新型冠狀病毒保存液開發(fā)與應(yīng)用*

余 輝，鐘德優(yōu)，范月珍，黃麗芳

(福州長庚醫(yī)療器械有限公司，福建 福州 350100)

有學(xué)者從1例患者呼吸道樣本分離出一種新型β冠狀病毒，并對其基因組進行了測序[1-2]。這種新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)因其與急性呼吸道綜合征冠狀病毒的遺傳同源性而被命名為SARS-CoV-2,而該病毒是引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的主要病原體[3-6]。距今為止，全球各地均發(fā)現(xiàn)COVID-19并有蔓延擴散的趨勢，其帶來的診斷、治療、死亡等對全球人民經(jīng)濟、公共健康均造成了沉重負擔(dān)。

國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》指出，將實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)與病毒基因測序作為病原學(xué)確診證據(jù)[7]。但病毒基因測序操作復(fù)雜，檢驗周期較長，國內(nèi)缺乏相關(guān)專業(yè)人才，所以，qPCR核酸檢測成為阻止疫情蔓延擴散的主要手段[8-9]。然而病毒樣本從采集送至實驗室檢測的過程中總存在著各種問題，使樣本中的病毒核酸降解或變異，影響了實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此，作者研發(fā)了一種不僅能完整保存病毒的原始性狀及活性使病毒核酸不被降解，并優(yōu)化待測樣本的存儲條件與保存時間盡量延長的病毒樣本保存液——長庚病毒樣本保存液(CG保存液)，并與常規(guī)保存液對比分析了CG保存液的存放效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 采用常規(guī)保存液(常規(guī)保存液組)和CG保存液(CG保存液組)存放新型冠狀病毒陽性對照品。

1.1.2試劑與儀器 達安新冠病毒檢測試劑陽性對照(滴度為10×105IU/mL)，核酸提取或純化試劑購自中山大學(xué)達安基因股份有限公司，SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)購自中山大學(xué)達安基因股份有限公司，常規(guī)保存液、CG保存液均由福州長庚醫(yī)療器械有限公司提供，qPCR儀采用羅氏LightCycler?480。

1.2方法

1.2.1陽性質(zhì)控品制備 將50 μL陽性對照品分別用常規(guī)保存液或CG保存液稀釋至5 mL，混勻后分裝至采樣管中備用。

1.2.2穩(wěn)定性分析

1.2.2.1室溫(25 ℃) 抽取2組保存液采樣管各3支，室溫存放6、12、18、24 h，收集樣本后進行核酸提取與qPCR擴增反應(yīng)，檢測循環(huán)數(shù)(Ct)值。

1.2.2.24 ℃ 抽取2組保存液采樣管各3支，4 ℃存放1、2、3、5、7 d，收集樣本后進行核酸提取與qPCR擴增反應(yīng)，檢測Ct值。

1.2.2.3-20 ℃ 抽取2組保存液采樣管各3支，-20 ℃存放2、4、6、8周，收集樣本后進行核酸提取與qPCR擴增反應(yīng)，檢測Ct值。

1.2.3核酸提取 根據(jù)中山大學(xué)達安基因股份有限公司核酸提取或純化試劑中說明書操作步驟取200 μL待測樣本進行核酸提取。

1.2.4qPCR擴增反應(yīng) 根據(jù)中山大學(xué)達安基因股份有限公司SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書操作步驟取5 μL待測樣本核酸，加入20 μL反應(yīng)液，混勻后轉(zhuǎn)移至核酸擴增區(qū)進行檢測。擴增反應(yīng)參數(shù)：50 ℃、2 min，95 ℃、2 min，1個循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、35 s，10個循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、35 s，45個循環(huán)。ORFlab基因基礎(chǔ)值為34.65，N基因基礎(chǔ)值為33.93。

2 結(jié) 果

2.12組保存液室溫存放檢測結(jié)果比較 CG保存液組室溫存放6、12、18、24 h靶基因Ct值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；常規(guī)保存液組室溫存放第12小時后N基因Ct值明顯上升，室溫存放第18小時后ORFlab基因Ct值明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組保存液室溫存放檢測結(jié)果比較值)

2.22組保存液4 ℃存放檢測結(jié)果比較 2組保存液4 ℃存放1、2、3、5、7 d靶基因Ct值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組保存液4 ℃存放檢測結(jié)果比較值)

2.32組保存液-20 ℃存放檢測結(jié)果比較 2組保存液-20 ℃存放2、4、6、8靶基因Ct值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組保存液-20 ℃存放檢測結(jié)果比較值)

3 討 論

COVID-19流行期間采用qPCR是檢測COVID-19患者SARS-CoV-2的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。但持續(xù)增長的檢測需求導(dǎo)致有效的待測樣本收集和運輸介質(zhì)極度缺乏[11-12]。因此，本研究通過評估CG保存液保存效果，以期替代常規(guī)保存液，并快速、準(zhǔn)確地檢測SARS-CoV-2，確保適當(dāng)?shù)幕颊吖芾?、疫情控制及更好地了解該病毒的全球流行病學(xué)[13-14]。

實驗室早期應(yīng)用生理鹽水替代病毒樣本保存液運輸保存時發(fā)現(xiàn)，生理鹽水無法達到較長時間保持病毒的完整性狀及活性，因此，生理鹽水不適用于替代病毒樣本保存液。GARNETT等[15]將陽性對照品分別放入各種轉(zhuǎn)運介質(zhì)后檢測SARS-CoV-2分子發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組室溫放置可檢測的RNA大量損失。隨著保存液研究的深入，科研人員在培養(yǎng)基中添加Hank′s平衡液、穩(wěn)定蛋白質(zhì)組、抗生素、緩沖劑等多種物質(zhì)組成常規(guī)保存液以應(yīng)對疫情期間運輸介質(zhì)短缺[16-17]。當(dāng)將常規(guī)保存液保存陽性對照品時發(fā)現(xiàn)，-20 ℃放置8周或4 ℃放置7 d靶基因穩(wěn)定性未受影響；然而室溫放置24 h后靶基因Ct值明顯上升；說明常規(guī)保存液能保持病毒在體外的活性及核酸的完整性，提高病毒核酸陽性檢出率；但其保存待測樣品后對環(huán)境溫度具有較嚴(yán)格的限制，表現(xiàn)出常規(guī)保存液存在局限性。本研究結(jié)果與此結(jié)論一致。MCAULEY等[18]將陽性對照品使用常規(guī)保存液室溫保存24 h后病毒RNA含量顯著下降。基于上述原因，CG保存液添加了合適的核酸裂解液，快速破壞細胞膜，使蛋白變性沉淀，游離出核酸及減少Mg2+、Ca2+、Mn2+等二價金屬離子對核酸質(zhì)量的影響；并加入合適的顯色試劑，使操作人員便于觀察采樣前與采樣后的區(qū)別[19]。本研究結(jié)果顯示，采用CG保存液保存陽性對照品時發(fā)現(xiàn)，CG保存液在不同環(huán)境溫度下靶基因穩(wěn)定性均未受顯著影響。

總之，選擇氯化銨、乙二胺四乙酸鹽、焦磷酸二乙酯、十二烷基硫酸鈉、吐溫20、二硫蘇糖醇等成分使CG保存液能迅速消除SARS-CoV-2感染性，防止病毒核酸降解，降低運輸與檢測人員感染率；另外，保存液包含核酸RNA酶抑制劑，保護病毒核酸穩(wěn)定不被降解，增加了核酸提取效率，更適用于因繁忙的臨床環(huán)境而延誤送樣本到實驗室檢測。