蘋果汁褐變及抗氧化劑護色機理研究進展

成晨亞瓊，趙鵬濤,2,，王曉宇,2,,，王升楠，趙擎豪，杜國榮，黃科，程玉文

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710119；2.西部果品高值利用教育部工程研究中心，陜西西安 710119；3.西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西西安 710065；4.寧波市跨境電子商務(wù)促進中心，浙江寧波 315000）

我國蘋果資源極為豐富，產(chǎn)量達4000 多萬噸，占世界總產(chǎn)量的52%，果品產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益顯著。目前，蘋果汁是我國蘋果加工的主要方向，其中非濃縮還原蘋果汁具有低溫鮮榨、無菌灌裝、冷鏈儲運等特點，能極大保留蘋果的營養(yǎng)價值而受到廣大群眾的喜愛。但在加工和貯藏過程中，因多種外在因素，如溫度、pH 和光照等的影響，蘋果汁容易發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生褐變，不僅會導(dǎo)致蘋果汁顏色和香氣劣變、儲藏期縮短，還會降低其營養(yǎng)價值和商業(yè)價值。因此，抑制蘋果汁的褐變非常關(guān)鍵。

當(dāng)前，國內(nèi)外學(xué)者對使用抗氧化劑抑制果汁氧化褐變的機理和方法進行了廣泛的研究，但對蘋果汁的抗氧化研究較少。抗壞血酸、二氧化硫和谷胱甘肽是國內(nèi)外廣泛使用的食品添加劑，具有抑制氧化酶活性和護色的作用，主要作抗氧化劑用于果汁和釀酒工藝中。除此之外，蘋果中天然含有的內(nèi)源抗氧化劑——蘋果多酚，具有較強的自由基清除能力，現(xiàn)已應(yīng)用于食品加工和營養(yǎng)保健等多個領(lǐng)域。

近年來，果汁加工生產(chǎn)中主要使用單一抗氧化劑來達到護色的效果，但普遍存在護色劑穩(wěn)定性較差，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)榇俸肿儎┑膯栴}。多種護色劑之間的協(xié)同護色效果顯著，但對其協(xié)同性的研究還相對缺乏，且大多基于實驗室水平。本文將從蘋果汁的氧化褐變機理、常用抗氧化劑的作用機理以及抗氧化劑協(xié)同護色技術(shù)研究思路展開系統(tǒng)綜述，旨在為蘋果汁的褐變問題解決提供理論依據(jù)和新思路。

1 蘋果汁氧化褐變反應(yīng)

蘋果汁中的氧化反應(yīng)主要分為酶促褐變和非酶促褐變，二者實質(zhì)是蘋果中酚類物質(zhì)的氧化。蘋果中富含酚類物質(zhì)，但不同的酚類物質(zhì)反應(yīng)途徑和機制各不相同，例如兒茶素、沒食子酸、咖啡酸等，既可通過酶促褐變又可經(jīng)非酶途徑褐變，進而加深果汁顏色。酶促褐變主要發(fā)生在前期，而非酶褐變長時間存在，且兩種反應(yīng)所造成的褐變程度及反應(yīng)產(chǎn)物也不同。

1.1 酶促褐變機理

酶促褐變是在有氧條件下，多酚氧化酶催化多酚反應(yīng)生成醌類物質(zhì)，并進一步聚合成黑色素，促使蘋果汁的色值變低的復(fù)雜反應(yīng)，反應(yīng)中各物質(zhì)的特征見圖1。

圖1 酶促氧化物質(zhì)的特征Fig.1 Characteristics of enzymatic oxidizing substances

研究表明，多酚氧化酶是一種含Cu的金屬酶，分為單酚酶即酪氨酸酶、雙酚氧化酶即兒茶酚氧化酶以及漆酶，通常指的多酚氧化酶是兒茶酚氧化酶和漆酶。多酚氧化酶作為催化酶促褐變發(fā)生的動力基礎(chǔ)，是控制反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵，現(xiàn)有研究中多對抑制氧化酶活性的方法進行研究。酚類物質(zhì)也是影響酶促反應(yīng)發(fā)生的重要因素，下文中具體敘述。

