芪龍膠囊對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

梁會亮 李振 葉素艷 卞憲明 張震 唐文婕 李小菊 侯金才

我國缺血性心臟病發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為危害國民健康的重大疾病之一，給家庭和社會造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1-2]。當(dāng)前及時(shí)溶栓或經(jīng)皮冠脈介入術(shù)等方法進(jìn)行再灌注是挽救缺血心臟的必需步驟，但往往會導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌缺血再灌注損傷（myocardialischemia-reperfusion injury，MIRI）。心肌缺血再灌注損傷是指冠狀動(dòng)脈完全或者部分阻塞后，需要一定時(shí)間的血流恢復(fù)，導(dǎo)致心臟受到一定程度的損傷[3-5]。當(dāng)心肌細(xì)胞損傷時(shí)，血液中肌酸激酶（creatine kinase，CK）的活性增加，導(dǎo)致血清中CK活性增高，臨床上心肌損傷表現(xiàn)越嚴(yán)重。心肌梗死時(shí)，體液中通?？梢詸z測到大量的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH），因此測定血清中LDH的活性可以反映心肌損傷的程度[6-7]。由于中藥具有多靶點(diǎn)與多層次的優(yōu)勢，中醫(yī)藥在臨床治療心臟病方便效果顯著。其中芪龍膠囊是一種常用的中成藥，源于經(jīng)典方藥補(bǔ)陽還五湯。由補(bǔ)陽還五湯加一味丹參組成，共奏益氣活血與化瘀通絡(luò)的療效[8-9]。研究表明[2-4]，該藥可溶解血栓、改善受損腦細(xì)胞、改善血液流變學(xué)、加強(qiáng)側(cè)支循環(huán)，增強(qiáng)代償功能與迅速恢復(fù)偏癱肢體功能的作用。在臨床應(yīng)用中，該藥對冠心病有明顯的治療效果。芪龍膠囊對心肌缺血再灌注損傷的作用目前尚無報(bào)道，因此本研究考察了該藥對大鼠心肌缺血再灌注所致心肌梗死范圍及相關(guān)指標(biāo)血清LDH、CK的影響，通過心電圖判斷心肌缺血范圍與程度。采用定量組織學(xué)判定心肌梗死程度，并比較相關(guān)血液生化指標(biāo)的變化，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芪龍膠囊（0.2 g/粒，濟(jì)寧華能制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20000097）；鹽酸地爾硫卓片（30 mg/片，國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19983003）；復(fù)方丹參片[薄膜衣小片 每片重0.32 g（相當(dāng)于飲片0.6 g），上海雷允上藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z31020478]。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氯化鈉注射液（規(guī)格：10 mL∶90 mg，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H11021490）；肌酸激酶[規(guī)格：998-13301（4×38 mL），日本和光純藥工業(yè)株式會社，國食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2004第3401068號（更）]和乳酸脫氫酶[（規(guī)格：R1∶1×60 mL；R2∶1×21 mL）×4，日本和光純藥工業(yè)株式會社，國食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2007第2401084號]。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar種大鼠，150只，Ⅱ級，雄性，體質(zhì)量為240～260 g，6月齡，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

心電圖機(jī)（產(chǎn)地：中國上海，型號ECG-6511，上海光電醫(yī)通用電子儀器有限公司）；多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)（MPIAS-500，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)清平影像工程公司，產(chǎn)地中國徐州）；自動(dòng)生化分析儀（TechniconRA-1000，美國泰爾康儀器集團(tuán)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分9組：（1）正常對照（假手術(shù)）組：給予純水5 mL/kg；（2）模型對照組：給予純水5 mL/kg；（3）地爾硫卓組：給予地爾硫卓10 mg/kg；（4）復(fù)方丹參片組：給予復(fù)方丹參片250 mg/kg；（5）芪龍膠囊25 mg劑量組：給予芪龍膠囊25 mg/kg；（6）芪龍膠囊50 mg劑量組：給予芪龍膠囊50 mg/kg；（7）芪龍膠囊100 mg劑量組：給予芪龍膠囊100 mg/kg；（8）芪龍膠囊200 mg劑量組：給予芪龍膠囊200 mg/kg；（9）芪龍膠囊400 mg劑量組：給予芪龍膠囊400 mg/kg。

