郎佳琪,趙順鑫,王 丹,李金金,黎海靈,周 濃,趙晶晶*,李雅南
1重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,重慶 404120;2虎林市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,虎林 158100
滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)屬于百合科重樓屬多年生藥用植物,其干燥根莖具有涼肝定驚、消腫止痛、清熱解毒等功效[1],以其獨特療效和低毒副作用受到了廣泛關(guān)注和使用。隨著制藥工業(yè)需求量的逐年增加,造成了野生資源日益枯竭,故人工栽培滇重樓成了實現(xiàn)資源可持續(xù)利用的有效途徑,通過生物技術(shù)來改善滇重樓藥用品質(zhì)已成為國內(nèi)研究滇重樓規(guī)范化栽培體系的熱點領(lǐng)域,也是實現(xiàn)野生資源有效保護(hù)和資源可持續(xù)利用的必由之路[2,3]。
隨著工業(yè)迅速發(fā)展以及化肥、農(nóng)藥大量施用導(dǎo)致土壤重金屬污染問題日益嚴(yán)重,土壤中重金屬只能在環(huán)境中遷移,不能被土壤微生物分解而不斷積累,當(dāng)重金屬積累量達(dá)到一定限度時就會對植物系統(tǒng)產(chǎn)生毒害效應(yīng),再通過食物鏈危害人類生命健康[4]。例如,鎘(Cd)元素超標(biāo)會誘導(dǎo)糖尿病、生殖毒性、骨質(zhì)疏松癥、腎功能損傷以及脾肝等器官致癌[5],汞(Hg)元素超標(biāo)會影響人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6],鉛(Pb)元素對造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等均具有危害作用[6],故中藥材重金屬殘留問題是確保中藥材“安全、可控、有效”的首要問題之一。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)作為自然界中分布最廣的植物共生真菌,外源接種AMF可有效地降低宿主植物對重金屬元素的吸收[1,7-9],如Li等[9]以翅莢木為宿主植物,外源接種AMF能與翅莢木形成良好的共生關(guān)系,降低翅莢木內(nèi)Cu和Pd濃度;Wei等[1]以木香為宿主植物,發(fā)現(xiàn)外源接種摩西球囊霉(Glomusmosseae,Gm)、透明盾巨孢囊霉(Scutellosporapellucida,Spe)和美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora,Sca)三種AMF可以顯著降低木香根部對重金屬元素(Cd、Cu、Hg、Pb和As)的吸收;Li等[10]以花生為宿主植物,外源接種AMF降低了植株地上部分Cd含量,改變了根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)來吸附固持Cd??梢?,AMF可以通過根外菌絲螯合重金屬離子和過濾保護(hù)根系等直接作用,以及促進(jìn)宿主植物對營養(yǎng)元素的吸收改變根際土壤重金屬生物有效性和根際環(huán)境等間接作用來減少宿主植物對重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運和累積[11],故外源接種AMF可有效地減少中藥材重金屬的殘留,確保了中藥材的安全性和有效性。
目前,對滇重樓重金屬元素的研究主要集中于接種單株AMF[7,8]以及不同產(chǎn)地[11,12]等方面,而關(guān)于AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤、須根和根莖內(nèi)重金屬元素的對比研究鮮有報道。故本研究對課題組前期篩選出的12種優(yōu)良單株AMF[12-15]進(jìn)行混合,對無菌盆栽的滇重樓進(jìn)行接種共生培養(yǎng)。研究接種不同AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤、須根和根莖內(nèi)重金屬殘留量的影響,以便尋找出能有效降低滇重樓根際土壤、須根和根莖內(nèi)重金屬殘留量的AMF混合菌劑,為不同AMF混合菌劑在滇重樓生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了理論依據(jù),為滇重樓的菌根化栽培提供了技術(shù)支持。
供試植株為滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)實生苗,購買自云南省大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院,經(jīng)重慶三峽學(xué)院的周濃教授鑒定為百合科植物滇重樓。
