樟疫霉拮抗鏈霉菌S-03菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及其穩(wěn)定性探究

孫志敏,李昱龍,沈紫竹,陳 芃,樊 奔,趙銀娟*

(1.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,中國(guó)江蘇 南京 210037;2.南京林業(yè)大學(xué)a.生物與環(huán)境學(xué)院;b.林學(xué)院,中國(guó)江蘇 南京 210037)

樟疫霉屬卵菌門(mén)(Oomycota)、疫霉屬(Phytophthora),是全球最具破壞力的植物病原體之一[1]。樟疫霉侵染植物導(dǎo)致根部萎縮,葉片縮小褪綠,冠變薄和樹(shù)頸壞死[2];伴隨著土壤周?chē)a(chǎn)生黑色滲出物[3],主根逐漸壞死并延伸到側(cè)根和莖,最終導(dǎo)致植物的死亡[4]。樟疫霉的寄主植物從20世紀(jì)80年代的900多種,已增長(zhǎng)到5 000多種[5],造成農(nóng)林業(yè)巨大損失。因此,防治樟疫霉成為亟待解決的問(wèn)題。在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中,人們普遍使用甲霜靈、亞磷酸鹽等化學(xué)農(nóng)藥抑制疫霉病害[6～8]。但是,長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性,而且化學(xué)殺菌劑對(duì)土壤環(huán)境及人類(lèi)健康具有潛在威脅[9],因此,使用天然活性化合物和生物防治疫霉病害[3],是發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的有效途徑。

放線菌(actinomycete)在自然界中廣泛分布,種類(lèi)繁多,代謝功能各異,是人類(lèi)獲得天然化合產(chǎn)物的主要來(lái)源。絕大多數(shù)已知的放線菌具有抗菌活性。目前,已發(fā)現(xiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物達(dá)22 500多種,具有抑菌活性的有16 500種,其中10 100種來(lái)自放線菌,7 630種來(lái)自鏈霉菌(streptomycete)[10]。鏈霉菌能產(chǎn)生多種次生代謝物,包括抗生素、鐵載體、固氮酶、植物激素、抗菌酶、抗氧化劑等,從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育,抵抗病原菌的侵染[11～12]。因此,該菌在農(nóng)林業(yè)極具應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前,已有多種抗菌代謝物被廣泛應(yīng)用于真菌病害防治[13]。比如:嗜酸鏈霉菌(Streptomycesphilanthi)RM-1-138能通過(guò)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì),防控立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、灰梨孢菌(Pyriculariagrisea)、鐮刀菌(Fusariumfujikuroi)等植物病原真菌引發(fā)的病害[14];埃尼索氏鏈霉菌(Streptomyceteenissocaesilis)的發(fā)酵濾液可以有效抑制向日葵土壤中的寄生雜草(Orobanchecumana),增加向日葵根際多酚氧化酶的活性,改善根際有益微生物的菌群[15];從美洲鱷梨(ButyrospermumparkiiKotschy)和樟屬(Cinnamomum)植物根部分離出的內(nèi)生木霉(Trichoderma),可以有效防治樟疫霉侵染引發(fā)的鱷梨根腐病[16]。因此,環(huán)境中存在著大量的具有潛在價(jià)值的生防鏈霉菌菌株。本研究前期從錦繡杜鵑(Rhododendron pulchrumSweet)土壤根際篩選得到了對(duì)樟疫霉具有拮抗效應(yīng)的生防菌株阿勞瓊鏈霉菌(Streptomycesaraujoniae)S-03。阿勞瓊鏈霉菌是2013年巴西科學(xué)家Da Silva等[17]從馬鈴薯根部分離出來(lái)的一種新的鏈霉菌種,其對(duì)樟疫霉的拮抗作用為本實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道,但關(guān)于該菌株的高效發(fā)酵條件及抑菌物質(zhì)的物理化學(xué)特性尚不明確。因此,本研究圍繞菌株發(fā)酵條件優(yōu)化、抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性和離體植物葉片防治開(kāi)展研究,為后期菌株的抑菌活性物質(zhì)分離和鑒定做鋪墊,同時(shí)也為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵和生防菌劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

