HPLC測(cè)定蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的不確定度評(píng)定

豐杰

蘇黃止咳膠囊源于中日友好醫(yī)院中醫(yī)呼吸科主任醫(yī)師晁恩祥教授四十余年對(duì)呼吸疾病的臨床實(shí)踐積累和研究成果，晁教授認(rèn)為“咳嗽變異性哮喘”符合中醫(yī)“風(fēng)性善行數(shù)變”的特點(diǎn)，屬于“風(fēng)咳”的范疇，確定了疏風(fēng)宣肺、解痙止咳的主要治法。蘇黃止咳膠囊處方由麻黃、紫蘇葉、地龍、蟬蛻等9味中藥材組成，用于風(fēng)邪犯肺，肺氣失宣所致的咳嗽等。用于感冒后咳嗽和咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）的治療。處方中，麻黃和紫蘇葉為君藥，麻黃用于發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫；紫蘇葉用于解表散寒，行氣和胃。因此，檢測(cè)、評(píng)價(jià)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛的含量，對(duì)物質(zhì)用量與臨床療效研究，具有重要意義。參考《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》及相關(guān)技術(shù)規(guī)范[1-3]內(nèi)容，對(duì)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)。通過識(shí)別、計(jì)算紫蘇醛含量測(cè)定過程中的各不確定度影響因素，分析不確定度分量對(duì)紫蘇醛含量檢測(cè)結(jié)果的影響，為客觀評(píng)價(jià)紫蘇醛含量測(cè)定結(jié)果提供了分析數(shù)據(jù)。通過分析不確定分量的占比，針對(duì)性的采取預(yù)防或改進(jìn)措施，提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，減少檢測(cè)引入的不確定度值[4-6]。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

高效液相色譜儀（廠家：安捷倫，產(chǎn)地：美國(guó)，型號(hào)Agilent 1100），梅特勒-托利多XS205電子天平，上海能信SB3200T超聲波清洗儀，超純水儀；紫蘇醛對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111806-201303，純度為95.1%）。蘇黃止咳膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20103075，規(guī)格：0.45 g，由生產(chǎn)廠家揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司提供。色譜純甲醇，超純水，其它試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 實(shí)驗(yàn)色譜條件

島津色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（68∶32）；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 制備對(duì)照品溶液 精密稱量紫蘇醛對(duì)照品149.1 mg，置于50 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解、搖勻，稀釋定容至50 mL， 配成2.836 g/L的紫蘇醛對(duì)照品溶液。精密量取此對(duì)照品溶液 1 mL置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解、搖勻、稀釋至刻度，得56. 72 mg/L的紫蘇醛對(duì)照品溶液。

2.2.2 制備供試品溶液 精密稱定蘇黃止咳膠囊內(nèi)容物5 g，放入內(nèi)有數(shù)粒玻璃珠的圓底磨口燒瓶?jī)?nèi)（500 mL），加入150 mL蒸餾水后，安裝揮發(fā)油提取器，并從提取器上端加水至溢流入燒瓶為止，再加入乙酸乙酯1.0 mL，連接回流冷凝器，加熱至沸，并保持微沸4 h。待圓底燒瓶及揮發(fā)油提取器放冷至室溫后，取乙酸乙酯層，加入色譜甲醇定容至5 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 評(píng)定不確定度

按照測(cè)量不確定度評(píng)定的步驟，從測(cè)量操作的人員、測(cè)量所使用的儀器/器皿、測(cè)量使用的方法、測(cè)量所處的環(huán)境等方面全面考慮，分析紫蘇醛含量測(cè)定過程的不確定度來源[7-9]。

3.1 建立測(cè)量模型

供試品中紫蘇醛含量的計(jì)算公式是[10-11]：

上式中，X為紫蘇醛的含量（mg/g）；C對(duì)是紫蘇醛對(duì)照品溶液的濃度（mg/L）；A供為供試品溶液中紫蘇醛的色譜峰峰面積；V供為供試品溶液的體積（mL）；m供是蘇黃止咳膠囊稱樣量（g）；A對(duì)是對(duì)照品溶液中紫蘇醛的色譜峰峰面積。其中，m對(duì)為紫蘇醛對(duì)照品稱樣量（mg）；V50、V1為紫蘇醛對(duì)照品配置所需溶劑的體積（mL）。