根據(jù)課題組前期的試驗結(jié)果[3,15],按表1方式將12種優(yōu)良單株AMF菌劑進(jìn)行混合[16,17],供試AMF購買自美國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心,經(jīng)三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室進(jìn)行菌劑的保存和擴(kuò)繁,接種菌劑為帶有孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質(zhì)。
表1 叢枝菌根真菌的混合方式
供試土壤為未種植過滇重樓的沙壤土,基本理化性質(zhì)如下:全鉀28.83 g/kg、速效鉀328.64 mg/kg、全氮1.83 g/kg、速效氮10.64 mg/kg、堿解氮為43.50 mg/kg、全磷0.315 g/kg、速效磷104.66 mg/kg、有機(jī)質(zhì)21.2 g/kg、pH值6.87。供試土壤去除碎石、草根等雜物后,用2 mm篩子過篩,與河砂按3∶1體積比混合作為栽培基質(zhì),置于1×105 Pa、121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌2 h,黑暗條件下保存1 周后裝盆,栽培容器為15 cm×18 cm的白色塑料花盆(用75%乙醇溶液擦拭3遍),每盆裝土量為16.0 kg,按每千克土施用有機(jī)肥1.33 g、鉀肥0.013 g、鈣鎂磷肥0.31 g充分混勻,作為基肥一次性施用。每盆栽種大小基本一致的滇重樓5株,溫室光強(qiáng)設(shè)置為280 μmol/(m2·s),光照時間為每天14 h,隔天澆水至田間持水量70%~80%。
本試驗于2020年在重慶市萬州區(qū)鐵峰山國家森林公園室內(nèi)進(jìn)行,采用室溫盆栽方法進(jìn)行單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計,共設(shè)置9個混合菌劑處理(S1~S9)和1個對照(S10),每處理各設(shè)置10次重復(fù),每盆接種劑量為15 mL(每1 mL約含60個孢子),菌劑均勻施在滇重樓根莖處的表土下,按照常規(guī)方式進(jìn)行管理。
原子吸收分光光度計(TAS-990AFG,源于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);原子熒光光度計(AFS-230E,源于北京科創(chuàng)海光有限公司);數(shù)顯加熱板(C-MAG HP10,源于德國IKA集團(tuán));電熱恒溫真空干燥箱(DZF-6050MBE,源于上海博訊實業(yè)有限公司);分析天平(AE-240,源于梅特勒-托利多儀器上海有限公司);Pb、銅(Cu)、砷(As)、汞(Hg)和鉻(Cr)空心陰極燈源于北京曙光明電子光源儀器有限公司。
重金屬元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL):Pb(批號為GSB04-1742-2004)、Cu(批號為GSB04-1725-2004)、As(批號為GSB04-1714-2004)、Hg(批號為GSB04-1729-2004)和Cr(批號為GSB04-1723-2004)源于國家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所,濃HNO3、氫氟酸和濃HCl均是優(yōu)級純,源于成都金山化學(xué)試劑有限公司,水為去離子水。實驗所用玻璃器皿采用20% HNO3溶液浸泡24 h,去離子水沖洗干凈,備用。
分別在2021年6月(T1)、7月(T2)、8月(T3)和9月(T4)收獲滇重樓植株的須根、新根莖和老根莖,45 ℃條件下烘干,粉碎過40目篩備用;對應(yīng)的根際土壤自然風(fēng)干,按分析要求分別粗磨、細(xì)磨后過40目篩,備用。采用原子吸收光譜法測定根際土壤和根莖內(nèi)Pb、Cu、As、Hg和Cr殘留量[18]。
試驗數(shù)據(jù)的整理采用Excel 2003軟件,數(shù)據(jù)方差分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(P<0.05),繪圖采用Origian 9.0軟件進(jìn)行。
根莖內(nèi)重金屬元素的富集系數(shù)(bioconcentration factor,BCF)按下列公式計算:
