UPLC指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的吳茱萸與制吳茱萸成分變化研究

楊文惠，呂渭升，孫冬梅，羅文匯，楊 潔，何民友，潘禮業(yè)，李振雨*

1廣東一方制藥有限公司；2廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佛山 528244；3江西一方天江藥業(yè)有限公司，南昌 330000

吳茱萸，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實(shí)[1]。8～11月果實(shí)尚未開裂時(shí)，剪下果枝，曬干或低溫干燥，除去枝、葉、果梗等雜質(zhì)[1]。吳茱萸具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉的作用，臨床用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣，經(jīng)行腹痛，脘腹脹痛，嘔吐吞酸，五更泄瀉[1]?，F(xiàn)代研究表明，吳茱萸具有舒張血管、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、中樞保護(hù)、止吐止嘔等多種藥理作用[2-5]。吳茱萸與其甘草汁炮制品(以下簡稱“制吳茱萸”)的藥理作用有所不同，其原因可能與吳茱萸炮制前后化學(xué)成分的變化有關(guān)。吳茱萸經(jīng)甘草汁炮制后，能降低吳茱萸毒性，緩和燥性[6]。

吳茱萸中的化學(xué)成分眾多，藥理活性復(fù)雜。其主要的化學(xué)成分包括生物堿、苦味素、黃酮和揮發(fā)油等[7]。由于中藥中化學(xué)成分的多樣性及復(fù)雜性，單一成分定量的化學(xué)成分質(zhì)量控制模式不僅缺乏專屬性，而且難以反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量屬性。因此，需要準(zhǔn)確闡述吳茱萸及制吳茱萸中各類成分的變化，總結(jié)炮制前后藥效成分變化的規(guī)律，才能更全面地解釋其藥理活性與臨床作用的不同。近年來，新儀器、新技術(shù)的大量涌現(xiàn)，使得指紋圖譜以及化學(xué)模式識別成為中藥材質(zhì)量研究的主流，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法對中藥的整體質(zhì)量控制提供了一種新的思路[8,9]。

本研究采用超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)，建立吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜，結(jié)合相似度評價(jià)和多元統(tǒng)計(jì)分析方法聚類分析(CA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)進(jìn)行綜合評價(jià)，從多角度分析吳茱萸炮制前后的差異性成分，初步探討了吳茱萸與制吳茱萸藥理作用與化學(xué)成分的相關(guān)性，一定程度上闡釋了吳茱萸炮制前后藥理作用改變與化學(xué)成分變化之間的聯(lián)系，可以為吳茱萸的質(zhì)量及炮制研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(Waters H-Class，沃特世公司)；YMC Triart C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；萬分之一分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百萬分之一分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；百分之一天平(JJ600，常熟市雙杰測試儀器廠)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500D，昆山市超聲儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

1.2 材料

試劑：乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純)；甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純)；磷酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，色譜純)；乙腈(默克股份有限公司，色譜純)；水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

試藥：檸檬苦素(四川維克奇生物科技有限公司，批號：wkq16030802，含量98%)；吳茱萸堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110802-201710，含量99.6%)；吳茱萸次堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110801-201608，含量99.7%)；去氫吳茱萸堿(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號：17052721，含量98%)；金絲桃苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111521-201809，含量94.90%)；綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-202018，含量96.10%)；新綠原酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq19021413，含量99.90%)；隱綠原酸(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：15121701，含量98%)；咖啡酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110885-201703，含量99.70%)。

14批吳茱萸藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定均為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果實(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)，均符合2020年版《中國藥典》吳茱萸藥材項(xiàng)下的規(guī)定，藥材來源信息見表1(其中以S代表吳茱萸，ZS代表制吳茱萸)。

表1 14批吳茱萸來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 制吳茱萸飲片的炮制

取吳茱萸藥材，除去枝、葉、果梗等雜質(zhì)，即得吳茱萸飲片。參照2020版《中國藥典》“制吳茱萸”項(xiàng)下方法進(jìn)行炮制[1]：取6 g甘草搗碎，加適量水，煎湯，去渣，加入100 g吳茱萸飲片(即凈吳茱萸)，悶潤吸盡后，炒至微干，取出，干燥，即得14批制吳茱萸飲片(編號ZS1～ZS14，詳見表1)。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～9 min，8%A；9～18 min，8%→30%A；18～28 min，30%→80%A；28～33 min，80%→100%A)；流速為0.30 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

取甘草酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含50 μg甘草酸對照品溶液；取去氫吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含去氫吳茱萸堿50 μg、吳茱萸堿50 μg、吳茱萸次堿20 μg的混合對照品溶液Ⅰ；取金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL各含金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸30 μg的混合對照品溶液Ⅱ。

