp.1(P＜0.05);兩個(gè)指數(shù)在星豹蛛與利氏貓蛛、三突伊氏蛛之間,以及星豹蛛以外的其他4種蜘蛛之間不存在顯著差異(P＞0.05)。星豹蛛的Simpson指數(shù)僅顯著高于金黃逍遙蛛(P＜0.05);Simpson指數(shù)在星豹蛛以外的其他4種蜘蛛之間不存在顯著差異(P＞0.05)(圖2)。

圖2 5種蜘蛛所攜帶的細(xì)菌α多樣性差異分析OX:利氏貓蛛;PA:星豹蛛;PH:金黃逍遙蛛;MI:三突伊氏蛛;AR:園蛛sp.1.*:P＜0.05,**:P＜0.01。Fig.2 Variance analysis of the α-diversity index of bacteria among five species of spidersOX:Oxyopes licenti;PA:Pardosa astrigera;PH:Philodromus aureolus;MI:Misumenops tricuspidatus;AR:Araneus sp.1.*:P＜0.05,**:P＜0.01.

2.4 不同蜘蛛所攜帶菌群的差異分析

為比較不同蜘蛛所攜帶細(xì)菌的差異,采用LEfSe分析來(lái)發(fā)掘相對(duì)豐度存在顯著差異的類群(LDA＞4,P＜0.05)。分析結(jié)果顯示,星豹蛛和金黃逍遙蛛所攜帶的細(xì)菌中存在相對(duì)豐度具有顯著差異的菌群。星豹蛛中的放線菌門、放線菌綱(Actinobacteria)、放線菌目(Actinomycetales)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、微桿菌屬和芽孢桿菌屬顯著高于其他4種蜘蛛;金黃逍遙蛛中的立克次氏體科(Rickettsiaceae)、立克次氏體屬和沃爾巴克氏菌屬顯著高于其他4種蜘蛛(圖3)。

圖3 5種蜘蛛所攜帶細(xì)菌的LEfSe分析PA:星豹蛛;PH:金黃逍遙蛛。圖中僅顯示LDA＞4、P＜0.05時(shí)差異顯著的結(jié)果。Fig.3 LEfSe analysis of the bacteria among five species of spidersPA:Pardosa astrigera;PH:Philodromus aureoles.Only the results with significant difference(P＜0.05)when LDA＞4 are shown in the figure.

2.5 不同功能群蜘蛛優(yōu)勢(shì)菌群的PCA分析

為探討蜘蛛所攜帶細(xì)菌的群落組成與其宿主功能群的關(guān)系,在門和屬兩個(gè)分類水平對(duì)蜘蛛優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行了PCA分析排序(圖4)。在門分類水平,第一軸和第二軸分別解釋了49.72%和28.70%的變異信息(累計(jì)78.42%),地表游獵型的星豹蛛與采自灌木叢的其他4種功能群蜘蛛的優(yōu)勢(shì)菌門差異較大,放線菌門與其相關(guān)性最高;在采自灌木叢的4種功能群蜘蛛中,軟壁菌門與圓網(wǎng)型的相關(guān)性最高,變形菌門與其他游獵Ⅱ型的相關(guān)性更高(圖4A)。在屬分類水平,第一軸和第二軸分別解釋了48.43%和26.43%的變異信息(累計(jì)74.86%),其他游獵Ⅱ型的金黃逍遙蛛與其他4種功能群蜘蛛的優(yōu)勢(shì)菌屬差異較明顯,沃爾巴克氏菌屬和立克次氏體屬與其相關(guān)性最高;紅球菌屬和芽孢桿菌屬與地表游獵型的星豹蛛相關(guān)性最高(圖4B)。

圖4 不同功能群蜘蛛優(yōu)勢(shì)菌群的主成分分析(A)門;(B)屬。OTH-Ⅰ:其他游獵Ⅰ型;GRH:地表游獵型;OTH-Ⅱ:其他游獵Ⅱ型;AMH:伏擊型;ORW:圓網(wǎng)型。Fig.4 Principal component analysis of dominant bacteria among different guilds of spiders(A)Phylum;(B)Genus.OTH-Ⅰ:Other huntersⅠ;GRH:Ground hunters;OTH-Ⅱ:Other huntersⅡ;AMH:Ambush hunters;ORW:Orb web.

3 討論

本研究比較了5種蜘蛛所攜帶細(xì)菌的多樣性和組成差異,16S rRNA序列共注釋到34門421科948屬細(xì)菌。采于地表的星豹蛛所攜帶細(xì)菌的各分類水平數(shù)量均最高,為23門190科345屬,最低的金黃逍遙蛛也達(dá)到了21門141科246屬,高于以往大部分蜘蛛微生物相關(guān)研究結(jié)果[16～17]。