外源接種不同AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤Pb、Cu、As、Hg和Cr 5種重金屬殘留量均有一定的影響(見圖1)。與對照相比,滇重樓根際土壤重金屬殘留量在不同生長時期變化的差異較大,其中,S4處理對土壤中Pb殘留量的調(diào)控效果最佳,S1、S3和S5處理的調(diào)控效果次之;S1處理對土壤中Cu殘留量的調(diào)控效果最佳,S3和S9處理調(diào)控效果次之;S6處理對土壤中As、Hg和Cr殘留量的調(diào)控效果最佳,其下降幅度依次為24.81%~75.43%、42.86%~75.54%和16.01%~83.96%,S4處理調(diào)控效果次之。
圖1 叢枝菌根真菌對滇重樓根際土壤內(nèi)重金屬殘留量的影響
從重金屬殘留量來看,Pb和Hg殘留量隨著生長時期延長先升高后降低,最高值出現(xiàn)在T2期;Cu和Cr殘留量隨著生長時期延長而逐漸增加,多數(shù)處理的最高值出現(xiàn)在T4期;而As殘留量變化不明顯,維持在1.96~8.68 mg/kg之間。中國土壤元素背景值規(guī)定Pb殘留量為40.60 mg/kg、Cu殘留量為46.30 mg/kg、As殘留量為18.40 mg/kg、Hg殘留量為0.065 mg/kg、Cr殘留量為65.20 mg/kg[19]。除Cu和As外,其余3種元素均存在超過背景值的處理組。這說明AMF混合菌劑對重金屬元素的吸收具有差異性和很強(qiáng)的生物吸附潛力,導(dǎo)致滇重樓根際土壤中的Pb、Hg和Cr元素存在不同程度的累積和富集。
滇重樓須根中所含的藥用成分與根莖具有相同性,所以進(jìn)一步開發(fā)利用滇重樓須根資源具有重要的研究價值,滇重樓須根內(nèi)5種重金屬殘留量高低順序為As>Pb>Hg>Cu>Cr(見表2),與對照相比,外源接種不同AMF混合菌劑可以不同程度地促進(jìn)滇重樓須根內(nèi)上述5種重金屬殘留量的增加,與對照相比,整個生育期內(nèi)Pb殘留量的平均增長幅度介于88.86%~156.97%之間,Cu殘留量的平均增長幅度介于37.49%~88.97%之間,As殘留量的平均增長幅度介于122.07%~138.79%之間,Hg殘留量的平均增長幅度介于148.25%~169.69%之間,Cr殘留量的平均增長幅度介于30.79%~50.02%之間,方差分析可知,除T1期S2處理和T2期S3處理的Pb、T3期S6和S9處理的Cr外,其余處理與對照間差異均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。從重金屬殘留量來看,不同時期接種不同AMF混合菌劑后,滇重樓須根內(nèi)重金屬殘留量普遍高于對照。其中,T3期S3處理的Pb殘留量最高(0.59 mg/kg),T1期S4處理的Cu殘留量最高(0.29 mg/kg),T1期S6處理的As殘留量最高(1.83 mg/kg),T4期S8處理的Hg殘留量最高(0.17 mg/kg),T2期S8和S9處理的Cr殘留量最高(均為0.04 mg/kg)。
表2 叢枝菌根真菌對滇重樓須根內(nèi)重金屬殘留量的影響
滇重樓新根莖和老根莖內(nèi)重金屬殘留量高低順序為Cr>As>Pb>Cu>Hg(見圖2~4),外源接種不同AMF混合菌劑對新根莖和老根莖內(nèi)重金屬殘留量均有一定的影響,與對照相比,S6處理對新根莖和老根莖內(nèi)Pb殘留量的調(diào)控效果最佳,其下降幅度分別為7.53%~46.58%和11.95%~75.87%;S1和S6處理對新根莖內(nèi)Cu殘留量的調(diào)控效果最佳,S6和S7處理對老根莖內(nèi)Cu殘留量的調(diào)控效果最佳。其中,S6處理下降幅度分別為33.37%~77.51%和36.05%~68.59%;S4和S8處理對新根莖內(nèi)As殘留量的調(diào)控效果最佳,S3、S5、和S9處理對老根莖內(nèi)As殘留量的調(diào)控效果最佳;S1、S6和S9處理對新根莖內(nèi)Hg殘留量的調(diào)控效果最佳,S5、S6、S7和S8處理對老根莖內(nèi)Hg殘留量的調(diào)控效果最佳,其中,S6處理下降幅度分別為20.99%~45.43%和27.18%~61.89%;S2、S3和S6處理對新根莖內(nèi)Cr殘留量的調(diào)控效果最佳,S3、S4、S5和S6處理對老根莖內(nèi)Cr殘留量的調(diào)控效果最佳,其中,S6處理下降幅度分別為16.10%~42.03%和7.25%~78.69%。
圖2 叢枝菌根真菌對滇重樓新根莖和老根莖內(nèi)Pb和Cu殘留量的影響
圖3 叢枝菌根真菌對滇重樓新根莖和老根莖內(nèi)As和Hg殘留量的影響
圖4 叢枝菌根真菌對滇重樓新根莖和老根莖內(nèi)Cr殘留量的影響