3.2 評(píng)定分析不確定度分量

3.2.1 紫蘇醛對(duì)照品溶液引入的不確定度 紫蘇醛對(duì)照品溶液引入的不確定度來自紫蘇醛溶液的配置和檢測(cè)。紫蘇醛溶液配置的不確定度，來自紫蘇醛質(zhì)量引入的不確定度、稀釋溶解過程引入的不確定度。而紫蘇醛質(zhì)量的不確定度來源于其純度和稱樣量[12-14]。

3.2.1.1 紫蘇醛純度引入的不確定度 紫蘇醛對(duì)照品純度為95.1 %，使用說明書無不確定度信息，故不考慮純度引入的不確定度，即紫蘇醛純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（P對(duì)）=0。

3.2.1.2 紫蘇醛稱重引入的不確定度 天平重復(fù)稱重引入的不確定度：稱量紫蘇醛的電子天平，其檢定證書提供重復(fù)性誤差為±0.05 mg，按均勻分布計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

天平的示值允許誤差引入的不確定度：稱量紫蘇醛的電子天平的最大允差為±0.1 mg（d=0.01 mg），按均勻分布計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

由于紫蘇醛采用減重法稱量，即兩次稱量值之差，每次稱量均受隨機(jī)影響和天平校準(zhǔn)的影響。故減重稱量過程引入的不確定度：

因而對(duì)照品紫蘇醛稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別是：

3.2.1.3 紫蘇醛溶液配制引入的不確定度 紫蘇醛溶液配置過程中引入的不確定度，主要從配置容器校準(zhǔn)引入，以及溶液配置時(shí)、配置容器和溶液的溫度與配置容器體積校準(zhǔn)時(shí)的溫度差異引入[15-16]。該配置過程涉及容器主要由移液管、容量瓶。

其中，配置容器校準(zhǔn)引入的不確定度：紫蘇醛溶液配制過程中，使用了1 mL定量移液管、5 mL容量瓶、50 mL容量瓶，其校準(zhǔn)證書中允許誤差分別為±0.007 mL、±0.015 mL與±0.1 mL。按三角分布計(jì)算，以上玻璃儀器校準(zhǔn)的相對(duì)不確定度則分別是：

紫蘇醛溶液配置時(shí)，配置容器和溶液的溫度與配置容器體積校準(zhǔn)時(shí)的溫度存在差異引入的不確定度：紫蘇醛溶液和配置容器的溫度為25℃，與配置容器校正時(shí)的溫度（20 ℃）有 ±5 ℃的溫差，水的膨脹系數(shù)是2.1×10-4mL/℃，按矩形分布計(jì)算，配置溫差導(dǎo)致的相對(duì)不確定度是：

因而，制備對(duì)照品溶液不同稀釋體積引起的相對(duì)不確定度是：

故制備對(duì)照品溶液引入的相對(duì)不確定度是：

制備供試品溶液而引起的相對(duì)不確定度是：

3.2.1.4 紫蘇醛色譜峰檢測(cè)引入的不確定度 紫蘇醛色譜峰檢測(cè)引入的不確定度，主要由紫蘇醛溶液重復(fù)進(jìn)樣引起的，對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針重復(fù)測(cè)量的峰面積分別是：974.4、969.9、967.7、964.7、962.7、963.7，平 均 值 為967.18，其峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按照貝塞爾公式計(jì)算，得：

那么，由紫蘇醛溶液色譜峰檢測(cè)（峰面積）引入的相對(duì)不確定度是：

綜上，紫蘇醛溶液引入的相對(duì)不確定度是：

3.2.2 供試品溶液含量測(cè)定的不確定度評(píng)估 與3.2.1項(xiàng)相同，供試品溶液中紫蘇醛含量測(cè)定的不確定度，來自于供試品的溶液濃度和色譜峰檢測(cè)等。供試品的溶液濃度引入的不確定度，主要是蘇黃止咳膠囊稱重和配制過程稀釋體積引入的不確定度。供試品溶液色譜檢測(cè)引入的不確定度來自于儀器。