阿勞瓊鏈霉菌菌株S-03由本實(shí)驗(yàn)室從南京林業(yè)大學(xué)錦繡杜鵑健康植株根際土壤中分離篩選獲得,樟疫霉PC-1由南京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)系戴婷婷老師友情提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

樟疫霉菌株的培養(yǎng)及鏈霉菌抑菌活性的檢測(cè)采用10%V8番茄汁培養(yǎng)基:V8番茄汁100 mL、CaCO33.0 g、瓊脂15.0 g,用去離子水補(bǔ)足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

鏈霉菌活化采用高氏一號(hào)(Gause’s synthetic agar)培養(yǎng)基:可溶性淀粉 20.0 g、K2HPO40.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KNO31.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g,pH 7,用去離子水補(bǔ)足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

發(fā)酵種子液培養(yǎng)基:可溶性淀粉20.0 g、牛肉膏 3.0 g、葡萄糖 1.0 g、酵母粉 5.0 g、CaCO34.0 g,pH 7,用去離子水補(bǔ)足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、葡萄糖15.0 g、NaCl 1.0 g、(NH4)2SO41.0 g,用去離子水補(bǔ)足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器

可溶性淀粉、牛肉膏、葡萄糖、酵母粉、CaCO3等分析純?cè)噭?購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱(松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社,日本);高速冷凍離心機(jī)(艾本德公司,德國(guó));旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA集團(tuán),德國(guó)),環(huán)境掃描電子顯微鏡(FEI公司, 美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株S-03發(fā)酵液制備

發(fā)酵種子液的制備:將菌株S-03接種于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)5 d;隨后,接種到發(fā)酵種子液培養(yǎng)基中,28℃、160 r/min培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵液制備:按1%接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃、160 r/min培養(yǎng)7 d。6 000 r/min離心20 min后,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,用于抑菌活性檢測(cè)。

1.2.2 發(fā)酵液抑菌活性檢測(cè)

將樟疫霉接種于V8番茄汁固體培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)3 d。用6 mm打孔器打取菌餅,接種到新鮮V8番茄汁固體培養(yǎng)基中央,在菌餅左右兩邊1.5 cm處各用打孔器取出瓊脂塊,并在孔中分別添加50 μL培養(yǎng)基對(duì)照和阿勞瓊鏈霉菌S-03發(fā)酵液,25℃培養(yǎng)3 d,通過(guò)比較兩邊菌絲生長(zhǎng)半徑的差異計(jì)算抑制率。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源和無(wú)機(jī)鹽條件進(jìn)行優(yōu)化。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別選用葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、可溶性淀粉作為主要碳源(15 g/L);黃豆餅粉、蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、尿素作為唯一有機(jī)氮源(10 g/L);NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、KNO3作為無(wú)機(jī)氮源(1 g/L);ZnCl2、KCl、NaCl、MgCl2、MnCl2、CaCl2作為無(wú)機(jī)鹽(1 g/L)。參照方法1.2.2檢測(cè)各樣品抑菌活性,以確定最佳培養(yǎng)基成分。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)

在對(duì)碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源和無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)成分完成篩選的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)(表1),進(jìn)行抑菌分析。每個(gè)處理重復(fù)3次。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 The orthogonal test on factors and levels

1.2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

選用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方,對(duì)發(fā)酵的裝液量、起始pH、時(shí)間、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)處理重復(fù)3次。

裝液量:在250 mL錐形瓶中,分別添加25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL 的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基,28℃、160 r/min培養(yǎng)7 d。

起始pH:將培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10、11,28 ℃、160 r/min 培養(yǎng) 7 d。

發(fā)酵時(shí)間:在28℃、160 r/min條件下培養(yǎng)1～10 d。

接種量:將種子液分別以1%、2%、4%、6%、8%接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃、160 r/min培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵溫度:將發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于25℃、28℃、31℃、34℃、37℃,160 r/min培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵轉(zhuǎn)速:將發(fā)酵轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、220 r/min,28 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.6 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性檢測(cè)