從重金屬殘留量來看,不同時期接種不同AMF混合菌劑后,滇重樓新根莖和老根莖內(nèi)重金屬殘留量普遍低于對照。其中,T1期和T3期CK的老根莖內(nèi)As殘留量依次為2.03 mg/kg和3.93 mg/kg,T3期CK以及T4期S1、S2和CK的老根莖內(nèi)Hg殘留量依次為264.62、223.05、209.63和243.02 μg/kg,根據(jù)《中國藥典》和《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,上述處理的老根莖內(nèi)As和Hg重金屬殘留量均不符合限量標(biāo)準(zhǔn),除T3期S5處理的老根莖Cr殘留量符合限量標(biāo)準(zhǔn)外,其余處理的Cr殘留量均不符合限量標(biāo)準(zhǔn),這可能與 AMF種間差異以及菌種間協(xié)同作用有關(guān),不同菌種或不同AMF混合菌劑對重金屬的敏感性不同,接種AMF混合菌劑促進(jìn)了滇重樓對某種重金屬的吸收,但無一致規(guī)律,具體原因有待進(jìn)一步深入研究。
滇重樓根莖內(nèi)重金屬富集系數(shù)可以反映宿主植物富集土壤重金屬的能力,從表3的結(jié)果來看,Cr各處理的BCF均小于0.1,這說明滇重樓對Cr的吸收強(qiáng)烈貧化;Cu前期(T1和T2)各處理的BCF介于0.5~1.5之間,后期(T3和T4)各處理的BCF均小于0.5,這說明滇重樓對Cu的吸收隨著生長時期的延長而逐漸貧化;As和Hg各處理的BCF均大于3.0,這說明滇重樓對As和Hg的吸收強(qiáng)烈富集??梢姡嶂貥菍χ亟饘僭氐奈站哂羞x擇性,尤其是對As和Hg表現(xiàn)出強(qiáng)烈富集作用,對Cr表現(xiàn)出相對富集作用。
表3 叢枝菌根真菌對滇重樓根莖內(nèi)重金屬富集系數(shù)的影響
滇重樓種植基地土壤中的重金屬元素間存在不同程度的相關(guān)性(見表4),土壤中Pb殘留量與Hg之間呈極顯著正相關(guān)(R=0.629),Cu殘留量與Cr之間呈顯著正相關(guān)(R=0.511),這說明種植基地土壤中以上兩種重金屬元素之間存在相互促進(jìn)吸收的關(guān)系;Cu殘留量與Hg之間呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.335)。這說明種植基地土壤中Cu和Hg之間存在相互抑制吸收的關(guān)系。
表4 滇重樓根際土壤中重金屬元素間相關(guān)分析
重金屬元素在滇重樓生長過程中的積累可能存在協(xié)同或競爭兩種效應(yīng),不同生長時期表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律(見表5),就老根莖而言,Pb與Cu、As和Cr之間呈極顯著正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)依次為0.527、0.753和0.414;Cu與Cr之間呈極顯著正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為0.455,As與Hg和Cr之間呈極顯著正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)依次為0.487和0.500,Hg與Cr之間呈顯著正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為0.338,這說明滇重樓老根莖對重金屬元素的吸收具有顯著的協(xié)同作用。就新根莖而言,Pb與Cr之間呈極顯著正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為0.482,As與Hg之間呈極顯著正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為0.542,這說明滇重樓新根莖對Pb與Cr、As與Hg的吸收具有顯著的協(xié)同作用;As與Cr之間呈極顯著負(fù)相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為-0.484,Hg與Cr之間呈顯著負(fù)相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為-0.369,這說明滇重樓新根莖對As與Cr、Hg與Cr的吸收具有顯著的競爭作用??傊?,滇重樓老根莖對重金屬元素的吸收作用明顯高于新根莖。
表5 滇重樓根莖中重金屬元素間相關(guān)分析
菌根真菌可以通過雙向養(yǎng)分循環(huán)來促進(jìn)藥用植物的生長發(fā)育,提高藥用植物的適應(yīng)性,菌根植物可以將葉片中合成的有機(jī)物通過AMF大量地輸送到根系中,同時根際土壤中的礦質(zhì)元素(重金屬)也可以通過AMF輸入到植物組織中,以此來調(diào)控植物組織內(nèi)礦質(zhì)元素(重金屬)含量[8,20],故外源接種AMF是降低中藥材重金屬殘留量的主要微生物修復(fù)有效策略之一[21]。