羅漢果皂苷Ⅴ通過(guò)PI3K/Akt通路抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞氧化損傷

韓夢(mèng)潔，王 娟，劉國(guó)翔，李 婷，周璐煒，陳 旭

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541100)

羅漢果廣泛分布于廣西桂林永?？h、臨桂縣[1]，作為一種常用的藥食兩用的植物，羅漢果具有降血糖、抗炎抑菌、抗氧化等作用[2]。羅漢果主要含有由三萜皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)等物質(zhì)[3]，其中羅漢果皂苷V(mogroside V，MV)是其主要的活性成分[4]，MV是一種三萜類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、止咳潤(rùn)肺、降血糖等作用[5]。糖尿病是一種以血糖水平升高為表現(xiàn)的慢性疾病，與內(nèi)分泌代謝紊亂有關(guān)。糖尿病已經(jīng)成為發(fā)生率僅次于心血管疾病和腫瘤的疾病，預(yù)計(jì)到2040年，會(huì)有超過(guò)6億人遭受糖尿病的侵害[6]。尋找天然的降糖藥物，加強(qiáng)對(duì)糖尿病的防治，減輕其并發(fā)癥一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。胰島β細(xì)胞是一種內(nèi)分泌細(xì)胞，能貯存和分泌胰島素從而維持體內(nèi)血糖的穩(wěn)態(tài)[7]。在氧化應(yīng)激條件下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)會(huì)對(duì)胰島β細(xì)胞造成損傷，引起凋亡，從而導(dǎo)致功能障礙，最終引發(fā)高血糖。研究表明MV具有抗氧化活性，對(duì)氧化應(yīng)激環(huán)境有拮抗作用，從而降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率[2]。但是，其是否能降低胰島β細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而發(fā)揮保護(hù)胰島細(xì)胞的作用仍不清楚。PI3K/Akt是細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、增殖等的重要信號(hào)通路[8]，與藤茶總黃酮抑制肝癌的作用有關(guān)[9]，且其參與了ROS的氧化應(yīng)激。本研究通過(guò)采用過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)構(gòu)建小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞氧化損傷模型，探討MV對(duì)MIN6細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制是否與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞為桂林醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2藥物 含量為95.78%的MV(批號(hào)：PS000637)購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司。

1.1.3主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)CLACK公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自北京索萊寶公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；RIPA強(qiáng)裂解液購(gòu)自上海Beyotime公司；BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海Beyotime；β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bcl-2、PCNA、Akt等單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；p-Akt單克隆抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；MK2206購(gòu)自于美國(guó)MedChemExpress公司；鼠二抗及兔二抗均購(gòu)自上海Abmart公司；Western一抗稀釋液購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自美國(guó)Pall公司；H2O2購(gòu)自西隴化工廠；ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自合肥Biosharp公司。

1.1.4儀器 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司(BD C6 plus)；Galaxy 170S型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；A2-4S1級(jí)2型生物安全柜購(gòu)自新加坡ESCO公司；Infinite M200Pro型酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN公司；蛋白電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀電源購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；TDZ4-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1藥物的配制 (1)MV為白色粉末，用PBS配制成濃度為100 g·L-1的母液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。(2)將30%H2O2(10 mol·L-1)加PBS配置成60 mmol·L-1的母液，現(xiàn)用現(xiàn)配，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將MIN6細(xì)胞復(fù)蘇后，5 mL培養(yǎng)基混勻后，放入7 cm培養(yǎng)皿中，搖勻，放置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代。

1.2.3MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MIN6細(xì)胞，胰酶消化后，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)量細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度。調(diào)整細(xì)胞密度為4×103個(gè)/孔接種于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過(guò)夜貼壁后，設(shè)置空白對(duì)照組(Control，Ctrl)、H2O2組(500 μmol·L-1)、MV組(100 mg·L-1)以及MV保護(hù)組(MV預(yù)處理1 h后加入H2O2)，空白對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，每組濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物處理后，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，用槍吹打使結(jié)晶溶解，混勻。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(OD)。

