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    基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生姜ZoWRKY基因家族鑒定及逆境響應(yīng)分析

    2022-09-13 07:41:20姜玉松李洪雷李哲馨徐曉玉李隆云黃孟軍
    作物雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:亞族逆境侵染

    姜玉松 李洪雷 李哲馨 徐曉玉 李隆云 黃孟軍,

    (1西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,400715,重慶;2重慶文理學(xué)院特色植物研究院,402160,重慶;3重慶市中藥研究院中藥生藥研究所,400065,重慶)

    植物轉(zhuǎn)錄因子種類繁多,包括MYB[1-2]、CBF[3-4]、NAC[5-6]和 WRKY[7]等,其中 WRKY 家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,含有一段約60個氨基酸殘基的WRKY保守結(jié)構(gòu)域,包括N端的WRKYGQK七肽序列和C端的鋅指結(jié)構(gòu)(zincfinger motif)[8]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)目的差異,WRKY蛋白可分為Ⅰ和Ⅱ亞族,其中亞族Ⅰ含有2個WKRY結(jié)構(gòu)域,其他亞族含有1個WKRY結(jié)構(gòu)域[9];結(jié)合C端鋅指結(jié)構(gòu)域的差異,又可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亞族,其中Ⅱ亞族又細(xì)分為Ⅱ-a+Ⅱ-b、Ⅱ-c和Ⅱ-d+Ⅱ-e 亞組[10]。

    WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物系統(tǒng)發(fā)育[11-12]、逆境應(yīng)答[13-14]和轉(zhuǎn)錄激活[15-16]等過程。LbWRKY3基因參與枸杞(Lycium barbarum L.)果實生長發(fā)育調(diào)控[17];CaWRKY40和CaWRKY6在辣椒(Capsicum annuum)應(yīng)答青枯菌和高溫脅迫的過程中具有正向調(diào)控作用[18];MeWRKY20、MeWRKY21和MeWRKY24等16個WRKY基因調(diào)控木薯(Manihot esculenta)抗細(xì)菌性病害響應(yīng)[19]。近年來,隨著大規(guī)模高通量測序的開展,越來越多的物種完成了WRKY家族信息的鑒定,如擬南芥包含72個WRKY成員[20],粳稻和秈稻分別有98和102個[21],番茄有81個[22],棉花有116個[23]等。

    生姜是姜科植物姜(Zingiber officinale Roscoe)的根狀莖,具有藥食兩用的特點,因具有單位面積產(chǎn)量高和經(jīng)濟(jì)效益好等巨大優(yōu)勢,是一種值得推廣的經(jīng)濟(jì)作物[24]。然而,生姜在旺盛生長期(6-9月)易遭受環(huán)境水分和青枯菌侵染等脅迫,對其生長、品質(zhì)和產(chǎn)量有重要的影響。借助生物信息學(xué)手段可深入分析生姜對逆境脅迫的響應(yīng),挖掘抗性基因,解析轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的抗性調(diào)控機(jī)制。由于生姜基因組雜合性較高的限制,基因組測序工作一直沒有完成,導(dǎo)致分子生物學(xué)研究相對遲緩,特別是關(guān)于生姜ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究更為少見。本研究在生姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上,鑒定了ZoWRKY家族成員,并分析了不同土壤濕度和青枯菌侵染下ZoWRKY基因的逆境響應(yīng)模式,對后續(xù)開展ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子功能研究、推進(jìn)生姜抗性育種和提高生姜產(chǎn)量具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗以生姜品種西南竹根姜(Zingiber officinale Roscoe cv.Zhugen)為材料。生姜組培苗栽培于重慶文理學(xué)院特色植物研究院溫室。溫度30℃,土壤濕度(充水孔隙度,water-filled pore spaces,WFPS)為10%、25%、30%和 40%,光強(qiáng)200μE/(m2·s),光周期為14h光照/10h黑暗),生長至3股杈(約90d)時進(jìn)行青枯菌(Ralstonia solanacearum)侵染處理。侵染接種前,對各濕度條件下的生姜根莖進(jìn)行創(chuàng)傷,然后用濃度為106cfu/mL的青枯菌懸浮液對處理組生姜的土壤進(jìn)行浸漬接種,同時,以無菌水接種為對照。生長至6個月,收集不同土壤濕度和青枯菌侵染處理的生姜地下肉質(zhì)根、地下根莖、地上莖和葉片等組織,置于液氮中快速冷凍,-80℃中保存用于提取RNA。