1.2 非酶促褐變機理

非酶促褐變主要發(fā)生在蘋果汁的生產(chǎn)貯藏過程中，包括美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)、抗壞血酸氧化分解反應(yīng)以及多元酚氧化縮合反應(yīng)，不僅會引起氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量的減少，產(chǎn)生有害物質(zhì)，還會引起顏色、風(fēng)味等感官品質(zhì)下降。美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)在蘋果汁中主要形成糠醛及類黑精色素來影響果汁的品質(zhì)?？箟难峋哂兴嵝院瓦€原性的特點，在體系中氧化分解后能夠與游離氨基酸反應(yīng)生成紅色素及黃色素，但在蘋果中含量低且加工過程中損失量大，因此不作為非酶褐變的主要原因。多元酚氧化縮合反應(yīng)中，蘋果富含多種酚類物質(zhì)，且所含的酚類物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)活潑，易形成苯醌進而發(fā)生多種反應(yīng)，是導(dǎo)致蘋果汁褐變發(fā)生的主要原因。

1.3 蘋果汁中的酚類物質(zhì)在褐變過程中的作用

蘋果汁中常見的酚類物質(zhì)有兒茶素、表兒茶素、綠原酸、根皮素、槲皮素、原花青素等，這些酚類物質(zhì)積極參與酶促反應(yīng)及非酶促反應(yīng)被氧化成醌類物質(zhì)，并進一步聚合形成呈色物質(zhì)使蘋果汁發(fā)生褐變，但酚類物質(zhì)的種類和含量不同對褐變程度的影響也不同。董新玲測定了綠原酸、兒茶素、表兒茶素和根皮苷在模擬果汁中發(fā)生的非酶褐變，結(jié)果表明隨著時間的延長，果汁白度和亮度降低，體系變黃，兒茶素和綠原酸呈色微紅，表兒茶素呈色偏綠，而根皮苷自身褐變能力較弱。同時發(fā)現(xiàn)在蘋果汁中表兒茶素和綠原酸含量最高。表1 總結(jié)了蘋果汁氧化褐變過程中影響蘋果汁褐變的主要酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)及其醌類衍生物的特性。

表1 影響蘋果汁顏色的主要多酚及其特性蘋果中對顏色起主要作用的多酚及其特性Table 1 Main polyphenols affecting the color of apple juice and their characteristics

綠原酸主要在多酚氧化酶和氧氣的催化下反應(yīng)生成綠原酸p-醌，并可以進一步聚合，且該產(chǎn)物可促進其他酚類物質(zhì)的氧化。少量的兒茶素、表兒茶素會參與酶促褐變，主要發(fā)生非酶褐變形成鄰苯醌類化合物再進一步聚合生成茶黃素或茶紅素類物質(zhì)。表兒茶素可在香蕉勻漿液中的酶作用下氧化聚合成表兒茶素的三聚體；在過氧自由基的作用下可以形成原花青素。兒茶素可以在加熱的條件下發(fā)生自氧化形成茶黃素。根皮苷是蘋果中的特征多酚，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定無自身聚合反應(yīng)發(fā)生，主要在多酚氧化酶作用下逐漸由微黃色變?yōu)槌燃t色的氧化產(chǎn)物POP2。原花青素B具有多電子的羥基結(jié)構(gòu)，極易發(fā)生氧化反應(yīng)，每分子具有八個酚羥基可以捕獲8 個氧自由基，通過加成反應(yīng)生成穩(wěn)定呈色物質(zhì)。槲皮素可以在水相環(huán)境中失去兩電子而自身被氧化為醌類衍生物。此外，汪曉謙研究了紅肉蘋果和非紅肉蘋果的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)總酚和總花青素含量與多酚的抗氧化能力成正比，因此也被用作評價蘋果汁品質(zhì)的重要指標(biāo)。在實際生產(chǎn)中可通過選擇蘋果的品種及成熟度來控制蘋果汁中所含多酚的種類和含量抑制褐變。果汁中溫度和pH 的升高也會促進多酚物質(zhì)的分解，而發(fā)生褐變，例如蘋果中的葉綠素、花色苷等色素物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，氧化分解后會生成不良的有色物質(zhì)，加劇果汁顏色的劣變。