2.2.3 供試品溶液的制備

取吳茱萸或制吳茱萸樣品粉末(過三號篩)各約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下吳茱萸供試品溶液(編號S5)，按“2.2.1”項(xiàng)下確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定指紋圖譜，以去氫吳茱萸堿峰為參照峰S，計(jì)算各共有峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD值。結(jié)果顯示，各共有峰與S峰的相對保留時(shí)間RSD值均小于0.16%；相對峰面積RSD值均小于0.88%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的吳茱萸藥材粉末(編號S5)，按“2.2.3”項(xiàng)下確定的供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，以去氫吳茱萸堿峰為參照峰S，計(jì)算各共有峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD值。結(jié)果顯示，各共有峰與S峰的相對保留時(shí)間RSD值均小于0.48%；相對峰面積RSD值均小于1.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下吳茱萸供試品溶液(編號S5)，按“2.2.1”項(xiàng)下確定的色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，以去氫吳茱萸堿峰為參照峰S，計(jì)算各共有峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD值。結(jié)果顯示，各共有峰與S峰的相對保留時(shí)間RSD值均小于0.47%；相對峰面積RSD值均小于1.74%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜的建立

取14批吳茱萸和制吳茱萸樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄各樣品指紋圖譜的色譜圖。導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》，以編號為S1樣品的指紋圖譜為參照圖譜，進(jìn)行全峰匹配，14批吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜疊加圖見圖1、圖2，以平均數(shù)法生成吳茱萸及制吳茱萸對照指紋圖譜(見圖3)。去氫吳茱萸堿為吳茱萸的主要有效成分之一，色譜峰位置居中，且響應(yīng)較高，與相鄰的色譜峰分離效果較好，因此選擇去氫吳茱萸堿色譜峰為參照峰S，在吳茱萸指紋圖譜中標(biāo)識出27個(gè)共有指紋峰，制吳茱萸指紋圖譜標(biāo)識出28個(gè)共有峰，在保留時(shí)間23 min左右，制吳茱萸比吳茱萸多了28號色譜峰，如圖3所示。經(jīng)與對照品比對，28號色譜峰確定為甘草酸，為制吳茱萸炮制后產(chǎn)生。

圖1 14批吳茱萸指紋圖譜疊加圖

圖2 14批制吳茱萸指紋圖譜疊加圖

圖3 吳茱萸(R1)和制吳茱萸(R2)指紋圖譜共有模式圖

2.2.6 吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜色譜峰的指認(rèn)

取混合對照品溶液Ⅰ、Ⅱ及吳茱萸、制吳茱萸供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。經(jīng)與對照品保留時(shí)間及紫外吸收光譜比對，確定峰4為新綠原酸；峰9為綠原酸；峰10為隱綠原酸；峰11為咖啡酸；峰13為金絲桃苷；峰16為去氫吳茱萸堿；峰21為吳茱萸堿；峰22為吳茱萸次堿；峰28為甘草酸。

圖4 吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜色譜峰指認(rèn)

2.2.7 相似度評價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》計(jì)算14批吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜的相似度(見表2、表3)，結(jié)果顯示，14批吳茱萸的相似度在0.680～0.963范圍內(nèi)；14批制吳茱萸的相似度在0.724～0.962范圍內(nèi)，來自江西產(chǎn)區(qū)(編號S1、S2、S3、S9、ZS1、ZS2、ZS3、ZS9)的吳茱萸及制吳茱萸的相似度較低；來自湖南、廣西產(chǎn)區(qū)(編號S4～S8、S10、S11、S12、S14、ZS4～ZS8、ZS10、ZS11、ZS12、ZS14)的吳茱萸及制吳茱萸的相似度較高；說明江西產(chǎn)區(qū)的吳茱萸及制吳茱萸質(zhì)量與廣西、湖南兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的吳茱萸及制吳茱萸質(zhì)量存在一定差異。廣西、湖南兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的吳茱萸及制吳茱萸雖然也存在一定的差異，但與江西產(chǎn)區(qū)相比，差異較小。另外1批湖南產(chǎn)區(qū)(編號S13和ZS13)的吳茱萸和制吳茱萸相似度也較低，可能與藥材的采收時(shí)間、產(chǎn)地加工方式的差異有關(guān)。

表2 14批吳茱萸指紋圖譜相似度評價(jià)表

表3 14批制吳茱萸指紋圖譜相似度評價(jià)表

2.2.8 吳茱萸和制吳茱萸UPLC指紋圖譜的OPLS-DA分析

正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，其最大特點(diǎn)是能夠去除自變量X中與分類變量Y無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類信息主要集中在一個(gè)主成分中，從而讓模型變得簡單和易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。采用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)可以進(jìn)行有監(jiān)督的模式識別，顯示樣本間差異主要由哪些變量引起，尋找差異性標(biāo)志物[9]，已廣泛應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地、基原、炮制、真?zhèn)舞b別等方面[10]。