以往研究發(fā)現(xiàn),宿主的生活環(huán)境和食物可以影響其共生菌及腸道微生物[22,36～38],這在本研究中也得到了部分證實(shí)。在門分類水平,本研究發(fā)現(xiàn)變形菌門的相對(duì)豐度在5種蜘蛛中均最高,是蜘蛛所攜帶的細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)度最高的門。這一結(jié)果與以往很多節(jié)肢動(dòng)物有關(guān)的研究結(jié)果相似,如:Zhang等[16～17]發(fā)現(xiàn)變形菌門在多種蜘蛛共生菌中相對(duì)豐度最高;Hu等[21]報(bào)道變形菌門在溝渠豹蛛(Pardosalaura)、星豹蛛和白斑隱蛛(Nursciaalbofasciata)的腸道菌群中相對(duì)豐度最高。此外,變形菌門也是灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)[38]、橘二叉蚜(Aphisaurantii)[39]、中華通草蛉(Chrysoperlasinica)成蟲[40]、荔枝蝽(Tessaratomapapillosa)[41]和日本龜蠟蚧(Ceroplastesjaponicus)[42]等多種昆蟲共生菌群落中相對(duì)豐度最高的門。本研究結(jié)果顯示,放線菌門的相對(duì)豐度在地表游獵型星豹蛛中高達(dá)16.18%,而在采自灌木叢的其他4種蜘蛛中最高僅為2.90%,證明了環(huán)境因素對(duì)蜘蛛所攜帶細(xì)菌群落具有重要作用。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn),變形菌門的相對(duì)豐度在采自武漢不同地點(diǎn)的迷宮漏斗蛛(Agelenalabyrinthica)(98.86%)和機(jī)敏漏斗蛛(Agelenadifficilis)(13.86%)之間存在著巨大差異,這也證實(shí)了環(huán)境因素的影響。此外,本研究發(fā)現(xiàn),軟壁菌門的相對(duì)豐度在圓網(wǎng)型園蛛sp.1中最高,為12.64%,而在同樣采自灌木叢的其他3種蜘蛛中最高僅為1.31%,推測(cè)這是不同功能群蜘蛛獵取的食物不同造成的。向禮波等[43]也認(rèn)為,食性是影響東亞鉗蝎(Buthusmartensii)和西藏琵蝎(Scorpiopstibetanus)腸道優(yōu)勢(shì)菌屬的重要因素。

在屬分類水平,蒼白桿菌屬和土壤桿菌屬的相對(duì)豐度在本研究的5種蜘蛛中均超過(guò)12%,前者與Hu等[21]在溝渠豹蛛、星豹蛛和白斑隱蛛腸道細(xì)菌中的分析結(jié)果相似,而后者在以往關(guān)于蜘蛛細(xì)菌群落的研究中占比均較低,最高僅為2.03%[16～17,21]。立克次氏體屬和沃爾巴克氏菌屬是多種蜘蛛細(xì)菌群落的核心菌群[2,13,16～17],它們?cè)诒狙芯康慕瘘S逍遙蛛中是優(yōu)勢(shì)度最高的兩個(gè)菌屬,然而,這兩個(gè)菌屬的相對(duì)豐度在同樣采自灌木叢的其他3種蜘蛛和采于地表的星豹蛛中均小于0.01%。這與Goodacre等[2]在多種蜘蛛中發(fā)現(xiàn)的這兩個(gè)菌屬分布不均的結(jié)果相似。王振宇等[44]認(rèn)為,沃爾巴克氏菌屬分布不均勻與蜘蛛自身?xiàng)l件、行為,以及沃爾巴克氏菌的傳播效率有關(guān)。同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn),紅球菌屬、微桿菌屬和芽孢桿菌屬是地表游獵的星豹蛛的核心菌群,但在采自灌木叢的其他4種蜘蛛中的相對(duì)豐度均很低。上述結(jié)果從屬的分類水平再次支持了,環(huán)境因素和不同的食物對(duì)蜘蛛所攜帶細(xì)菌的群落組成的重要性。

在多樣性分析結(jié)果中,星豹蛛所攜帶細(xì)菌的各α多樣性指數(shù)均最高,其中Shannon指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)顯著高于金黃逍遙蛛和園蛛sp.1,Simpson指數(shù)顯著高于金黃逍遙蛛(P＜0.05);而采自同一灌木叢的其他4種蜘蛛的各α多樣性指數(shù)的差異均較小(P＞0.05)。以上信息說(shuō)明,環(huán)境因素對(duì)蜘蛛所攜帶細(xì)菌的α多樣性有重要影響。

通過(guò)比較不同蜘蛛所攜帶細(xì)菌的組成及多樣性,我們發(fā)現(xiàn),活動(dòng)范圍廣、接觸環(huán)境復(fù)雜的星豹蛛(地表游獵型)的細(xì)菌群落組成差異較大,多樣性最高,說(shuō)明環(huán)境是影響蜘蛛菌群的重要因素;同處于灌木叢的4種功能群蜘蛛的細(xì)菌群落組成也存在一定差異,推測(cè)是蜘蛛獵取的食物不同造成的?？偟膩?lái)講,本研究工作對(duì)進(jìn)一步了解蜘蛛的細(xì)菌群落及其影響因素有參考價(jià)值,但其影響機(jī)制和細(xì)菌對(duì)蜘蛛的影響等方面還有待進(jìn)一步研究。