UAS-Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅制備及其表達(dá)分析

姜婷婷,張佳偉,劉小玲,聶宏運,唐 旻,佘美華,曾 群*

(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院檢驗科,中國湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室生態(tài)健康與人類重要疾病防控湖南省高校重點實驗室,中國湖南 衡陽 421001)

黑腹果蠅作為經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)模式生物,已經(jīng)成為研究基因調(diào)控器官發(fā)育以及各種疾病發(fā)生的一個強(qiáng)有力的模型。果蠅心臟系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的研究對確定心臟區(qū)域生成、心肌細(xì)胞分化和功能性心管形成的主要信號傳遞事件具有重要意義[1]。果蠅同源域轉(zhuǎn)錄因子Tinman及其脊椎動物同源基因NKX2.5在心管形態(tài)發(fā)生和心臟功能上的作用以及表達(dá)模式非常相似,提示無脊椎動物和脊椎動物的心臟發(fā)育有可能是由保守的同源通路控制的[2～6]。

LIM結(jié)構(gòu)域蛋白被認(rèn)為是高度保守的鋅指基序,目前已經(jīng)有近30年的研究歷史。起初,LIM來源于3種調(diào)節(jié)同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的首字母:Lin-1(一種細(xì)胞系蛋白質(zhì))、Isl1(胰島素增強(qiáng)結(jié)合蛋白質(zhì))和Mec3(一種機(jī)械感覺神經(jīng)元分化蛋白質(zhì)),表明LIM結(jié)構(gòu)域在胚胎發(fā)育、基因表達(dá)以及作為壓力/應(yīng)變傳感器中發(fā)揮作用[7]。由于鋅指基序與GATA型鋅指非常相似,人們認(rèn)為它們可能參與結(jié)合特定的DNA序列,但目前尚不清楚LIM結(jié)構(gòu)域與哪一類DNA元件結(jié)合[8]。Isl1和Mec3的LIM結(jié)構(gòu)域抑制同型結(jié)構(gòu)域與其DNA靶標(biāo)的結(jié)合,一些LIM結(jié)構(gòu)域蛋白是參與細(xì)胞譜系確定和模式形成的轉(zhuǎn)錄因子,還有一些LIM結(jié)構(gòu)域蛋白則與細(xì)胞骨架有關(guān),并在黏著斑和肌動蛋白微絲組織中發(fā)揮作用[9～11]。LIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族可在細(xì)胞關(guān)鍵生命進(jìn)程中作為適配體或支架支持蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝,尤其是介導(dǎo)多蛋白質(zhì)復(fù)合體組裝,從而參與調(diào)控多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12]。LIM的蛋白質(zhì)序列還包括額外的蛋白質(zhì)結(jié)合模塊(如PDZ、PET、激酶結(jié)構(gòu)域),它們賦予LIM蛋白特定功能并影響其亞細(xì)胞定位[13]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),人類有數(shù)百個LIM結(jié)構(gòu)域蛋白,絕大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)定位并發(fā)揮功能,但少數(shù)含有核定位或核輸出序列,使它們能夠在細(xì)胞核內(nèi)外發(fā)揮作用[14]。

果蠅的心臟祖細(xì)胞對稱分布在背側(cè)中胚層。在心臟發(fā)生過程中,這些祖細(xì)胞遷移到背側(cè)中線并形成可收縮的線狀心管,這一過程與脊椎動物早期心臟發(fā)育極為相似。果蠅的心臟由兩種不同類型的細(xì)胞組成,即內(nèi)層可收縮的心肌細(xì)胞和外層不可收縮的副心肌細(xì)胞[15]。目前研究發(fā)現(xiàn),果蠅中的36個基因可編碼出75個不同的LIM結(jié)構(gòu)蛋白,其中41.7%的LIM結(jié)構(gòu)基因在果蠅心臟肌肉組織中表達(dá),并在果蠅肌肉結(jié)構(gòu)、心臟發(fā)育、心臟功能以及造血系統(tǒng)發(fā)揮重要作用[15]。