熱穩(wěn)定性:取1 mL發(fā)酵液置于2 mL離心管中,分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃處理1 h,參考1.2.2的方法檢測(cè)各組分抑菌活性。每個(gè)處理重復(fù)3次。

酸堿穩(wěn)定性:取10 mL發(fā)酵液,將pH分別調(diào)節(jié)至 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,室溫放置 2 h 后調(diào)pH至7,測(cè)定各組分抑菌活性。每個(gè)處理重復(fù)3次。

光照穩(wěn)定性:取5 mL發(fā)酵液置于培養(yǎng)皿中,室溫下打開(kāi)蓋子,置于紫外燈下分別照射0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h,測(cè)定各組分抑菌活性。每個(gè)處理重復(fù)3次。

親水性和疏水性:在發(fā)酵液離心后的上清液中分別加入等體積的三氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚,振蕩萃取24 h,分別檢測(cè)有機(jī)相跟水相的抑菌活性。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.7 菌株S-03發(fā)酵液對(duì)樟疫霉菌絲生長(zhǎng)的影響

在V8番茄汁固體培養(yǎng)基中央接種樟疫霉,并用打孔器在樟疫霉左右兩邊打孔,分別添加50 μL培養(yǎng)基和S-03發(fā)酵液,28℃培養(yǎng)3 d,觀察菌絲生長(zhǎng)狀況。將左右兩孔周邊的菌絲置于環(huán)境掃描電子顯微鏡Quanta 200下,觀察菌絲形態(tài)。

1.2.8 菌株S-03發(fā)酵液在離體植物的生防檢測(cè)

用75%乙醇浸泡錦繡杜鵑葉片30 s,無(wú)菌水沖洗3次后,用10%次氯酸鈉浸泡30 s,再用無(wú)菌水沖洗3次。病原菌對(duì)照組在葉脈兩側(cè)使用滅菌針制造表面?zhèn)?接種樟疫霉菌餅。生防組接種S-03發(fā)酵液后立即接種樟疫霉。處理后將葉片置于含潤(rùn)濕的無(wú)菌濾紙平板中,28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5 d,評(píng)估防治效果。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（)表示。原始數(shù)據(jù)記錄于Excel 2016。培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件、發(fā)酵參數(shù)和抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性,以及正交試驗(yàn),均使用SPSS 19進(jìn)行顯著性差異分析。使用Photoshop 2018計(jì)算病斑與葉片像素比,測(cè)定葉片相對(duì)病斑面積。使用GraphPad Prism 8.0繪制圖片。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

我們首先對(duì)培養(yǎng)基的碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)鹽、無(wú)機(jī)氮源進(jìn)行了優(yōu)化。所選的6種碳源培養(yǎng)基的抑菌效果如圖1A所示,菌株S-03在6種不同的碳源中均能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì),但無(wú)顯著差異;以可溶性淀粉為碳源時(shí),菌株S-03對(duì)樟疫霉的抑制率相對(duì)較高,達(dá)到58.44%。5種有機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌檢測(cè)效果如圖1B所示,以酵母粉和黃豆餅粉為有機(jī)氮源時(shí)抑菌效果最佳,分別是47.28%和50.27%,與蛋白胨、尿素、牛肉粉3種發(fā)酵液的抑菌效果有顯著差異。對(duì)于無(wú)機(jī)鹽成分而言,菌株S-03對(duì)KCl的利用效果較好,其次是NaCl、MgCl2(圖1C)。此外,菌株S-03以NH4Cl為無(wú)機(jī)氮源時(shí),抑菌效果最差,僅為25.49%,以(NH4)2SO4為無(wú)機(jī)氮源時(shí)抑菌效果最佳,達(dá)到45.23%(圖1D)。上述結(jié)果說(shuō)明培養(yǎng)基成分能顯著影響發(fā)酵液的抑菌效果。

圖1 菌株S-03發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化(A)碳源;(B)有機(jī)氮源;(C)無(wú)機(jī)鹽;(D)無(wú)機(jī)氮源。不同字母表示不同處理經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn),在P＜0.05水平差異顯著。Fig.1 Optimization of fermentation medium for strain S-03(A)Carbon sources;(B)Organic nitrogen sources;(C)Inorganic salts;(D)Inorganic nitrogen sources.Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