1.4 影響蘋果汁褐變的環(huán)境因素

溫度是影響蘋果汁褐變發(fā)生的主要原因之一。在蘋果汁加工中，控制蘋果原料的加工溫度可以很好地抑制酶促褐變并保留蘋果所含的營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味品質(zhì)。非酶促反應(yīng)中，溫度升高在30 ℃以上會促進美拉德反應(yīng)的發(fā)生速率，同時也會間接影響酶促褐變，當(dāng)溫度達到氧化酶最適溫度時就會促進氧化反應(yīng)發(fā)生。在蘋果汁的殺菌環(huán)節(jié)中常采用熱殺菌，例如巴氏殺菌和超高溫瞬時殺菌等工藝，不僅可以起到殺菌作用也抑制了酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生。在pH 的影響下，非酶褐變中當(dāng)pH 大于3 時抗壞血酸不穩(wěn)定易分解發(fā)生褐變。在酶促褐變中，pH 對酶活性產(chǎn)生的直接影響可以抑制酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生。氧氣作為酶促反應(yīng)發(fā)生的必要條件，空氣中的分子態(tài)氧氣在多酚與多酚氧化酶接觸時，促進形成易褐變的羥基醌。采取抗氧化劑或真空包裝等措施能夠把果汁中氧氣及時去除，同時滿足褐變抑制需求，降低果汁褐變的程度。

2 常見的蘋果汁抗氧化劑

2.1 蘋果多酚

蘋果多酚是蘋果中具有苯環(huán)并結(jié)合多個羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的總稱，其類型、結(jié)構(gòu)和含量與蘋果汁的顏色、風(fēng)味和香氣密切相關(guān)。蘋果中的多酚主要包括酚酸類和類黃酮類等，其中綠原酸、根皮苷等含量極高是主要的酚類物質(zhì)。賀金娜對紅富士蘋果中的綠原酸、表兒茶素及根皮苷的抗氧化性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其抗氧化性與人工合成抗氧化劑TBHQ無差異，且綠原酸和根皮苷的抗氧化效果高于抗壞血酸。張影陸等研究發(fā)現(xiàn)，在酶促氧化反應(yīng)過程中，綠原酸的聚合度相對于兒茶素聚合度的增加程度更大，說明綠原酸更易與酶發(fā)生反應(yīng)，是多酚氧化酶催化的較適底物，對果汁的口感和產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響更大。以表1 中綠原酸酶促反應(yīng)為例，在綠原酸酶促反應(yīng)過程中，蘋果多酚的酚羥基與氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基反應(yīng)，形成了相對穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu)，從而阻止了綠原酸醌類物質(zhì)的形成，發(fā)揮了抗氧化作用。綜上，蘋果多酚作為一種天然抗氧化劑，在蘋果汁的加工工藝中，可以通過原料環(huán)節(jié)的甄選來控制潛在的促褐變酚類物質(zhì)，改變氧化速率，影響褐變反應(yīng)發(fā)生的程度。

作為蘋果內(nèi)源性的抗氧化劑，蘋果多酚在其他果蔬汁加工中也有應(yīng)用。有研究提到綠原酸可以顯著提高草莓果汁的穩(wěn)定性。張舒翼等研究發(fā)現(xiàn)根皮苷添加于低酯果膠中，果膠的抗氧化性與根皮苷的添加量呈正比，說明根皮苷具有提高果汁抗氧化性的能力。孫建霞研究了蘋果多酚對胡蘿卜汁的護色作用，發(fā)現(xiàn)蘋果多酚濃度為0.10 g/100 mL 時可以很好地保護-胡蘿卜素，果汁護色效果最佳。若加入的蘋果多酚超出某一臨界量時，雖然高質(zhì)量濃度具有一定的活性誘發(fā)效應(yīng)，但蘋果多酚及其氧化產(chǎn)物均具有酸性，導(dǎo)致溶液的酸性增大，抗氧化作用降低，使得胡蘿卜汁發(fā)生褐變。選擇合適的添加量與蘋果汁抗氧化效果和最終效益密切相關(guān)。