Mlp84B是一種肌肉LIM蛋白(MLP),屬于LIM-only家族,其表達(dá)定位于肌節(jié)Z盤[16～17]。有研究表明,人類MLP基因在肌肉拉伸感知反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,其突變與肥厚和擴(kuò)張型心肌病有關(guān)[18]。小鼠LIM結(jié)構(gòu)域蛋白CRP2是果蠅Mlp84B的同系物,在血管系統(tǒng),尤其是在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。CRP2基因敲除小鼠心臟超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出輕微的肥大表型[19]。在胚胎發(fā)育后期至整個成體階段,果蠅Mlp84B與α-actinin、D-titin在心臟組織中共定位。其突變純合子在蛹期致死,雜合子顯示心動過緩和心律異常表型,并影響果蠅的壽命[20～21]。

目前,由于缺乏Mlp84B抗體,人們無法在果蠅體內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模Mlp84B互作蛋白質(zhì)的篩選,因此本研究旨在給Mlp84B基因帶上一個內(nèi)源融合表達(dá)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標(biāo)簽,以應(yīng)用GFP標(biāo)簽抗體更好地指示Mlp-84B的表達(dá)以及篩選互作蛋白質(zhì)。本研究以黑腹果蠅為材料,首先將果蠅含有內(nèi)源啟動子元件的Mlp84B基因組融合GFP序列克隆至pUAST表達(dá)載體中,利用胚胎顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒注射到果蠅早期受精卵;其次通過雜交獲得紅眼果蠅,經(jīng)單果蠅建系、平衡子定位后獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因果蠅;再次通過檢測GFP的表達(dá)定位以及Mlp84B的mRNA表達(dá)水平,驗證UASMlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅是否構(gòu)建成功;最后應(yīng)用文中構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因果蠅,在體內(nèi)證實果蠅Mlp84B與Act57B蛋白互作。我們成功構(gòu)建的Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅可以作為肌肉的標(biāo)記品系,便于在體內(nèi)大規(guī)模篩選和建立肌肉系統(tǒng)的Mlp84B互作蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò),為探究肌肉細(xì)胞形成奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

W1118(野生型果蠅,顯微注射背景果蠅)、Sp/Cyo;MKRS/TM6B(2.3號雙平衡子果蠅)和Act5C-Gal4(廣泛表達(dá)啟動子果蠅)均為本實驗室保種品系;Hand-Gal4(心臟組織表達(dá)啟動子果蠅)由湖南師范大學(xué)吳秀山教授贈送。

1.2 質(zhì)粒

轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒pΔ2-3用于輔助顯微注射;質(zhì)粒pUAST-GFP含UAS元件和GFP片段,用于制備轉(zhuǎn)基因果蠅。以上質(zhì)粒均為本實驗室保種。

1.3 試劑

本研究使用的試劑主要包括:gDNA Mini kit(CS11204,美國Invitrogen公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit和 Phanta Flash Master Mix(上海諾唯贊生物科技有限公司),QIAGEN質(zhì)粒抽提試劑盒(德國QIAGEN公司),anti-GAPDH抗體(武漢博士德生物工程有限公司),anti-GFP抗體(英國Abcam公司),anti-Act57B抗體(本實驗室制備),限制性核酸內(nèi)切酶(上海生工生物工程股份有限公司),DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.4 pUAST-Mlp84B-GFP質(zhì)粒構(gòu)建

以W1118果蠅幼蟲基因組為模板,利用PCR方法擴(kuò)增Mlp84B基因組片段(含3 613 bp上游啟動子序列、1 445 bp不含終止密碼子的基因組序列;F 引物 5＇-AAACAAATGGGACTGTGT-3＇,R引物 5＇-GAACGTTGTCAAAGCGCC-3＇),并在其兩端加上pUAST-GFP載體同源臂序列,左同源臂序列為 5＇-TGAATAGGGAATTGGGAATTC-3＇,右同源臂序列為 5＇-TCGAGCGCGGCCGCAAGATCT-3＇。使用2×Phanta Flash Master Mix和含有同源臂序列的引物對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化Mlp84B基因組片段,同時用EcoRⅠ和BglⅡ?qū)UAST-GFP載體線性化,最后采用ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit將線性化的pUAST-GFP載體和Mlp84B片段進(jìn)行同源重組連接,獲得pUAST-Mlp84B-GFP重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 轉(zhuǎn)基因果蠅制備及鑒定