1.2.4流式細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MIN6細(xì)胞種于7 cm培養(yǎng)皿中，貼壁后，按照“1.2.3”中分組方式加入相應(yīng)濃度的藥物。作用24 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，離心后加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞后再次離心。棄上清，加入200 μL Binding buffer，5 μL FITC和5 μL PI，室溫避光孵育30 min。加入200 μL Binding buffer，300目篩網(wǎng)過(guò)濾后，BD C6 Plus 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.52′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)ROS 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MIN6細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，種于6孔板中。貼壁后，加入藥物處理24 h。藥物處理完畢，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌，用0.25%胰酶消化后加入600 μL培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，用PBS洗滌。加入500 μL ROS探針DCFH-DA(2 μmol·L-1)后，37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，加入300 μL PBS懸浮細(xì)胞，300目篩網(wǎng)過(guò)濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.6Bcl-2、PCNA蛋白水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MIN6細(xì)胞種于10 cm培養(yǎng)皿中，貼壁后，加入相應(yīng)濃度藥物處理。處理結(jié)束后，將細(xì)胞收集于1.5 mL EP管中，根據(jù)細(xì)胞沉淀量加入適量的RIPA強(qiáng)裂解液，用1 mL的移液器將細(xì)胞沉淀吹散，放置于冰上30 min，使得細(xì)胞沉淀得以充分裂解。12 000 r·min-1離心30 min，將上清移至預(yù)冷的1.5 mL EP管中。BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度以及所需體積，并加入5×SDS、ddH2O使上樣體積為20 μL。根據(jù)蛋白分子量配制相應(yīng)濃度的分離膠，SDS-PAGE電泳分離120 min，轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別加入相應(yīng)的一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，室溫孵育對(duì)應(yīng)的二抗，再洗膜4次。ECL發(fā)光及進(jìn)行灰度值計(jì)算分析。

2 結(jié)果

2.1 MV抑制了H2O2誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞的損傷作用我們使用25～1 600 mg·L-1的MV處理MIN6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)100 mg·L-1以?xún)?nèi)的MV處理MIN6細(xì)胞與對(duì)照組之間的細(xì)胞活力值無(wú)差異(P>0.05)，結(jié)果表明100 mg·L-1以下的MV對(duì)MIN6細(xì)胞幾乎無(wú)毒性(Fig 1A)。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞膜邊緣清晰可見(jiàn)，H2O2單獨(dú)處理的細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞皺縮變圓、變亮，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。結(jié)果提示，H2O2抑制了MIN6細(xì)胞增殖并極可能誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。MV預(yù)處理組與H2O2單獨(dú)處理組相比，MV預(yù)處理組細(xì)胞密度有所增加，細(xì)胞碎片減少(Fig 1B和C)，說(shuō)明MV對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

Fig 1 The protective effect of mogroside Ⅴ

2.2 MV對(duì)H2O2誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的影響流式結(jié)果表明，H2O2作用于MIN6細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率達(dá)到了21.2%。MV預(yù)處理后，能減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡至15%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，MV可以部分抵抗H2O2的氧化應(yīng)激，從而保護(hù)MIN6細(xì)胞，減輕其氧化損傷，減少M(fèi)IN6細(xì)胞的凋亡(Fig 2)。

Fig 2 Effect of mogroside Ⅴ on apoptosis of MIN6

2.3 MV對(duì)MIN6細(xì)胞ROS釋放的影響流式結(jié)果顯示，H2O2作用于MIN6細(xì)胞后，ROS的釋放增加，因此導(dǎo)致了MIN6細(xì)胞的死亡。MV預(yù)處理MIN6細(xì)胞后，能顯著減少H2O2誘導(dǎo)的ROS(P<0.05)(Fig 3)，這可能與其具有抗氧化的藥理活性有關(guān)。MIN6細(xì)胞ROS水平下調(diào)，細(xì)胞氧化損傷降低，細(xì)胞凋亡減少。