3.2.2.1 蘇黃止咳膠囊稱重引入的不確定度 天平重復(fù)稱重引入的不確定度：稱量供試品的電子天平（d=0.1 mg），校準(zhǔn)證書顯示重復(fù)性誤差是±0.1 mg，按均勻分布計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同時(shí)，天平的最大允差為±1.0 mg（d=0.1 mg），按均勻分布計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

根據(jù)實(shí)際稱量過程，還應(yīng)該考慮減重法稱量過程引入的不確定度，一次稱量所引入的不確定度為：

由于試驗(yàn)平行稱取兩份供試品，重量分別為5.048 6 g、5.104 3 g，每份供試品稱重的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

故，供試品稱重引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

3.2.2.2 供試品配制過程稀釋體積引起的相對(duì)不確定度 供試品溶液制備引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，即：

3.2.2.3 供試品的色譜峰峰面積引起的相對(duì)不確定度 供試品的色譜峰峰面積是采取雙樣平行法測(cè)定的，其中，供試品溶液1的色譜峰峰面積是934，930.6，平均峰面積為932.3，兩者差值R1=3.4；供試品溶液2的色譜峰峰面積是973.2，968.2，平均峰面積為970.7，差值R2=5。按照極差法計(jì)算，n=2時(shí)，極差系數(shù)C=1.13。故：

則蘇黃止咳膠囊溶液的峰面積引入的相對(duì)不確定度為：

綜上，蘇黃止咳膠囊供試品溶液相對(duì)不確定度：

3.3 計(jì)算合成不確定度

檢測(cè)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量結(jié)果的合成不確定度是：

3.4 計(jì)算擴(kuò)展不確定度

檢測(cè)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的結(jié)果符合正態(tài)分布，置信概率為95%，包含因子k為2，本實(shí)驗(yàn)的相對(duì)擴(kuò)展不確定度是：

3.5 報(bào)告測(cè)量不確定度

檢測(cè)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的結(jié)果，表示為X=（16.6±0.188）μg/g。在含量測(cè)定過程中，各類來源的不確定度對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)具體如表1所示。數(shù)據(jù)顯示，供試品的稱樣量、供試品中紫蘇醛的峰面積是導(dǎo)致蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量測(cè)定分析中不確定度的最大影響因素。

表1 不確定度分量來源及占比

4 分析與討論

通過對(duì)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量進(jìn)行不確定度分析評(píng)價(jià)，計(jì)算出檢測(cè)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度是0.188 μg/g，紫蘇醛的含量結(jié)果是（16.6±0.188）μg/g。不確定度評(píng)價(jià)結(jié)果提示，峰面積、稀釋體積對(duì)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量測(cè)定的不確定度的影響相對(duì)較大，特別是供試品中紫蘇醛的峰面積、對(duì)照品的配制稀釋倍數(shù)，是檢測(cè)蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的分析過程中最大的影響因素。對(duì)于供試品檢測(cè)引入的不確定度，可以對(duì)高效液相進(jìn)行定期計(jì)量及期間核查，日常開展維護(hù)保養(yǎng)，提高儀器檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，減少測(cè)量設(shè)備引入的不確定度。同時(shí)，適當(dāng)增大供試品的稱樣量及進(jìn)樣體積，增加供試品峰面積，減少樣品本身可能引入的不確定度。針對(duì)對(duì)照品稀釋倍數(shù)引入的不確定度分量，適當(dāng)減少對(duì)照品的稱樣量及減少稀釋步驟，減少不確定度引入的比重。

此次評(píng)定可用于蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量評(píng)價(jià)。在日常檢驗(yàn)中，明確操作細(xì)節(jié)和日常的管理要求，盡可能減少隨機(jī)效應(yīng)引入的測(cè)量不確定度[17-19]。此外，在實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的測(cè)量能力也是通過測(cè)量范圍及在該測(cè)量范圍內(nèi)相應(yīng)的測(cè)量不確定度表述的，也就是說測(cè)量不確定度評(píng)定在藥物分析中有著重要作用。