1)采用QIAGEN質(zhì)粒抽提試劑盒獲取高純度的pUAST-Mlp84B-GFP重組質(zhì)粒和pΔ2-3轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒。2)準(zhǔn)備注射用DNA:首先,吸取25 μg pUAST-Mlp84B-GFP 重組質(zhì)粒和 5 μg pΔ2-3輔助質(zhì)粒(含轉(zhuǎn)位酶基因),加入1/10倍體積3 mol/L的NaOAc后,3倍體積無水乙醇混勻;其次,-80℃冷凍沉淀60 min,4℃、12 000 r/min離心15 min后去除上清;再次,用70%乙醇對沉淀物進(jìn)行漂洗,4℃、12 000 r/min離心5 min后去除上清;最后,37℃干燥沉淀物,并吸取50 μL注射緩沖液[5 mmol/L 的 KCl、0.1 mmol/L 的 NaH2PO4(pH 6.8)]溶解沉淀物。3)胚胎顯微注射:收集發(fā)育30 min的W1118果蠅胚胎,30%次氯酸鈉處理2 min后,將脫去絨毛膜的胚胎頭尾一致地排列在雙面透明膠上,待胚胎干燥1～2 min后,滴1滴halocarbon oil覆蓋胚胎,通過顯微操作儀將DNA注射到胚胎后端略微偏離中心的位置,即極細(xì)胞的位置;在注射完的胚胎附近涂一層酵母糊,將胚胎置于18℃、60%濕度的環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d。4)轉(zhuǎn)基因果蠅的篩選鑒定:將注射后羽化的果蠅單個與W1118果蠅雜交,挑選出F1紅眼果蠅,并將其單個與雙平衡系雜交,最終通過雜交確定轉(zhuǎn)基因插入在哪一條染色體上。5)采用Western-blot和熒光顯微鏡檢測紅眼果蠅GFP的表達(dá)及定位。

1.6 基因克隆相關(guān)PCR反應(yīng)混合液配制及反應(yīng)程序

在PCR反應(yīng)管中依次加入16 μL的RNasefree water、2.5 μL 的 2× Ex Taq buffer、2.5 μL 的dNTPs、2.6 μL 的上下游引物(10 μmol/L)、1 μL 的DNA模板和0.4 μL的Ex Taq DNA聚合酶,充分混勻。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性5 min,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃終延伸5 min;4℃保存產(chǎn)物。

1.7 實時熒光定量PCR反應(yīng)混合液配制及反應(yīng)程序

在96孔PCR反應(yīng)管中依次加入4.9 μL的RNase-free water、10 μL 的 2× SYBR Premix Ex TaqⅡ、2.5 μL 的 dNTPs、1.6 μL 的上下游引物(10 μmol/L)和 1 μL 的 cDNA 模板,充分混勻。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s(收集熒光),40個循環(huán);緊接著做溶解曲線分析。

1.8 免疫共沉淀

提取轉(zhuǎn)基因果蠅幼蟲總蛋白質(zhì),測定濃度;將總蛋白質(zhì)分成兩份,1份作為Input(不加抗體),1份作為實驗組(加入GFP抗體);取150 μL的總蛋白質(zhì)和1 μg的GFP抗體,4℃孵育4 h,隨后加入50 μL預(yù)先封閉好的免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)用的磁珠,4℃孵育過夜;將樣品放在磁力架上靜置10 s,吸走上清;加入500 μL的RIPA搖洗10 min,重復(fù)5次;加入50 μL的RIPA重懸磁珠,然后加等體積的上樣緩沖液,沸水煮5 min;進(jìn)行Western-blot實驗,選擇Act57B抗體進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建pUAST-Mlp84B-GFP質(zhì)粒

為了制備Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅,首先要獲得pUAST-Mlp84B-GFP重組質(zhì)粒(質(zhì)粒示意圖見圖1A)。我們以W1118果蠅3齡幼蟲基因組為PCR模板,擴(kuò)增帶有和線性化pUAST-GFP載體同源末端的Mlp84B基因組序列,通過同源重組酶獲得pUAST-Mlp84B-GFP質(zhì)粒,并用EcoRⅠ和BglⅡ?qū)?個候選陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,分別得到約5 kb的Mlp84B片段和13 kb的pUAST-GFP片段(圖1B,泳道1～3)。泳道1～2的質(zhì)?？赡苁菨舛忍?酶切消化不完全,因此最后將泳道3的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序,并進(jìn)行比對。測序結(jié)果證實,Mlp84B片段連入pUAST-GFP正確的位置(圖1C)。以上結(jié)果表明,我們成功構(gòu)建了pUAST-Mlp84B-GFP重組質(zhì)粒。