    1.2 RNA-Seq測序

    按照Trizol試劑盒說明書分別提取生姜各組織總RNA,經(jīng)檢測合格后等量混合,基于Illumina公司Hiseq 4000(Illumina,美國)平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,采用Trinity軟件拼接獲取Unigenes。

    1.3 ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子基因篩選

    利用Galaxy網(wǎng)站(https://usegalaxy.org/)的EMBOSS程序預(yù)測生姜Unigenes的開放閱讀框(ORF),獲取生姜Unigenes編碼蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。從EMBL-EBI網(wǎng)站(https://pfam.xfam.org/)下載WRKY保守域種子序列(序列號PF03106),利用HMMER 3.0軟件建立數(shù)值表格型隱馬可夫模型(Profile HMM),檢索生姜Unigenes編碼蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。根據(jù)WRKY保守結(jié)構(gòu)域序列覆蓋度和E值等參數(shù),利用Perl腳本語言篩選獲得覆蓋度高、置信度高的ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子序列。

    1.4 ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化分析

    從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb_v3.cbi.pku.edu.cn/)下載擬南芥AtWRKY家族蛋白序列作為參考序列,運用MEGA-X的Multiple alignments程序?qū)tWRKY參考序列和篩選到的ZoWRKY蛋白序列進(jìn)行多重比對,將比對結(jié)果采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,參數(shù)設(shè)置為Poisson model、Pairwise deletion和Bootstrap(重復(fù)1000次)。

    1.5 ZoWRKY序列保守結(jié)構(gòu)域分析

    利用DNAMAN 7.0軟件分別對篩選到的ZoWRKY蛋白序列進(jìn)行多序列比對,獲得保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域。利用MEME(http://meme-suite.org/)和WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)對ZoWRKY保守結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽進(jìn)行分析。

    1.6 ZoWRKY理化性質(zhì)分析

    采用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)分析ZoWRKY編碼氨基酸序列長度、分子量大小和理論等電點等信息。采用SOPMA(htttp://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/nps.)獲取二級結(jié)構(gòu)相關(guān)信息。

    1.7 ZoWRKY基因的逆境響應(yīng)模式分析

    從NCBI網(wǎng)站下載不同WFPS(10%、25%、30%和40%)和青枯菌(R.solanacearum)侵染前后的生姜根莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Bioproject:PRJNA380 972),利用Bowtie 2.0軟件(http://bowtie-bio.source forge.net/bowtie2/index.shtml)將下載的轉(zhuǎn)錄組reads數(shù)據(jù)與篩選到的ZoWRKY基因進(jìn)行映射分析。使用Trinity包的Perl腳本語言,計算并歸一化獲得每個ZoWRKY基因的FPKM(Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)值,分析ZoWRKY基因家族對不同土壤濕度及青枯菌侵染的逆境響應(yīng)表達(dá)水平。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA-Seq測序及組裝

    用Illumina HiSeq?進(jìn)行混合RNA樣品二代轉(zhuǎn)錄組測序,共產(chǎn)生27 645 008對Paired-End reads(表1)。經(jīng)過Trinity組裝、cd-hit-est聚類后獲得381 871條無冗余、長度大于300bp的Unigenes,平均長度為891bp,N50長度為1260bp,最大長度為16 953bp,GC比例為45.30%的340.2Mb生姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