本研究發(fā)現(xiàn),接種AMF混合菌劑可以不同程度地減少根際土壤中重金屬的殘留量,其中,S4處理對土壤中Pb殘留量的調(diào)控效果最佳,S1處理對土壤中Cu殘留量的調(diào)控效果最佳,S6處理對土壤中As、Hg和Cr殘留量的調(diào)控效果最佳,這說明AMF菌絲體對重金屬的吸附潛力不同,并且不同真菌菌絲體對各金屬離子的吸附能力也不同,其不同原因主要是不同AMF分泌的蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸等有機(jī)物不同,這些分泌的有機(jī)物能夠與不同的重金屬離子螯合,進(jìn)而降低根際土壤中重金屬的生物可利用性或可移動性,從而減輕重金屬的毒害。再者,從重金屬殘留量來看,滇重樓根際土壤中Pb、Hg和Cr的殘留量超過中國土壤元素背景值,這說明AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤中重金屬元素的吸收具有差異性和很強(qiáng)的生物吸附潛力,導(dǎo)致菌根化的滇重樓根際土壤中Pb、Hg和Cr元素存在不同程度的累積和富集。
植物對重金屬的積累和忍耐是一個復(fù)雜過程,不同植物往往利用不同的適應(yīng)機(jī)制來積累或者排斥重金屬,進(jìn)而維持自身的生長發(fā)育[11],而外源接種AMF可以有效地減輕或避免中藥材中重金屬的殘留已是不爭的事實[1,9,10,22]。本研究發(fā)現(xiàn),外源接種AMF混合菌劑可以不同程度地促進(jìn)滇重樓須根內(nèi)重金屬殘留量的增加,因為須根可與AMF首先建立良好的共生關(guān)系,形成菌根真菌,致使根外菌絲增加了根部與根際土壤直接的接觸面積,加快了菌絲內(nèi)聚磷酸鹽與重金屬的結(jié)合形成“過濾機(jī)制”,促進(jìn)須根內(nèi)重金屬殘留量的增加[22]。本研究發(fā)現(xiàn),外源接種AMF可以顯著降低滇重樓新根莖和老根莖內(nèi)重金屬的殘留量,這與Zhang等[2]的研究結(jié)果相一致,根莖作為滇重樓的主要藥用部位,其重金屬主要來源于兩個方面,一是來自根部的轉(zhuǎn)移,二是根莖表面生長的部分須根所吸收的重金屬部分沉積在根莖表皮,但在人工栽培過程中,藥農(nóng)主要的采收目標(biāo)是主根,而導(dǎo)致大量的須根被遺留在土壤中;再者,新根莖和老根莖的整體代謝活動較慢,并且AMF可以直接通過螯合作用使重金屬積聚于真菌中,故使滇重樓老根莖和新根莖內(nèi)重金屬殘留量普遍低于對照。從滇重樓根部重金屬殘留量來看,滇重樓須根內(nèi)重金屬殘留量順序為As>Pb>Hg>Cu>Cr,滇重樓新根莖和老根莖內(nèi)重金屬殘留量順序為Cr>As>Pb>Cu>Hg,可見,同一植物不同器官對重金屬的吸收能力不同。參照《中國藥典》和《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,本研究中所有處理的老根莖內(nèi)As和Hg重金屬殘留量均不符合限量標(biāo)準(zhǔn),除T3期S5處理的老根莖Cr殘留量符合限量標(biāo)準(zhǔn)外,其余處理的Cr殘留量均不符合限量標(biāo)準(zhǔn),這可能與AMF種間差異以及菌種間協(xié)同作用有關(guān),不同菌種或不同混合菌劑對重金屬的敏感性不同,接種AMF促進(jìn)了滇重樓對某種重金屬的吸收,但無一致規(guī)律,具體原因有待進(jìn)一步深入研究。
重金屬富集系數(shù)是描述重金屬在生物體內(nèi)累積趨勢的重要指標(biāo),表明了重金屬在植物體內(nèi)的富集情況。野菊花對Cd的富集作用較強(qiáng),富集系數(shù)為2.72,故野菊花栽培過程中需要注意土壤及環(huán)境中Cd的殘留量,避免野菊花對Cd的過度富集導(dǎo)致藥材中Cd超標(biāo)[23]。本研究發(fā)現(xiàn),滇重樓對As和Hg的BCF均大于3.0,這說明滇重樓對As和Hg的富集作用較強(qiáng),人工栽培滇重樓過程中根際土壤易出現(xiàn)Hg和Cr累積和富集的情況,致使部分滇重樓根莖中Hg和Cr殘留量出現(xiàn)超標(biāo)情況,所以在滇重樓中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)基地建設(shè)中應(yīng)嚴(yán)格控制其栽培土壤性質(zhì),選擇合適的AMF菌株進(jìn)行混合,這為構(gòu)建高效優(yōu)質(zhì)的滇重樓種植體系提供了一條新的技術(shù)途徑。
綜上所述,近明球囊霉、沙荒球囊霉、透明盾巨孢囊霉、美麗盾巨孢囊霉、巨大巨孢囊霉和球狀巨孢囊霉6種單株AMF配制成的混合菌劑(S6)對滇重樓根際土壤、須根及根莖內(nèi)重金屬殘留量的調(diào)控效果最佳。而AMF對重金屬的吸附作用往往受諸多因素的影響(如宿主植物的種類、土壤肥力、土壤pH等),再者不同真菌在菌絲生長、侵染能力及磷運輸效率方面也存在差異,所以在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用AMF時要考慮到這些方面。