圖1 pUAST-Mlp84B-GFP重組質(zhì)粒構(gòu)建(A)pUAST-Mlp84B-GFP重組質(zhì)粒載體示意圖;(B)pUAST-Mlp84B-GFP重組質(zhì)粒的酶切電泳圖。用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切3個候選陽性質(zhì)粒(泳道1～3),分別獲得13 kb pUAST-GFP和5 kb Mlp84B兩個片段(M:D0110 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn));(C)泳道3質(zhì)粒的DNA測序部分波峰圖。Fig.1 Construction of recombinant plasmid pUAST-Mlp84B-GFP(A)Schematic diagram of recombinant plasmid pUAST-Mlp84B-GFP;(B)Gel electrophoresis of pUAST-Mlp84B-GFP recombinant plasmid with restriction enzyme digestion.EcoRⅠand BglⅡwere used to digest 3 candidate positive plasmids(lanes 1～3),and two fragments of 13 kb pUAST-GFP and 5 kb Mlp84B were obtained.M:D0110 DNA ladder;(C)Partial DNA sequence chromatogram of the Lane 3 plasmid.

2.2 成功構(gòu)建UAS-Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅

為了鑒定顯微注射技術(shù)獲得的果蠅是否是目的轉(zhuǎn)基因果蠅,我們首先將F0果蠅與W1118果蠅雜交,保留F1紅眼果蠅;接著將F1紅眼果蠅與Sp/Cyo;MKRS/TM6B平衡子果蠅雜交,分別獲得了定位在1號(Tg1)和2號(Tg2)染色體的穩(wěn)定遺傳的F2轉(zhuǎn)基因果蠅。為了進(jìn)一步鑒定該轉(zhuǎn)基因果蠅中的目的基因是否表達(dá),我們首先利用熒光顯微鏡對F1轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)F1轉(zhuǎn)基因果蠅幼蟲可見綠色熒光,且熒光主要集中在肌肉系統(tǒng)(圖2A)。其次,我們利用UAS/GAL4二元表達(dá)系統(tǒng),將UAS-Mlp84B-GFP果蠅(F2)與Hand-Gal4果蠅雜交,在熒光顯微鏡下我們觀察到Hand-Gal4＞UAS-Mlp84B-GFP果蠅心肌細(xì)胞發(fā)綠色熒光(圖2B),說明Hand-Gal4啟動子成功驅(qū)動Mlp-84B-GFP在心臟組織中高表達(dá),為后續(xù)Mlp84B在心臟組織中的功能研究奠定了基礎(chǔ);同時,將UAS-Mlp84B-GFP果蠅(F2)與Act5C-Gal4果蠅雜交,顯微觀察結(jié)果顯示,Act5C-Gal4＞UASMlp84B-GFP果蠅全身可見綠色熒光(圖2C),說明Act5C-Gal4啟動子成功驅(qū)動Mlp84B-GFP在全身組織中高表達(dá)。最后,我們提取轉(zhuǎn)基因果蠅幼蟲總RNA進(jìn)行qRT-PCR,以檢測Mlp84B的表達(dá),結(jié)果顯示,與野生型果蠅相比,Tg1和Tg2轉(zhuǎn)基因果蠅的Mlp84B的表達(dá)分別升高2.85和2.80倍(圖2D);同時,對獲得的紅眼轉(zhuǎn)基因果蠅以及W1118果蠅進(jìn)行蛋白質(zhì)提取,并利用GFP抗體進(jìn)行免疫印跡實驗,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因果蠅有GFP表達(dá),而W1118果蠅檢測不到GFP蛋白(圖2E)。以上結(jié)果表明,pUAST-Mlp84B-GFP成功定位到果蠅基因組上,并且能夠在Mlp84B自身啟動子元件的作用下啟動GFP在肌肉組織表達(dá),同時也能利用UAS增強(qiáng)子元件驅(qū)動Mlp84B異位表達(dá)。