Fig 3 Effect of mogroside Ⅴ on reactive oxygenspecies (ROS) in MIN6

2.4 MV對(duì)MIN6細(xì)胞Bcl-2、PCNA、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響我們進(jìn)一步通過(guò)Western blot分析增殖以及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、PCNA和Akt的表達(dá)。結(jié)果顯示，H2O2使MIN6細(xì)胞中PCNA、Bcl-2以及p-Akt蛋白的表達(dá)降低，這可能是H2O2處理后導(dǎo)致細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡的原因。MV預(yù)處理后，能減輕H2O2對(duì)MIN6細(xì)胞內(nèi)PCNA以及Bcl-2表達(dá)的抑制及Akt的活性下降，進(jìn)而提高了MIN6細(xì)胞活性及抑制其凋亡(Fig 4)。

Fig 4 Effect of mogroside Ⅴ on protein volume expression of MIN6

2.5 MV減輕Akt抑制劑對(duì)MIN6細(xì)胞的氧化損傷為進(jìn)一步驗(yàn)證Akt在MV對(duì)MIN6細(xì)胞中的作用，我們使用Akt抑制劑MK2206處理MIN6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MK2206能引起MIN6細(xì)胞凋亡，而且MV也可以部分逆轉(zhuǎn)其對(duì)MIN6細(xì)胞的損傷(Fig 5A)(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MK2206也可以使細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加(Fig 5B)(P<0.01)，這與H2O2導(dǎo)致MIN6細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的結(jié)果一致。此外，蛋白水平分析顯示，MV也可以上調(diào)MK2206導(dǎo)致的PCNA以及Bcl-2表達(dá)降低以及Akt的活化(Fig 5C)(P<0.05)。

Fig 5 The oxidative damage on MIN6 cells caused by Akt inhibitor alleviated by mogroside

3 討論

糖尿病是全球最主要的代謝性疾病之一[9]。胰島β細(xì)胞能夠分泌和貯存胰島素，其增殖的減少以及受損抑制了胰島素的分泌。本研究結(jié)果顯示，MV能夠增加H2O2誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞的增殖。PCNA與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，其表達(dá)水平的高低可反映MIN6細(xì)胞的增殖活性。Western blot結(jié)果顯示，MV逆轉(zhuǎn)了H2O2誘導(dǎo)的PCNA表達(dá)減少。因此，推測(cè)MV通過(guò)增加PCNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞增殖。

氧化應(yīng)激是糖尿病的病理基礎(chǔ)之一，其能夠損傷胰島β細(xì)胞以及導(dǎo)致胰島素抵抗。胰島β細(xì)胞中的抗氧化酶水平較低，對(duì)高糖、高脂、炎癥因子等刺激因子非常敏感，導(dǎo)致其容易受到ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[10]。本研究表明，MV能夠減少H2O2誘導(dǎo)的ROS釋放。這提示MV可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減少M(fèi)IN6細(xì)胞氧化損傷。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，ROS增加的同時(shí)，常常伴隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生。胰島β細(xì)胞的凋亡也是糖尿病發(fā)生的一個(gè)重要因素。過(guò)量ROS的產(chǎn)生會(huì)激活線粒體凋亡通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)?shù)蛲龃碳ぷ饔糜诰€粒體時(shí)，會(huì)導(dǎo)致促凋亡和抗凋亡因子表達(dá)的失衡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是重要的抗凋亡因子，細(xì)胞凋亡的發(fā)生常常伴隨著其表達(dá)的減少。我們研究發(fā)現(xiàn)，MV能夠上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)減少。因此，我們推測(cè)MV減少H2O2誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制可能與增加Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)通路，與增殖凋亡密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)MV干預(yù)后，能夠保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的PI3K/Akt失活。有研究表明，磷酸化的Akt蛋白可以使Bcl-2從聚合體中釋放出來(lái)，從而發(fā)揮抗凋亡作用。為了確定Akt的活化確實(shí)參與了MV對(duì)MIN6細(xì)胞的保護(hù)作用，我們使用了Akt的抑制劑MK2206。我們發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑MK2206可以升高M(jìn)IN6細(xì)胞內(nèi)的ROS水平以及造成細(xì)胞凋亡，而MV也可以減輕其對(duì)MIN6細(xì)胞的氧化損傷。因此，MV上調(diào)氧化損傷MIN6細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)可能與激活上游Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，MV通過(guò)促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，抑制凋亡的發(fā)生以及減少ROS的水平保護(hù)了H2O2誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與促進(jìn)PI3K/Akt的活化增加Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。