2.2 培養(yǎng)基成分質(zhì)量濃度的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)對(duì)碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)鹽、無(wú)機(jī)氮源的最佳培養(yǎng)基質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如表2所示。根據(jù)R值的大小可知,4種因素對(duì)菌株S-03發(fā)酵液抑菌效果的影響順序?yàn)?黃豆餅粉＞KCl＞(NH4)2SO4＞可溶性淀粉。根據(jù)K值的大小可得出,最佳發(fā)酵培養(yǎng)基水平為可溶性淀粉(3)、黃豆餅粉(1)、(NH4)2SO4(1)、KCl(1),即最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:可溶性淀粉45 g/L、黃豆餅粉20 g/L、(NH4)2SO41 g/L、KCl 1 g/L。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

選用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示,在起始pH 8、裝液量75 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間7 d、接種量2%、發(fā)酵溫度28℃、轉(zhuǎn)速160 r/min時(shí),菌株S-03的抑菌活性最佳。菌株S-03原始配方發(fā)酵液的抑制率僅為30.92%(圖3A),而優(yōu)化后發(fā)酵液的抑制率達(dá)到了58.66%(圖3B),相比原配方提高了89.72%。

圖2 不同發(fā)酵條件對(duì)菌株S-03發(fā)酵液抑菌效果的影響(A)發(fā)酵起始pH;(B)裝液量;(C)發(fā)酵天數(shù);(D)接種量;(E)發(fā)酵溫度;(F)發(fā)酵轉(zhuǎn)速。不同字母表示不同處理經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn),在P＜0.05水平差異顯著。Fig.2 The influence of different fermentation conditions on the antifungal effect of the fermentation broth of strain S-03(A)Initial pH value;(B)Amount of liquid;(C)Fermentation time(days);(D)Inoculum amount;(E)Fermentation temperature;(F)Rotation speed during fermentation.Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

圖3 優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件后菌株S-03發(fā)酵液的抑菌效果比較(A)原配方發(fā)酵液抑菌效果;(B)優(yōu)化配方后發(fā)酵液抑菌效果。Fig.3 Comparison of the antifungal effect of strain S-03 fermentation broth after medium formula and fermentation condition optimization(A)The antifungal effect before optimization;(B)The antifungal effect after optimization.

2.4 菌株S-03發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性與極性分析

為了探究S-03菌株發(fā)酵液在不同環(huán)境的應(yīng)用效果,我們對(duì)菌株S-03發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性以及抑菌物質(zhì)的極性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:pH＞7時(shí),發(fā)酵液的抑制率隨pH的升高而降低,在3～7范圍內(nèi),發(fā)酵液的抑制率波動(dòng)較小,表明其能夠耐受酸性條件,但堿性條件對(duì)活性物質(zhì)可能具有破壞作用(圖4A);隨著溫度的升高,發(fā)酵液的抑制率逐漸降低,說(shuō)明它不能耐受高溫(圖4B);發(fā)酵液經(jīng)紫外照射處理后,各組分的抑制率沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明發(fā)酵液的紫外穩(wěn)定性較高(圖4C);發(fā)酵液經(jīng)正丁醇、乙酸乙酯和三氯甲烷萃取后,均有很好的抑菌效果,但經(jīng)石油醚萃取后抑菌活性顯著降低(圖4D),表明S-03產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)極性較低,與正丁醇、乙酸乙酯和三氯甲烷極性接近。

圖4 菌株S-03抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性(A)酸堿穩(wěn)定性;(B)熱穩(wěn)定性;(C)紫外照射穩(wěn)定性;(D)抑菌物質(zhì)極性。不同字母表示不同處理經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn),在P＜0.05水平差異顯著。Fig.4 Stability of the antifungal substance from strain S-03(A)Acid-base stability;(B)Thermal stability;(C)UV-irradiation stability;(D)Polarity.Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