    表1 生姜轉(zhuǎn)錄組組裝統(tǒng)計Table 1 Statistics of transcriptome assembly in ginger

    2.2 ZoWRKY篩選及全長序列的獲取

    381 871條Unigenes經(jīng)EMBOSS程序預(yù)測獲得106 653條蛋白序列(長度≥150),利用HMMER 3.0軟件質(zhì)詢WRKY保守域種子序列(序列號PF03106),設(shè)置序列覆蓋度>90%和Independent E value<0.01,共篩選獲得78條序列不同的ZoWRKY蛋白。參照生姜近緣物種香蕉MaWRKY家族基因序列,其中72條ZoWRKY具有完整的ORF序列,而Zoff188265等6條僅有部分ORF序列。

    對 Zoff188265、Zoff210606、Zoff217771、Zoff244943、Zoff295642和Zoff614319等6條無完整ORF序列的ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行Race-PCR擴(kuò)增。首先基于無完整ORF序列的ZoWRKY序列設(shè)計5′和3′端特異性引物,準(zhǔn)備好反應(yīng)所需酶系和體系,然后借助Race-PCR試劑盒(Clontech,Mountain View,美國)分別進(jìn)行cDNA第1條鏈和第2條鏈的合成。Race-PCR試驗成功獲得其全長ORF序列,其中Zoff614319的ORF長度最短,為600bp,Zoff295642的ORF長度最長,為2499bp。

    2.3 ZoWRKY系統(tǒng)進(jìn)化分析

    以擬南芥AtWRKY蛋白序列為指導(dǎo),利用MEGA-X對AtWRKY和ZoWRKY蛋白序列進(jìn)行多序列比對,用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)7個不同亞族的AtWRKY序列與78條ZoWRKY序列的聚類情況,將ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子分成3個亞族,亞族Ⅰ有14個成員;亞族Ⅱ有55個成員,其中Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e分別有10、12、11、14和8個成員;亞族Ⅲ有9個成員(圖1)。

    圖1 生姜與擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationships of WRKY transcription factors in Zingiber and Arabidopsis

    2.4 ZoWRKY保守結(jié)構(gòu)域分析

    利用MEME和WebLogo3對ZoWRKY序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,78條ZoWRKY序列均含有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域(圖2a)。采用在線軟件SWISS-MODEL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模,結(jié)果(圖2b)顯示,ZoWRKY保守結(jié)構(gòu)域的三維模型與模式植物擬南芥的WRKY結(jié)構(gòu)域高度相似,由β1~β4共4個β-折疊結(jié)構(gòu)域和1個鋅離子(Zn2+)結(jié)合位點組成。

    圖2 ZoWRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽(a)及三維結(jié)構(gòu)模型(b)Fig.2 The sequence tags(a)and three-dimensional structural model(b)of the WRKY conserved domain in ZoWRKY proteins

    ZoWRKY亞族保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖3)顯示,亞族成員的WRKY結(jié)構(gòu)域保守度較高,個別成員發(fā)生WRKYGQK七肽域變異和鋅指結(jié)構(gòu)變異。亞族Ⅰ含有2個WRKY保守結(jié)構(gòu)域,根據(jù)其在序列中的位置又進(jìn)一步分為Ⅰ-N和Ⅰ-C亞族。亞族Ⅰ-N的WRKY七肽域為WRKYGQK,鋅指結(jié)構(gòu)為CX4CX22-23HXH形式。亞族Ⅰ-C的WRKY七肽域中為WRKYGQK,鋅指結(jié)構(gòu)為CX4CX23HXH形式。與亞族Ⅰ不同,亞族Ⅱ和Ⅲ只有1個WRKY保守結(jié)構(gòu)域,根據(jù)亞族Ⅱ的氨基酸序列差異,進(jìn)一步分為Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e。其中,亞族Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-d和Ⅱ-e的WRKY七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)為WRKYGQK和CX5CX23HXH形式,亞族Ⅱ-c的為WRKYGQK和CX4CX23HXH形式。亞族Ⅲ的WRKY七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)為WRKYGQK和CX7CX23HXC形式。