1.2.2 手術(shù)操作 受試藥以生理鹽水配制所需濃度，給藥體積為3 mL/kg，給藥途徑為十二指腸（心肌缺血后即刻給藥）。動(dòng)物以戊巴比妥鈉腹腔麻醉（45 mg/kg），仰位固定，胸部剃毛、常規(guī)消毒切開氣管，進(jìn)行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸；開胸，斷3～4肋，打開心包膜，暴露心臟，于冠狀動(dòng)脈左前降支根部穿線（在左心耳下緣3～4 mm處，0號縫合線），備結(jié)扎用，穩(wěn)定10 min后結(jié)扎，分離十二指腸，給入受試藥物后關(guān)腹，結(jié)扎5 min后以心電圖機(jī)監(jiān)測動(dòng)物Ⅱ?qū)?lián)心電圖，確定心肌缺血。40 min后剪斷結(jié)扎線，建立再灌注后進(jìn)行縫合胸壁，動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸。

再灌注120 min后結(jié)束試驗(yàn)，腹主動(dòng)脈取血，制備血清測定LDH、CK值；心臟結(jié)扎線以下橫切為5片，再進(jìn)行N-BT染色，利用多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)（MPIAS-500，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)清平影像工程公司）分析，通過固定象距測量總心肌面積及梗死心肌面積的方法，觀察心肌梗死程度；結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（t檢驗(yàn)）。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 心肌梗死范圍測定 再灌注120 min后，在心臟結(jié)扎線以下橫切5片，用N-BT染色，利用多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)（MPIAS-500，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)清平影像工程公司），測量總心肌面積及梗死心肌面積，觀察心肌梗死程度并進(jìn)行相關(guān)記錄。

1.3.2 血清CK及LDH活性測定 分別抽取各組中靜脈血，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清CK和LDH的活性并及進(jìn)行相關(guān)記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)行組間比較，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)（2組）或方差分析（3組及以上），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對心肌梗死程度的影響

試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，模型組梗死區(qū)占心臟百分比為25.199%；地爾硫卓及復(fù)方丹參片250 mg/kg組、芪龍膠囊100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg組心肌梗死程度明顯減輕，梗死面積縮小，同時(shí)梗死區(qū)百分占比下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。地爾硫卓組與芪龍膠囊各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組對心肌梗死程度的影響見表1，組間比較見表2，表3。

表2 芪龍膠囊各組與地爾硫卓組心肌梗死程度影響的組間對比

表3 芪龍膠囊各組與復(fù)方丹參片組心肌梗死程度影響的組間對比

2.2 對血清LDH、CK值的影響

試驗(yàn)觀察到，模型組血清LDH、CK升高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表5；與模型組比較，地爾硫卓組、復(fù)方丹參片組、芪龍膠囊100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg組明顯降低血清中LDH、CK活性，地爾硫卓組、復(fù)方丹參片組與芪龍膠囊各組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對血清LDH、CK活性的影響見表4，組間比較的t值見表5～表12。

表1 各組對心肌梗死程度的影響

表4 對血清LDH、CK活性的影響

表5 模型組與假手術(shù)組血清中LDH影響的組間對比（U/L， ±s）

表5 模型組與假手術(shù)組血清中LDH影響的組間對比（U/L， ±s）

注：#與模型組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表12 芪龍膠囊各組與復(fù)方丹參片組血清CK影響的組間對比

3 結(jié)論

心肌缺血再灌注損傷常見于冠狀動(dòng)脈搭橋和溶栓術(shù)后。急性心肌梗死的發(fā)生機(jī)制是冠狀動(dòng)脈發(fā)生阻塞性血栓，導(dǎo)致血液供應(yīng)急劇減少或中斷，引起持續(xù)性心肌缺血導(dǎo)致不可逆性壞死。研究證實(shí)，心肌缺血超過一定時(shí)間后引起心肌損傷的幾率增加，抑制心臟的功能。再灌注不僅不利于心臟功能的恢復(fù)，還會加重已有的心肌損傷，導(dǎo)致心肌梗死的發(fā)生或進(jìn)一步加重。同時(shí)，大量產(chǎn)生的氧自由基增加了心肌脂質(zhì)體，更容易損傷心肌細(xì)胞生物膜，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通透性增加，心肌酶逸出，導(dǎo)致血清LDH、CK值增高。反映出心肌細(xì)胞的受損程度[10-12]，CK主要分布在心肌、平滑肌與骨骼肌中，腦組織次之，胃腸道、肺與腎含量相對比較少。CK主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，是與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)行、ATP再生與肌肉收縮直接相關(guān)的重要激酶。肌酸激酶活性測定通常應(yīng)用于骨骼肌疾病和心肌疾病的診斷中。當(dāng)血液中CK含量增高時(shí)，代表心肌細(xì)胞受到損傷。