2.5 菌株S-03發(fā)酵液對(duì)樟疫霉菌絲生長(zhǎng)的影響

利用掃描電子顯微鏡觀察發(fā)酵液對(duì)樟疫霉菌絲形態(tài)的影響,結(jié)果顯示:菌絲表面發(fā)生不同程度的損傷,呈現(xiàn)不均一的塌陷和皺縮干癟(圖5C,紅色箭頭指示)。而對(duì)照菌絲生長(zhǎng)旺盛(圖5A左側(cè)),形態(tài)飽滿(mǎn),粗細(xì)均勻(圖5B)。上述結(jié)果表明,S-03發(fā)酵液能夠破壞樟疫霉菌絲的結(jié)構(gòu),從而抑制其生長(zhǎng)。

圖5 菌株S-03發(fā)酵液對(duì)樟疫霉菌絲形態(tài)的影響(A)S-03發(fā)酵液與樟疫霉平板對(duì)峙;(B)樟疫霉正常菌絲;(C)發(fā)酵液處理的樟疫霉菌絲。Fig.5 The effect of strain S-03 fermentation broth on the morphology of P.cinnamomi(A)S-03 fermentation broth vs.P.cinnamomi in plate culture;(B)P.cinnamomi normal mycelia;(C)P.cinnamomi mycelia treated with fermentation broth.

2.6 菌株S-03在杜鵑葉片上的生防測(cè)試

為了檢測(cè)菌株S-03發(fā)酵液的生防效果,選擇離體杜鵑葉片(在平板中保濕培養(yǎng)5 d)進(jìn)行生防效果檢測(cè)。結(jié)果顯示:接種樟疫霉菌餅的杜鵑葉片出現(xiàn)黑色病斑(圖6B),相對(duì)病斑面積為9.40%;未接種對(duì)照組無(wú)明顯病斑(圖6A);對(duì)于接種S-03發(fā)酵液再接種樟疫霉的葉片,傷口病斑明顯減弱(圖6C),相對(duì)病斑面積僅為1.88%,提示S-03發(fā)酵液有效減緩了樟疫霉對(duì)葉片的侵染。生防測(cè)試結(jié)果表明,菌株S-03發(fā)酵液在體外能夠有效保護(hù)植物,防治效率高達(dá)80.00%。

圖6 菌株S-03對(duì)杜鵑葉片的生防效果檢測(cè)(A)未接種樟疫霉;(B)僅接種樟疫霉;(C)發(fā)酵液處理后接種樟疫霉;(D)杜鵑葉片相對(duì)病斑面積(每個(gè)處理3個(gè)葉片)。不同字母表示不同處理經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn),在P＜0.05水平差異顯著。Fig.6 Biocontrol effect of strain S-03 on R.pulchrum leaves(A)Uninoculated;(B)Inoculated with P.cinnamomi;(C)Treated with fermentation broth before inoculation with P.cinnamomi;(D)Relative lesion area on leaves(3 leaves per treatment).Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