2.2 抗壞血酸

抗壞血酸是一種結(jié)構(gòu)類似葡萄糖的多羥基化合物，其分子中的烯醇式羥基極易解離釋放H，被氧化成脫氫抗壞血酸?？箟难崤c脫氫抗壞血酸之間存在可逆反應(yīng)，且兩者具有相同的生理功能。但在一定條件下，脫氫抗壞血酸可繼續(xù)反應(yīng)，水合形成2，3-二酮古洛糖酸，脫水、脫羧后形成糠醛，再形成褐色素，此時反應(yīng)不可逆。

抗壞血酸通過逐級供給電子而轉(zhuǎn)變?yōu)榘朊摎淇箟难岷兔摎淇箟难岬倪^程，有效清除了體內(nèi)的自由基。其抗氧化作用主要通過三個途徑：將醌還原成酚、與金屬離子螯合、直接被PPO 氧化競爭。以表1中綠原酸酶促反應(yīng)為例，抗壞血酸抑制綠原酸酶促氧化反應(yīng)通過：a.烯醇式羥基中的H使綠原酸醌類產(chǎn)物還原為綠原酸及羥基綠原酸；b.抗壞血酸與多酚氧化酶中的Cu發(fā)生螯合反應(yīng)；c.與多酚氧化酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)?？箟难峥寡趸匦詸C制具體如圖2。

圖2 抗壞血酸抗氧化特性機制示意圖Fig.2 Schematic diagram of antioxidant mechanism of ascorbic acid

抗壞血酸的使用濃度也會影響其抗氧化效果?？箟难峒捌溻c鹽在添加量少時表現(xiàn)出較好的抗氧化性，但超出某一臨界量后不僅會促進氧化褐變，還會直接影響蘋果汁的風(fēng)味。因此，作為抗氧化劑時抗壞血酸的規(guī)定加入量為原料的千分之五。根據(jù)原料的不同，將適宜質(zhì)量分數(shù)的抗壞血酸加入到產(chǎn)品中，可起到有效的抗氧化和抑菌等作用。此外，與上述抗氧化劑相比，抗壞血酸的護色效果及穩(wěn)定性低于二氧化硫和谷胱甘肽，但在抗氧化劑的選擇上抗壞血酸適用的原料更廣泛，對人體而言更健康。HERBIG等報道，抗壞血酸在食品中的穩(wěn)定性差，易氧化分解與游離氨基酸反應(yīng)生成色素加深體系顏色，且抗壞血酸加入果汁后，反應(yīng)生成的中間產(chǎn)物HO會破壞花色苷的吡喃環(huán)，生成無色的酯類降解物，加熱后分解聚合形成棕褐色的沉淀，因此多種抗氧化劑的協(xié)同護色是未來的研究方向。

2.3 二氧化硫

二氧化硫作為主要的抗氧化劑，通常以焦亞硫酸鉀、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉等亞硫酸鹽的形式應(yīng)用于食品加工中，但其添加方式和添加量對果汁的品質(zhì)有著明顯的影響。我國國標(biāo)明確規(guī)定了二氧化硫可作為抗氧化劑、防腐劑和漂白劑等的添加量，合適的添加量能起到抑菌、增酸、溶解和抗氧化等作用，而過量或長期使用會危害人體健康。

二氧化硫添加到蘋果汁中涉及多種復(fù)雜的生化反應(yīng)，主要機制總結(jié)為：抑制氧化酶活性；所形成的亞硫酸鹽與體系中的氧反應(yīng)生成硫酸和硫酸鹽，消耗體系中的含氧量。Danilewicz進一步說明，二氧化硫與鄰二酚氧化產(chǎn)生的醌類物質(zhì)發(fā)生了還原反應(yīng)，抑制醌類的聚合，從而降低褐變的程度。此外二氧化硫的抗氧化性還取決于二氧化硫在氧化過程中還原過氧化物的能力。式（1）為亞硫酸抗氧化特性反應(yīng)式：