本研究運(yùn)用IBM SPSS Statistics 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件以27個(gè)共有峰及制吳茱萸新增的28號峰峰面積為變量對吳茱萸和制吳茱萸進(jìn)行OPLS-DA分析，通過OPLS-DA的Scores圖(見圖5)可知，吳茱萸和制吳茱萸明顯分為2類；所建立的模型中累積解釋能力參數(shù)R2X(cum)為0.995，累積解釋能力參數(shù)R2Y(cum)為0.996，預(yù)測能力參數(shù)Q2(cum)為0.967，這三個(gè)參數(shù)值均接近于1，表明該模型的擬合準(zhǔn)確性好，具有較強(qiáng)的解釋和預(yù)測能力；運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件修改假設(shè)檢驗(yàn)的次數(shù)為200次，結(jié)果見OPLS-DA的Permutation圖(見圖6)。由圖6可知，R2和Q2截距值分別為0.488和-1.61，所有R2和Q2的左邊的點(diǎn)都低于最右邊的點(diǎn)，說明建立的OPLS-DA模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，可以用于吳茱萸及制吳茱萸的模式識別。通過OPLS-DA的S-plot圖(見圖7)結(jié)合VIP圖(見圖8)可知，以VIP大于1為顯著影響，共找到6個(gè)差異標(biāo)志物，對其影響顯著性排序，分別為甘草酸>吳茱萸堿>峰3>峰1>綠原酸>峰2，提示這幾個(gè)化學(xué)成分對于區(qū)分吳茱萸和制吳茱萸的貢獻(xiàn)較大，表明這6個(gè)化學(xué)成分為吳茱萸與制吳茱萸的差異性成分。

圖5 OPLS-DA分析的Score圖

圖6 OPLS-DA分析的Permutation圖

圖7 OPLS-DA分析S-plot圖

圖8 OPLS-DA分析VIP圖

2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以平均峰面積為變量，對14批吳茱萸和制吳茱萸6個(gè)差異成分色譜峰的平均峰面積進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，繪制出t檢驗(yàn)圖(見圖9)，P<0.05，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果顯示，吳茱萸炮制后，峰21(吳茱萸堿)平均峰面積明顯降低，P<0.05，峰28(甘草酸)為新增成分，其余5個(gè)差異性化學(xué)成分的平均峰面積均有不同程度的降低，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖9 6個(gè)差異性成分平均峰面積t檢驗(yàn)圖

3 討論與結(jié)論

吳茱萸指紋圖譜的建立，一方面可以對不同產(chǎn)區(qū)的吳茱萸質(zhì)量進(jìn)行初步的評價(jià)，另一方面也能夠明顯區(qū)分出吳茱萸與制吳茱萸，吳茱萸指紋圖譜共標(biāo)識出27個(gè)共有色譜峰，制吳茱萸新增共有色譜峰28，為甘草酸，由制吳茱萸炮制后產(chǎn)生，利用此峰可以明顯區(qū)分吳茱萸生品和炮制品。相似度評價(jià)結(jié)果顯示，除4批江西產(chǎn)區(qū)的樣品外，其余產(chǎn)地吳茱萸指紋圖譜相似度較高。其中湖南產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)1批相似度異常，可能與采收時(shí)間、產(chǎn)地加工方式的不同有關(guān)。通過正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)找到6個(gè)差異標(biāo)志物，對其影響顯著性排序，分別為甘草酸>吳茱萸堿>峰3>峰1>綠原酸>峰2。

中醫(yī)理論認(rèn)為，中藥吳茱萸性熱苦寒，有散熱止痛、降逆止嘔之功，用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃脘疼痛等癥。而甘草性平，味甘，具有補(bǔ)脾益氣，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用。因此，吳茱萸經(jīng)甘草汁炙后，一定程度能降低毒性、緩和燥性，適用于脾胃虛弱者。吳茱萸經(jīng)甘草汁炮制后除增加甘草酸外，其余5個(gè)差異標(biāo)志物，平均峰面積均呈下降趨勢，有報(bào)道指出吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素對人胚腎細(xì)胞有一定的毒性作用[11]，因此，吳茱萸炮制后吳茱萸堿等化學(xué)成分含量的降低，是制吳茱萸炮制后毒性降低的原因之一。也有研究表明，吳茱萸不同組分均具有毒性，強(qiáng)度為揮發(fā)油>全組分>醇提組分>水提組分[12]，因此，制吳茱萸在炮制過程中，由于受熱，揮發(fā)油含量降低，使得其毒性減弱，同時(shí)，綠原酸等酚酸類成分因熱不穩(wěn)定，含量降低，也使吳茱萸藥效更加緩和。

本研究采用超高效液相色譜(UPLC)法建立吳茱萸與制吳茱萸指紋圖譜，該方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，初步探討了吳茱萸與制吳茱萸藥理作用與化學(xué)成分的相關(guān)性，一定程度上闡釋了吳茱萸炮制前后藥理作用改變與化學(xué)成分變化之間的聯(lián)系，可以為吳茱萸的質(zhì)量及炮制研究提供數(shù)據(jù)參考。