3 討論

本研究前期篩選得到一株能有效抑制樟疫霉的生防鏈霉菌菌株S-03,其被鑒定為阿勞瓊鏈霉菌。有研究發(fā)現(xiàn),阿勞瓊鏈霉菌可以通過(guò)產(chǎn)生纈氨霉素(valinomycin)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(macrolides)抗生素來(lái)抑制灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)[18]。Liu等[19]從中國(guó)青藏高原分離出阿勞瓊鏈霉菌HSA312,其發(fā)酵液能有效抑制稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)菌絲的生長(zhǎng)、分生孢子的萌發(fā)和附著物的形成。本研究也是首次報(bào)道阿勞瓊鏈霉菌S-03對(duì)樟疫霉有抑制作用,這拓寬了阿勞瓊鏈霉菌的抗菌譜。本文采用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法,對(duì)菌株S-03的發(fā)酵培養(yǎng)基條件及參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,同時(shí)對(duì)菌株S-03發(fā)酵液的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析,為后續(xù)抑菌物質(zhì)分離純化奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)酵是微生物獲得大量活性物質(zhì)的重要途徑,而發(fā)酵培養(yǎng)基的成分對(duì)活性物質(zhì)的代謝合成具有十分重要的作用[20]。相關(guān)文獻(xiàn)表明,不同的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及條件對(duì)菌株所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)有很大的影響[21]。因此,發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及穩(wěn)定性分析對(duì)后續(xù)抑菌活性物質(zhì)的分離、純化及大規(guī)模制備具有重要意義。本研究通過(guò)結(jié)合單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)S-03菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,獲得了菌株最適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及條件,但沒(méi)有考慮交互作用。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示,黃豆餅粉是影響菌株發(fā)酵液抑菌活性的主要因素(表2)。黃豆餅粉的蛋白質(zhì)含量可達(dá)40%左右,并且含有豐富的氨基酸和維生素,能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累[22];此外黃豆餅粉成本低廉,原料豐富,且容易獲取,因此其是后期進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)的重要有機(jī)氮源。菌株S-03的發(fā)酵培養(yǎng)基中除了有機(jī)氮源黃豆餅粉外,還額外增添了無(wú)機(jī)氮源(NH4)2SO4,可以提高抑菌活性產(chǎn)物產(chǎn)量,這與鏈霉菌TD-1[23](氮源為黃豆餅粉+硝酸鉀)相似。在發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化中,發(fā)酵起始pH和發(fā)酵天數(shù)對(duì)抑菌產(chǎn)物活性有較大影響,這與鏈霉菌GS-3-39[24](起始pH 5)、海洋放線菌H74-18[25](發(fā)酵時(shí)間72 h)差異較大。同種不同屬的菌株發(fā)酵參數(shù)大相徑庭,這可能與菌株自身的生理特征、遺傳分化特性及分離來(lái)源有關(guān),也可能與其生成活性物質(zhì)的代謝通路有關(guān),值得深入探討。

發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性是進(jìn)行大規(guī)模菌劑生產(chǎn)的必要因素。周麗娜等[26]報(bào)道兩株鏈霉菌HD-109、HD-103的抗菌活性物質(zhì)對(duì)紫外光照敏感,照射5 h后,抑菌活性完全喪失,這限制了菌株在大田的生防應(yīng)用。在本研究中,阿勞瓊鏈霉菌S-03發(fā)酵液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,其抑菌活性物質(zhì)能耐受pH 3～9條件(圖4A)、60℃以下溫度(圖4B)以及紫外線照射(圖4C),這有利于菌株S-03的野外生防應(yīng)用。

發(fā)酵液對(duì)樟疫霉菌絲形態(tài)造成較大影響(圖5C),推測(cè)發(fā)酵液中可能含有一些功能蛋白質(zhì),如纖維素酶、蛋白酶等,可破壞疫霉菌絲,也可能是菌株S-03產(chǎn)生的抗生素破壞了細(xì)胞膜的完整性。阿勞瓊鏈霉菌S-03發(fā)酵液經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑萃取后仍然存在較好抑菌效果,說(shuō)明活性物質(zhì)很可能是次級(jí)代謝產(chǎn)物,具體有待進(jìn)一步的分離鑒定。阿勞瓊鏈霉菌S-03在離體植物葉片中也表現(xiàn)出良好的生防效果,但本文缺少完整植株實(shí)驗(yàn),后續(xù)將在無(wú)菌苗以及大田試驗(yàn)中繼續(xù)驗(yàn)證阿勞瓊鏈霉菌S-03的生防效果。有文獻(xiàn)表明,鏈霉菌在防治植物真菌的同時(shí)還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用,如:絳紅褐鏈霉菌(Streptomycetepurpeofuscus)SP3[27]菌株對(duì)紅豆杉土傳根病和紅豆杉植株具有防治與促生的雙重作用,這極大提高了菌株的應(yīng)用性。本實(shí)驗(yàn)尚未對(duì)阿勞瓊鏈霉菌S-03的促生作用進(jìn)行研究,這也是后續(xù)研究的重要方向。

綜上所述,阿勞瓊鏈霉菌S-03有潛力作為林業(yè)上防治樟疫霉根腐病害的生防菌株,有望制成生物菌劑,投入生防應(yīng)用。優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件極大提高了發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的抑菌效果,為規(guī)?；度肷a(chǎn)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。