hBD-3在OPMD及OSCC中的表達(dá)研究

么建強(qiáng)

口腔潛在惡性病變（oral cavity potential malignant disorder，OPMD）是指發(fā)生在口腔黏膜內(nèi)，且具有一定癌變可能疾病的總稱，其分類主要包括：口腔白斑、尼古丁口炎、口腔扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維化等[1]。據(jù)世衛(wèi)組織于2020年發(fā)布的一項(xiàng)調(diào)查稱[2]，在患有口腔潛在惡性病變的患者中，約有8%～20%的口腔潛在惡性病變會轉(zhuǎn)化為口腔癌，而在口腔癌眾多的類型中，又尤以口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）的發(fā)生最為多見，約占口腔癌總數(shù)的90%以上。有相關(guān)報(bào)道指出[3]，在口腔癌發(fā)生后，大部分患者在5年內(nèi)的存活率僅為40%，究其原因，認(rèn)為患者是否進(jìn)行了早期診斷和是否及時(shí)進(jìn)行了早期干預(yù)是影響其患病后生存率的重要因素，但到目前為止，尚未有研究能夠明確闡明口腔潛在惡性病變發(fā)生癌變的機(jī)制。而β-防御素-3（human β-defensin-3，hBD-3）作為人體先天免疫系統(tǒng)的重要蛋白，其可通過自身具備的多種生物活性，在人體的炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤細(xì)胞的形成與轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[4]。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)[5]，β-防御素-3可通過誘導(dǎo)通路激活的方式來加速子宮頸癌細(xì)胞的生長，但對于hBD-3是否參與了OPMD進(jìn)程，以及其是否會對OSCC發(fā)揮作用尚未可知，故在本次研究中，主要觀察hBD-3在OPMD及OSCC中的表達(dá)水平，以為OSCC的早期臨床診斷與治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于2018年1月—2020年12月在黑龍江省醫(yī)院口腔科就診的患者100例，其中確診為OPMD的患者40例、確診為OSCC的患者40例、口腔黏膜正常的患者20例，并依據(jù)其口腔黏膜的狀態(tài)將這3組患者分別命名為OPMD組、OSCC組和正常組，并收集以上這100位患者的一般資料，其中OPMD組男性患者22例，女性患者18例，平均（43.9±6.8）歲；OSCC組男性患者23例，女性患者17例，年齡（46.7±7.4）歲；正常組男性患者12例，女性患者8例，年齡（45.2±6.1）歲，后對這三組患者的年齡、性別等一般資料進(jìn)行比較，結(jié)果顯示這三組患者其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；并確認(rèn)三組患者在參與本次研究前均未進(jìn)行過化療、放療、藥物、激光等治療，且三組患者均無伴發(fā)其他黏膜疾病或其他系統(tǒng)疾病，將無伴發(fā)其他黏膜疾病或其他系統(tǒng)疾病且能配合研究者納入實(shí)驗(yàn)，將伴有其他黏膜疾病且患有嚴(yán)重心腦血管系統(tǒng)疾病的患者排除實(shí)驗(yàn)。參與研究的三組患者均已簽署知情同意書，且本次研究已獲得黑龍江省醫(yī)院倫理委員會的審查與批準(zhǔn)。

1.2 方法

對三組患者的口腔黏膜進(jìn)行采樣，生理鹽水沖洗后將樣本一分為二，一份放入-4℃冰箱保存用于免疫組化；另一份放入-80℃冰箱保存用于熒光定量PCR檢測。試劑主要有：兔抗人β-防御素-3克隆抗體（型號：TA8900117，NOVUS公司，美國）、免疫組化Max Vision? 試劑盒（型號：KB20-5902，萬生生物技術(shù)有限公司，北京）、總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司，美國）、GAPDH及hBD-3引物合成（生工生物技術(shù)有限公司，上海），內(nèi)參GAPDH及hBD-3的引物序列見表1。