表6 模型組與假手術(shù)組血清中CK影響的組間對比添加（U/L， ±s）

表6 模型組與假手術(shù)組血清中CK影響的組間對比添加（U/L， ±s）

注：#與模型組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表7 模型組與其它各組血清LDH活性影響的組間對比

表8 模型組與其他各組血清CK活性影響的組間對比

表9 芪龍膠囊各組與地爾硫卓組血清LDH影響的組間對比

表10 芪龍膠囊各組與地爾硫卓組血清CK影響的組對比

表11 芪龍膠囊各組與復(fù)方丹參片組血清LDH影響的組間對比

試驗(yàn)中觀察到，模型組結(jié)扎15 min ST段明顯上移（少數(shù)下移），證實(shí)前降支結(jié)扎造成部分心肌缺血，缺血即刻給予藥物干預(yù)，再灌注120 min后，心肌受到相應(yīng)的損傷。試驗(yàn)顯示，模型組心肌缺血再灌注損傷，導(dǎo)致N-BT染色后心肌梗死斑塊顯著與產(chǎn)生心肌梗死。顯示了病理模型的特征。再灌注120 min后，抽取各組中靜脈血，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中CK、LDH的活性。在藥物干預(yù)中，地爾硫卓為鈣離子拮抗劑中非二氫吡啶類的代表藥物，有大量臨床研究發(fā)現(xiàn)地爾硫卓通過作用于冠狀動(dòng)脈血管及末梢血管的血管平滑肌及房室結(jié)，可抑制鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流，進(jìn)而顯示出血管擴(kuò)張作用和延長房室結(jié)傳導(dǎo)時(shí)間的作用[13]，通過擴(kuò)張心外膜和心內(nèi)膜下的冠狀動(dòng)脈和側(cè)支血管與增加血流量來改善心肌缺血，抑制冠狀動(dòng)脈痙攣的作用；復(fù)方丹參片是以丹參為君藥，佐以三七與冰片的復(fù)方制劑。其中，冰片可清熱散毒、開竅醒神，主治中風(fēng)痰厥驚癇；三七可活血定痛、化瘀止血，主治瘀血腫痛、血證，丹參可清心除煩、通經(jīng)止痛、祛瘀活血，主治胸痹心痛[14-17]?，F(xiàn)代藥理研究表明復(fù)方丹參片具有活血化瘀與理氣止血的功效。通常指令氣滯血瘀引起的胸痛，癥見胸悶，心前區(qū)刺痛，冠心病心絞痛等癥狀。芪龍膠囊采用現(xiàn)代生物技術(shù)與先進(jìn)中藥技術(shù)提取相結(jié)合，從地龍中分離提取出一組具有生物活性的蛋白水解酶，即蚓激酶，它可促進(jìn)前列環(huán)素的產(chǎn)生，抑制血小板磷酸酶A2的活性，使血液流變學(xué)指標(biāo)發(fā)生改變[18]。本試驗(yàn)以大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型觀察芪龍膠囊的療效，以地爾硫卓及復(fù)方丹參片組作為陽性對照藥。對比其對心肌梗死范圍的影響，及相關(guān)血清內(nèi)LDH、CK的變化。

機(jī)體血清中CK、LDH活性是心肌缺血損傷的一大標(biāo)志，試驗(yàn)觀察到，模型組血清LDH、CK活性升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；地爾硫卓及復(fù)方丹參片組、芪龍膠囊100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg組明顯降低血清中LDH、CK活力。地爾硫卓及復(fù)方丹參片組與芪龍膠囊各組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，芪龍膠囊能夠減輕再灌注心肌梗死程度，100、200、400 mg/kg組作用強(qiáng)度與地爾硫卓及復(fù)方丹參片相似，有效劑量范圍劑量在50～400 mg/kg，對心肌缺血再灌注所致心肌梗死有明確的保護(hù)作用。研究結(jié)果為芪龍膠囊后期增加治療氣虛血瘀證缺血性心腦血管疾病適應(yīng)征提供了重要的試驗(yàn)和理論基礎(chǔ)，同時(shí)此文的研究結(jié)果可為芪龍膠囊后期標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考。