    圖3 ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Sequence analysis of the WRKY conserved domain in ZoWRKY proteins

    2.5 ZoWRKY氨基酸組成及結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

    對ZoWRKY進(jìn)行ProtParam分析(表2)表明,不同亞族之間的氨基酸殘基數(shù)目、相對分子質(zhì)量和等電點等理化性質(zhì)存在差異。亞族Ⅰ的氨基酸殘基數(shù)目最多,平均為490個,相對分子質(zhì)量最高(53.6kDa);亞族Ⅱ-a的氨基酸殘基數(shù)目最少,平均為210個,相對分子質(zhì)量最低(23.5kDa)。ZoWRKY的等電點大多數(shù)在堿性范圍。

    表2 ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子氨基酸理化分析Table 2 Physicochemical analysis of amino acid in ZoWRKY transcription factors

    續(xù)表2 Table 2(continued)

    通過Sopma網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),ZoWRKY成員中α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)在全序列中的占比差異較大,但構(gòu)成元件中主要為無規(guī)則卷曲,平均占比大于70%。亞族Ⅰ的α-螺旋占比最低,平均為2.63%;亞族Ⅲ的α-螺旋占比最高,平均為17.85%。

    2.6 ZoWRKY家族對逆境的響應(yīng)模式

    基于不同WFPS(10%、25%、30%和40%)及青枯菌侵染處理的生姜根莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析ZoWRKY基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)。Zoff129734等7個ZoWRKY基因在高濕度土壤中上調(diào)表達(dá),主要分布在亞族Ⅱ-c和Ⅱ-d,其中Zoff204548、Zoff129734、Zoff290286、Zoff407487和 Zoff178498分別上調(diào)了2.89、12.52、4.20、3.66和5.26倍。而Zoff193573等14個ZoWRKY基因下調(diào)表達(dá),主要分布在亞族Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅲ中,其中Zoff193573、Zoff224514、Zoff224527、Zoff109660和 Zoff554263分別下調(diào)至 0.02、0.06、0.06、0.03和0.04(圖 4a)。

    青枯菌侵染分析發(fā)現(xiàn),Zoff186957等19個ZoWRKY基因顯著響應(yīng)青枯菌侵染,其中在侵染過程中顯著上調(diào)表達(dá)的5個主要分布亞族Ⅱ-b和Ⅱ-c中,Zoff147627、Zoff165467、Zoff186957、Zoff244550和Zoff536230分別上調(diào)了7.03、3.44、37.62、2.87和 7.38倍。而 Zoff129734等 14個ZoWRKY基因下調(diào)表達(dá),主要分布在亞族Ⅰ、Ⅱ-a和Ⅲ中,其中 Zoff129734、Zoff146524、Zoff224526、Zoff258147和Zoff301103分別下調(diào)至0.02、0.07、0.17、0.03和0.09(圖4b)。

    圖4 ZoWRKY基因?qū)δ婢车捻憫?yīng)分析Fig.4 Expression analysis of ZoWRKY gene under stress conditions

    3 討論

    WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物體內(nèi),是植物重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,通過功能域識別和結(jié)合靶基因啟動子上的順式作用元件W-box(TTGACC)或SURE(糖響應(yīng)順式作用元件)[25],調(diào)控靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的重編程,在植物生長發(fā)育、代謝等生理過程及應(yīng)答環(huán)境脅迫和防御病原菌侵染等過程都有著重要作用[16]。