表1 GAPDH及hBD-3的引物序列

免疫組化：樣本石蠟包埋后，脫蠟水化，制成5μm 厚的切片，并放入濃度為3%的過氧化氫甲醇溶液內(nèi)孵育10 min，經(jīng)檸檬酸鈉高壓修復(fù)后，置于山羊血清內(nèi)封閉10 min，再滴加濃度比例為（1∶400）的β-防御素-3一抗試劑，放入4℃冰箱內(nèi)24 h，取出后，二抗孵育10 min，行DAB顯色處理，經(jīng)復(fù)染、脫水、封片處理后，用PBS代替β-防御素-3一抗作為空白對照，于高倍鏡下（10×400）進(jìn)行觀察、拍照。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將樣本從-80℃冰箱取出后，稱重研磨，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，應(yīng)用Trizol法對樣本的總RNA進(jìn)行提取，并對RNA的濃度與純度進(jìn)行檢測，后進(jìn)行基因逆轉(zhuǎn)錄處理，合成cDNA，并以GAPDH為內(nèi)參，按說明書進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，95℃ 45 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s、60℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s、60℃ 3 600s，1個(gè)循環(huán)，最后，各樣本3個(gè)復(fù)孔取其平均值，應(yīng)用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 觀察指標(biāo)

分別觀察hBD-3在三組樣本中的表達(dá)強(qiáng)度。按相關(guān)參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行評分，即樣本免疫組化得分為樣本陽性細(xì)胞比例與樣本染色強(qiáng)度之和。若免疫組化得分為0～1分，則將表達(dá)強(qiáng)度記為陰性（-）；若得分為2～3分，則將表達(dá)強(qiáng)度記為弱陽性（+）；若得分為4～5分，則將表達(dá)強(qiáng)度記為陽性（++）；若得分為6～7分，則將表達(dá)強(qiáng)度記為強(qiáng)陽性（+++）。

其中，根據(jù)《臨床病理學(xué)》的《陽性細(xì)胞比例記分標(biāo)準(zhǔn)》[7]判定當(dāng)陽性比例＜5%時(shí)，則記作0分；當(dāng)陽性比例在5%-24%時(shí)，則記作1分；當(dāng)陽性比例在25%～49%時(shí)，則記作2分；當(dāng)陽性比例在50%～75%時(shí)，則記作3分；當(dāng)陽性比例在＞75%時(shí)，則記作4分。而樣本的染色強(qiáng)度則根據(jù)染色的無、弱、中、強(qiáng)，分別記為0、1、2、3、4分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行TukeyHSD法，計(jì)量資料分析應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hBD-3蛋白表達(dá)

hBD-3在口腔黏膜細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)，經(jīng)染色處理可見其呈黃色或棕黃色。在三組樣本中，正常組的hBD-3細(xì)胞主要分布在基底細(xì)胞層或棘層，并于胞漿中有少量表達(dá)；而相比于正常組，OPMD組中的hBD-3細(xì)胞其染色范圍則更加廣泛，陽性細(xì)胞除分布于基底細(xì)胞層或棘層外，在顆粒層也可發(fā)現(xiàn)，且其染色強(qiáng)度更深，除在細(xì)胞漿內(nèi)，其在細(xì)胞膜及細(xì)胞核內(nèi)也均有表達(dá)；最后在OSCC組中，hBD-3細(xì)胞其染色強(qiáng)度也多于前兩組，且其高表達(dá)的范圍也主要集中在癌變的區(qū)域，并尤以細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，hBD-3在正常組、OPMD組和OSCC組中的陽性表達(dá)率分別為50.0%（10/20）、82.5%（33/40）、90.0%（36/40）；且OSCC組和OPMD組hBD-3的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），OSCC組的hBD-3表達(dá)強(qiáng)度也高于OPMD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 hBD-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較

2.2 hBD-3基因相對表達(dá)量

對三組患者的hBD-3 mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中正常組的相對表達(dá)量為1.24±0.49；OPMD組的相對表達(dá)量為2.18±0.54；OSCC組的相對表達(dá)量為6.92±0.75。結(jié)果顯示，OSCC組和OPMD組的hBD-3 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.95，P=0.007），OSCC組的hBD-3 mRNA表達(dá)水平也高于OPMD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.74，P=0.019）。