2.4 谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸縮合形成的三肽化合物，其所含有的活性硫醇成分賦予了自身抗氧化活性。YIN 等推測谷胱甘肽存在兩種形式，包括還原型的谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物（glutathionedisulfide，GSSG）。研究發(fā)現(xiàn)，在谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）催化下GSH 可以轉(zhuǎn)化為GSSG 和水，而GSSG 也可以在谷胱甘肽還原酶（glutathionereductase，GR）作用下，以NADPH 輔因子轉(zhuǎn)化為GSH，共同構(gòu)成圖3 中GSH 的還原系統(tǒng)。徐菁苒等研究發(fā)現(xiàn)GSH 抑制蘋果汁褐變能力優(yōu)于抗壞血酸和L-半胱氨酸，在食品工業(yè)中常作為單酚保護劑、褐變抑制劑和風(fēng)味調(diào)節(jié)劑，具有作為蘋果汁護色劑的研究潛力。

圖3 還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的氧化還原反應(yīng)Fig.3 Redox reaction between reduced glutathione（GSH）and oxidized glutathione（GSSG）

還原型谷胱甘肽作為抗氧化劑，其半胱氨酸的殘基部分是生物化學(xué)性質(zhì)及抗氧化的作用位點。巰基作為親核中心具有豐富的電子，能夠與鄰羥基醌類化合物結(jié)合，形成無色穩(wěn)定的2-S-谷胱甘?？Х人醽碜璧K醌類化合物之間的縮合反應(yīng)，有效地抑制褐變。以表1 綠原酸酶促反應(yīng)為例，谷胱甘肽能夠與綠原酸中醌類化合物反應(yīng)，阻斷綠原酸的氧化反應(yīng)。同時，谷胱甘肽還可以與醛類化合物結(jié)合，抑制多酚氧化酶活性。然而谷胱甘肽對于酶促氧化反應(yīng)和非酶促氧化反應(yīng)的作用是不同的。酶促褐變反應(yīng)發(fā)生在添加谷胱甘肽之前，無法抑制多酚的氧化，但是可以對酶促氧化產(chǎn)生的醌類物質(zhì)進行抑制，改善氧化環(huán)境，抑制非酶促氧化反應(yīng)。谷胱甘肽作為抗氧化劑可以與多種氧化物質(zhì)反應(yīng)控制氧化反應(yīng)的進程，在實際操作中需注意谷胱甘肽的添加時間，有效合理地選擇對不同褐變反應(yīng)起作用的添加劑。谷胱甘肽抗氧化機制具體如圖4。

圖4 谷胱甘肽抗氧化特性機制Fig.4 Antioxidant mechanism of glutathione (GSH)

谷胱甘肽的添加量對蘋果汁品質(zhì)也有影響。DU 等研究了不同濃度谷胱甘肽對罐裝蘋果汁褐變的影響，發(fā)現(xiàn)0.08%谷胱甘肽處理過的蘋果汁中，對多酚氧化酶活性的抑制率可達99.8%，褐變程度顯著降低。谷胱甘肽在蘋果汁中可以作為抗氧劑使用，關(guān)于蘋果汁加工使用的信息仍然很少，還需要進一步的研究來確定生產(chǎn)不同類型蘋果汁所需的谷胱甘肽添加方式及濃度，以期達到更好的護色效果。谷胱甘肽也被用于果酒加工過程中的護色和抗氧化。WEBBER 等的研究結(jié)果表明添加20 mg/L 的谷胱甘肽可以明顯降低儲藏到12 個月時起泡酒的顏色指數(shù)。XU 等通過研究不同濃度的谷胱甘肽對蘋果酒品質(zhì)的影響說明了谷胱甘肽對蘋果酒的護色效果顯著。