    基于生姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共篩選鑒定出78個ZoWRKY家族成員,多于擬南芥的72個WRKY基因,少于番茄的81個和蘋果的132個[20,22,26]。由于生姜的基因組測序還未完成,目前的數(shù)據(jù)通過無參考基因組轉(zhuǎn)錄組測序獲得,而轉(zhuǎn)錄組測序的深度、拼接效果及基因轉(zhuǎn)錄時空差異等諸多原因,可能會導(dǎo)致WRKY家族成員鑒定的缺失,其準(zhǔn)確性還有待基因組數(shù)據(jù)獲得后開展進(jìn)一步的驗證。然而,在現(xiàn)有研究條件下,借助轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘生姜及其他無基因組信息植物的關(guān)鍵基因仍是一條重要的途徑。

    ZoWRKY聚類為3個亞族,共7個組別,與擬南芥[27]、煙草[28]和蘋果[26]中的分類情況一致,表明WRKY家族成員在物種中保守性較高。ZoWRKY成員含有WRKY序列(WRKYGQK)和鋅指結(jié)構(gòu)(C2H2或C2HC型)為核心的WRKY保守結(jié)構(gòu)域,部分成員的保守結(jié)構(gòu)域中存在WRKYGQK七肽域變異和鋅指結(jié)構(gòu)變異,也展示了WRKY家族的多樣性。序列預(yù)測分析顯示,ZoWRKY與基因組完善的物種(如擬南芥和番茄等)WRKY分組數(shù)量、理論等電點及相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)相接近,特別是與生姜近緣物種香蕉MaWRKY相似度較高。

    WRKY家族成員在植物體內(nèi)行使多種功能,當(dāng)植物感知生物或非生物逆境脅迫后,可能啟動一系列ZoWRKY表達(dá),選擇多種內(nèi)源激素介導(dǎo)的信號通路,進(jìn)而調(diào)控抗性基因轉(zhuǎn)錄,在抗性和防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。生姜中ZoWRKY成員分別有21個響應(yīng)土壤濕度和19個響應(yīng)青枯菌侵染,在Ⅱ-c有共同上調(diào)表達(dá)的成員,在Ⅱ-a和Ⅲ有共同下調(diào)表達(dá)的成員。高土壤濕度下呈上調(diào)表達(dá)的7個ZoWRKY主要聚類在Ⅱ-c和Ⅱ-d,結(jié)合與擬南芥同源性較高的AtWRKY8和AtWRKY17功能,推測其主要調(diào)控逆境信號通路和脅迫耐受[29]。下調(diào)表達(dá)的14個ZoWRKY主要分布在Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅲ,結(jié)合同源性較高的AtWRKY40、AtWRKY6及AtWRKY54等功能,推測其主要調(diào)節(jié)防御、衰老和氣孔運動等過程[30];青枯菌侵染引起上調(diào)表達(dá)的5個ZoWRKY基因主要聚類在Ⅱ-b和Ⅱ-c,結(jié)合同源性較高的AtWRKY6和AtWRKY51的功能,推測其主要調(diào)控病原體防御和防御反應(yīng)信號通路[31]。下調(diào)表達(dá)的14個ZoWRKY主要聚類在Ⅰ、Ⅱ-a和Ⅲ,結(jié)合同源性較高的AtWRKY26、AtWRKY18和AtWRKY70等功能,推測其主要參與細(xì)胞分化、防御和信號通路選擇[32-33]。

    4 結(jié)論

    WRKY作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,在生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)和逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用,但關(guān)于ZoWRKY轉(zhuǎn)錄因子鑒定及逆境響應(yīng)分析還未見報道。本研究借助WRKY保守域種子序列檢索生姜Unigenes編碼蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,共篩選鑒定了78個ZoWRKY成員,分為3個亞族,其中有21個和19個ZoWRKY基因分別響應(yīng)不同WFPS和青枯菌侵染,參與調(diào)節(jié)逆境脅迫下生姜生長發(fā)育和對病原菌的防御反應(yīng)等過程。結(jié)果有助于進(jìn)一步探究ZoWRKY家族的生物學(xué)功能,解析生姜響應(yīng)環(huán)境變化如何調(diào)控ZoWRKY基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),對生姜的抗性育種、提高產(chǎn)量及品質(zhì)具有重要的意義。

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