圖2 UAS-Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅的鑒定(A)F1果蠅幼蟲肌肉系統(tǒng)發(fā)綠色熒光,紅色箭頭指示肌原纖維;(B)Hand-Gal4啟動子驅(qū)動UAS-Mlp84B-GFP,綠色熒光除了在肌肉系統(tǒng)表達(dá)之外,還在幼蟲心管表達(dá)(白色箭頭);(C)Act5C-Gal4啟動子驅(qū)動Mlp84B-GFP,綠色熒光在全身各組織廣泛高表達(dá);(D)Tg1和Tg2轉(zhuǎn)基因果蠅Mlp84B的mRNA表達(dá)水平相對于野生型W1118果蠅分別上升了2.85和2.80倍。***P＜0.01,ns表示無顯著性差異,n=3,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;(E)通過免疫印跡實驗?zāi)軌蛟赥g1和Tg2轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)檢測到GFP蛋白的表達(dá),而W1118果蠅中無GFP蛋白的表達(dá)。Fig.2 Identification of UAS-Mlp84B-GFP transgenic Drosophila(A)Green fluorescence appearing in the muscular system of F1 Drosophila larva.Red arrows indicate myofibrils;(B)Green fluorescence appearing in larval cardiac(white arrow)in addition to the muscular system.UAS-Mlp84B-GFP was driven by Hand-Gal4 promoter;(C)Green fluorescence protein widely and highly expressed in all tissues of the larval.Mlp84B-GFP was driven by the promoter Act5C-Gal4;(D)The mRNA expression level of Mlp84B in Tg1 and Tg2 transgenic Drosophila was increased by 2.85 and 2.80 folds,respectively,compared with that of W1118.***P＜0.01,ns means no significant difference(n=3).The data are expressed as mean ± standard error(±s)and t test was used for comparison between the two groups;(E)GFP protein could be detected in Tg1 and Tg2 transgenic Drosophila,but not in W1118by Western-blot.

2.3 UAS-Mlp84B-GFP在果蠅肌肉組織表達(dá)

從前述結(jié)果可知,我們成功構(gòu)建了UASMlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅,GFP能夠在Mlp84B啟動子元件的作用下啟動表達(dá),因此我們可以通過GFP的表達(dá)來示蹤Mlp84B蛋白在果蠅體內(nèi)的定位。在本研究中,我們以Tg1轉(zhuǎn)基因果蠅胚胎、幼蟲、蛹以及成蠅為材料,在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)定位。結(jié)果顯示,內(nèi)源性Mlp84B在果蠅生命周期都有表達(dá),而且主要表達(dá)于肌肉系統(tǒng),其中在胚胎和幼蟲階段的表達(dá)量最高(圖3)。

圖3 Mlp84B-GFP在果蠅肌肉組織中表達(dá)通過檢測GFP表達(dá),示蹤Mlp84B在果蠅胚胎(A)、幼蟲(B)、蛹(C)和成蟲(D)的表達(dá)定位。Mlp84B強(qiáng)烈表達(dá)于果蠅肌肉系統(tǒng)。Fig.3 Mlp84b-GFP is expressed in Drosophila muscle tissueThe localization of Mlp84B in Drosophila embryo(A),larvae(B),pupa(C)and adult(D)was traced by detecting GFP expression.Mlp84B was strongly expressed in Drosophila muscular system.

2.4 Mlp84B與Act57B存在相互作用

Mlp84B與Act57B在胚胎肌肉和成體肌肉組織均有表達(dá),并且都是作為Mef2(myocyte enhancer factor-2)的靶標(biāo)調(diào)控肌肉系統(tǒng)的形成和功能[22～23]。為了探究Mlp84B、Act57B兩者的作用關(guān)系,我們首先利用STRING在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Mlp84B與Actn、Tm2、Mlc2等多個肌肉蛋白的表達(dá)有共定位,這種共定位表達(dá)在其他物種中同樣存在(圖4A),同時,Mlp84B與Act57B存在強(qiáng)烈的物理性相互作用(圖4B);其次利用構(gòu)建的UASMlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行體內(nèi)免疫共沉淀,結(jié)果表明Mlp84B與Act57B在果蠅體內(nèi)存在物理性相互作用(圖4C、4D)?；谏鲜鼋Y(jié)果,我們推測Mlp84B與Act57B在肌肉組織中能夠形成復(fù)合體,共同調(diào)控肌肉系統(tǒng)的形成和功能。