3 抗氧化劑協(xié)同護色

協(xié)同作用是指多種抗氧化劑共同使用，相比使用單一抗氧化劑的抗氧化效果更好。已有研究證明，生物抗氧化劑復(fù)合使用時具有協(xié)同作用。協(xié)同作用效果的比較方法有加和法、直接比較法、響應(yīng)曲面法等，一般優(yōu)先選用比色法測定果汁色度來判斷抗氧化劑的護色效果。表2 為上述四種抗氧化劑的抗氧化特性及其協(xié)同護色特點。

表2 四種抗氧化劑的抗氧化特性及其協(xié)同護色特點Table 2 Antioxidant and synergistic anti-oxidation properties of four antioxidants on color protection

目前關(guān)于蘋果多酚、亞硫酸鹽、谷胱甘肽及抗壞血酸對蘋果汁護色的協(xié)同作用研究相對較少，但從相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)谷胱甘肽、抗壞血酸混合使用時，對蘋果汁的護色效果大于單一使用任一種抗氧化劑。Sonni 等對比加入不同抗氧化劑組分：單一二氧化硫、單一谷胱甘肽及谷胱甘肽復(fù)合抗壞血酸對白葡萄酒的顏色影響發(fā)現(xiàn)，由于抗壞血酸可以與多酚氧化酶的輔基絡(luò)合降低酶的活性，而谷胱甘肽則阻止了醌的進一步聚合，當(dāng)兩者復(fù)合使用時對酶和中間物產(chǎn)生了雙重抑制作用，所以抗壞血酸和谷胱甘肽組合的護色效果顯著。米桂等通過對抗壞血酸、檸檬酸、蜂蜜和殼聚糖進行復(fù)配研究，發(fā)現(xiàn)多種護色劑之間具有一定的協(xié)同護色效果。同時，研究表明谷胱甘肽和二氧化硫在提高耗氧率方面顯示出較好的協(xié)同作用。趙光遠將多種抑褐變劑單一或復(fù)合使用于渾濁蘋果汁加工中研究其護色性能，結(jié)果表明抗氧化劑的協(xié)同護色可以達到對酶、醌及底物等的多重抑制作用，從而加強褐變抑制率。

在抗氧化劑的協(xié)同護色的機理方面，盛雪飛等解釋存在三種機理：多種抗氧化劑之間的修復(fù)再生形成了氧化還原的循環(huán)系統(tǒng)；通過偶聯(lián)氧化導(dǎo)致抗氧化劑間的電位差降低；多種抗氧化劑共同作用減少了體系中的氧氣等。此外，不同護色劑的作用對象不同，復(fù)合使用時可以達到對底物、酶、中間物等物質(zhì)的多重抑制從而增加護色效果，具體如圖5。

圖5 四種抗氧化劑協(xié)同護色抗氧化特性機制Fig.5 Synergistic anti-oxidation mechanism of four anti-oxidants on color protection

總體而言，多種抗氧化劑在反應(yīng)體系中的協(xié)同作用可以優(yōu)化護色效果，既可以彌補護色劑添加量不足時護色效果差的缺陷，又可避免過量使用所帶來的危害。值得注意的是，在實際生產(chǎn)中多種抗氧化劑復(fù)配使用時，需考慮多種實際影響因素，如護色劑的濃度、反應(yīng)體系等。

4 結(jié)論與展望

盡管蘋果汁加工過程中通過對溫度、pH 等外在因素的控制可以達到一定的護色效果，但其氧化機理復(fù)雜，褐變問題依然未得到良好的解決。抑制蘋果汁的褐變是一個綜合的、多因素控制的問題，而目前的添加劑使用以單一抗氧化劑為主，效果差，問題多，多種抗氧化劑協(xié)同護色可以很好地解決這些問題。本文通過淺析蘋果汁的氧化褐變機理和蘋果多酚、二氧化硫、谷胱甘肽及抗壞血酸這四種抗氧化劑的護色作用機制，為研究蘋果汁的專用抗氧化劑和護色劑的開發(fā)提供了參考。