3 討論

OSCC作為人體頭頸部最常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病快、預(yù)后差等特點(diǎn)，目前公認(rèn)的能夠提高OSCC患者生存率的方法只有早發(fā)現(xiàn)、早治療[8]。而口腔內(nèi)上皮組織的異常增生正是OPMD轉(zhuǎn)化為OSCC的危險(xiǎn)因素，因此，若能夠?qū)ふ业皆缙谔崾綩PMD具有癌變風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)記物，這不僅可以大大降低OPMD的癌變風(fēng)險(xiǎn)，還可以有效提高OSCC患者的后期生存率[9]。

hBD-3作為參與人體免疫防御的重要蛋白，位于人體的第8號染色體P22-23節(jié)段內(nèi)，首發(fā)于銀屑病患者的皮損中，在正常情況下，呈低表達(dá)狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)或感染時(shí)，其表達(dá)程度往往顯著上升，從而激活免疫細(xì)胞，殺滅病原微生物，以發(fā)揮其防御作用。且也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明[10-11]，hBD-3確實(shí)具有雙向免疫調(diào)節(jié)的作用，低強(qiáng)度時(shí)，可抑制炎癥相關(guān)因子的釋放，高強(qiáng)度時(shí)，則促進(jìn)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，并能夠加速成纖維細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤相關(guān)肥大細(xì)胞的活化與脫敏，以此來擾亂口腔黏膜上皮組織的膠原代謝，從而促進(jìn)OPMD的形成?，F(xiàn)階段，已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7，12]，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、陰道癌等多種惡性腫瘤組織中，均可發(fā)現(xiàn)hBD-3呈高表達(dá)狀態(tài)，這說明，hBD-3表達(dá)水平的變化不僅會對腫瘤細(xì)胞的侵襲和凋亡產(chǎn)生影響，其還會影響到腫瘤細(xì)胞的生長與發(fā)展。另也有學(xué)者提出，過度表達(dá)的hBD-3蛋白能夠通過與趨化因子受體相結(jié)合的方式來募集腫瘤相關(guān)炎性因子至黏膜下，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和促腫瘤因子的釋放，以創(chuàng)造炎癥微環(huán)境，使得腫瘤相關(guān)細(xì)胞異常增多，進(jìn)而激活腫瘤相關(guān)NF-KB、PI3K/AKT、ERK1/2等信號通路，最終導(dǎo)致腫瘤的增值與發(fā)展[13-14]。但截止到現(xiàn)在，仍未能從分子層面發(fā)現(xiàn)hBD-3發(fā)揮其促癌作用的機(jī)制。目前，有關(guān)于hBD-3在口腔黏膜內(nèi)的癌變研究較少，Chu HW等[15]通過對100例口腔黏膜正常者和100例OSCC患者口腔內(nèi)的hBD-3蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在OSCC患者中，其口腔黏膜內(nèi)的hBD-3蛋白水平明顯高于口腔黏膜正常者，且對hBD-3 mRNA的檢測也得出了相同結(jié)果，這也從側(cè)面證實(shí)了過表達(dá)的hBD-3蛋白其作用幾乎等同于原癌基因，能夠加速誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌株的活化與增殖。在本次研究中，采用免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR這兩種檢測方法來對hBD-3在OPMD和OSCC中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析探討，結(jié)果顯示，OPMD組和OSCC組的蛋白表達(dá)水平和基因表達(dá)水平均明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示hBD-3可能參與了OPMD與OSCC的發(fā)生。且隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的深入，也有越來越多的證據(jù)表明炎癥反應(yīng)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而炎性相關(guān)特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，則更利于識別出早期的癌前病變，以為疾病的發(fā)展與預(yù)后提供可借鑒依據(jù)。

綜上所述，hBD-3作為重要的炎癥相關(guān)因子，其已被認(rèn)定為潛在口腔癌的特異性標(biāo)志物，且在本次實(shí)驗(yàn)中，以hBD-3作為研究指標(biāo)，探究其在OPMD及OSCC中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)hBD-3在口腔黏膜的早期其變過程中表達(dá)水平會升高，提示hBD-3可能參與了OPMD與OSCC的發(fā)生發(fā)展，相信這一發(fā)現(xiàn)將會為OPMD的早期癌變檢測及OSCC的臨床治療提供新的方向。