3 討論

Mlp84B是一種肌肉LIM蛋白。人類MLP基因在肌肉拉伸感知反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,其突變與肥厚和擴(kuò)張型心肌病有關(guān)[18]。小鼠LIM結(jié)構(gòu)域蛋白CRP2是果蠅Mlp84B的同系物,在血管系統(tǒng),尤其是在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。CRP2基因敲除小鼠的心臟超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出輕微的肥大表型[19]。肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Mef2通過對肌肉特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,確定和維持分化的肌肉表型。Mlp84B是已知的dMef2調(diào)控靶基因,在胚胎發(fā)育后期至整個成體階段,果蠅Mlp84B與α-actinin、D-titin在心臟組織中共定位,共同調(diào)控心臟功能,并影響果蠅的壽命[20]。目前的研究認(rèn)為,Mlp84B在果蠅Z盤成分缺陷心臟與心肌病發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21],但其在果蠅心臟發(fā)育中的作用尚不清楚。本研究將Mlp84B啟動子序列和編碼序列構(gòu)建到pUAST-GFP表達(dá)載體中,利用胚胎顯微注射技術(shù)將pUAST-Mlp84B-GFP重組質(zhì)粒注射到果蠅受精卵,雜交獲得穩(wěn)定果蠅品系后,經(jīng)qRT-PCR(圖2D)、Western-blot(圖 2E)驗證,獲得兩類 Mlp84BGFP轉(zhuǎn)基因果蠅,即Tg1和Tg2。我們構(gòu)建的Mlp-84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅包含Mef2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,通過融合表達(dá)的GFP可對Mlp84B在果蠅體內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行示蹤。本研究的檢測結(jié)果顯示,Mlp-84B-GFP在肌肉組織/肌原纖維高表達(dá)(圖2A、圖3),表明Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅可作為果蠅肌肉系統(tǒng)的熒光報告品系。為了探究Mlp84B在肌肉系統(tǒng)中的互作蛋白質(zhì),本文通過生物信息學(xué)分析篩選了Mlp84B候選互作蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)Mlp84B與多個肌肉蛋白質(zhì)共定位表達(dá)且存在相互作用(圖4A、4B)?；诖?本研究利用構(gòu)建的UAS-Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅,通過免疫共沉淀實驗,在體內(nèi)證實Mlp-84B與另一個肌肉蛋白質(zhì)Act57B存在物理學(xué)互作(圖4C、4D)。我們推測Mlp84B與Act57B在肌肉組織中形成復(fù)合體,共同受到肌肉組織轉(zhuǎn)錄因子Mef2的靶向調(diào)控,最終影響肌肉組織的形成和功能。

圖4 Mlp84B與Act57B的相互作用分析(A)生物信息學(xué)分析與Mlp84B共定位的蛋白質(zhì)。左圖為在果蠅中與Mlp84B共定位的蛋白質(zhì),右圖為在其他物種中與Mlp84B共定位的蛋白質(zhì);(B)生物信息學(xué)分析果蠅Mlp84B的相互作用蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò);(C～D)Mlp84B與Act57B存在物理相互作用。Fig.4 Mlp84B interacted with Act57B(A)Bioinformatics analysis of the co-localization proteins of Mlp84B in Drosophila(left)and other species(right);(B)Bioinformatics analysis of protein interaction network with the Drosophila Mlp84B;(C～D)Mlp84B interacts with Act57B physically.

此外,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Mlp84B與多個蛋白質(zhì)有共定位和互作,這些蛋白質(zhì)大多數(shù)在肌肉組織高表達(dá)(圖4A、4B),并且在果蠅和人類等高等生物中高度保守。我們推測,肌肉LIM蛋白Mlp-84B能夠在肌肉組織中建立一個蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),共同影響肌肉細(xì)胞的形成、分化和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。我們期待利用UAS-Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅,通過GFP抗體在蛋白質(zhì)組學(xué)上大規(guī)模篩選Mlp84B內(nèi)源性互作蛋白質(zhì),建立一個完善的肌肉蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),為揭示人類肌肉系統(tǒng)的發(fā)生和穩(wěn)態(tài)奠定基礎(chǔ)。

總的來講,本文構(gòu)建的UAS-Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅既可以在Mef2轉(zhuǎn)錄因子的作用下啟動Mlp84B在所有類型的肌肉細(xì)胞中表達(dá),又可以通過UAS-Gal4二元表達(dá)系統(tǒng)在Hand-Gal4心臟特異啟動子的作用下啟動Mlp84B在心臟組織中過表達(dá),為后續(xù)研究Mlp84B在心臟組織中的作用奠定了基礎(chǔ)。由于構(gòu)建的UAS-Mlp84B-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅只包括上游3 kb的調(diào)控序列,并不能完全反映Mlp84B的內(nèi)源表達(dá)情況,所以后續(xù)我們還將制備果蠅Mlp84B抗體以及通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Mlp84B原位敲入的GFP果蠅,以更加全面地探索Mlp84B的表達(dá)及功能。