魚內(nèi)臟蛋白水解物的制備及其生理活性研究進(jìn)展

黃 蘋，袁美蘭，趙利，江勇，白春清，陳麗麗

（國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013）

2020 年，我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6549.02 萬噸，其中魚類總產(chǎn)量為2761.36 萬噸，在水產(chǎn)品中占比42.2%，同比增長(zhǎng)了1.95%。在魚類加工中，會(huì)產(chǎn)生約占生魚質(zhì)量40%～55%的副產(chǎn)物（包括魚頭、魚皮、魚骨、魚鱗和內(nèi)臟），但是約有50%的副產(chǎn)物被直接作為廢物丟棄處理，僅有30%被初步加工為低值的動(dòng)物飼料、肥料或發(fā)酵魚露、魚粉。其中魚內(nèi)臟含有大量的蛋白類物質(zhì)且在副產(chǎn)物中占有較大比重（約15%～30%），但其難保存、易腐爛及高值化利用程度較低，造成了不必要的浪費(fèi)和污染。

近年來，從魚及其副產(chǎn)物中制備蛋白水解物成為研究熱點(diǎn)。魚內(nèi)臟是蛋白質(zhì)和omega-3 多不飽和脂肪酸的重要來源，可用作生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物的原料。魚蛋白水解物（FPH）是魚蛋白酶水解后轉(zhuǎn)化成的多肽產(chǎn)物，具有抗凝血、抗菌、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和抗氧化等活性，可以被用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、冠心病和心血管類疾病。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于魚內(nèi)臟生產(chǎn)具有生理活性的蛋白肽的研究較為活躍。例如從大西洋鯖魚（）內(nèi)臟的蛋白水解物中純化抗菌水解物，用沙丁魚副產(chǎn)物（魚內(nèi)臟）、露斯塔野鯪（）內(nèi)臟、虹鱒魚內(nèi)臟、鯉魚Catla（）內(nèi)臟制備抗氧化蛋白水解物。但據(jù)已有文獻(xiàn)可知，魚內(nèi)臟蛋白水解物的生物活性尚未像牛奶蛋白肽和植物蛋白肽那樣得到廣泛深入研究，在臨床應(yīng)用方面也尚未受到關(guān)注，目前多數(shù)研究還是停留在對(duì)制備工藝的不斷重復(fù)上，只有較少的研究評(píng)估了魚內(nèi)臟蛋白水解物作為功能性食品的潛在生物活性。

魚內(nèi)臟蛋白水解物是生物活性物質(zhì)，是生產(chǎn)功能食品和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品的原料來源。本文對(duì)目前國(guó)內(nèi)外魚內(nèi)臟蛋白水解物的制備工藝和生理活性研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解物的綜合加工利用前景進(jìn)行展望，旨在為魚內(nèi)臟蛋白水解物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考，也為水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型發(fā)展帶來更多機(jī)遇。

1 魚內(nèi)臟的基本成分構(gòu)成

魚內(nèi)臟可作為生產(chǎn)蛋白質(zhì)的良好來源，其用途十分廣泛，可加工為細(xì)菌素、生物降解膜、蛋白胨，還可用作蛋白酶源。作為魚類加工的主要副產(chǎn)物，魚內(nèi)臟約占魚體質(zhì)量的10%，其成分比較復(fù)雜，主要包括蛋白質(zhì)、水分、脂肪、灰分等，不同的魚內(nèi)臟，其基本營(yíng)養(yǎng)成分含量有所差異，表1 總結(jié)了幾種不同魚內(nèi)臟的基本成分構(gòu)成。

表1 不同種類魚內(nèi)臟的基本成分構(gòu)成Table 1 Basic nutritional contents of fish viscera of different species

2 魚內(nèi)臟蛋白水解物的制備工藝研究現(xiàn)狀

2.1 魚內(nèi)臟蛋白水解物的制備工藝步驟

魚內(nèi)臟蛋白可以通過酸、堿、酶水解或加熱的方法轉(zhuǎn)化為低分子質(zhì)量肽或游離氨基酸，是提高魚內(nèi)臟蛋白生物活性的常見方法。而在水解之前需對(duì)樣品進(jìn)行一系列的預(yù)處理工藝，以防止蛋白水解液發(fā)生氧化、變色及產(chǎn)生臭味和有毒物質(zhì)。預(yù)處理一般包括去除魚內(nèi)臟的膽囊、魚鰾等物質(zhì)，然后對(duì)樣品進(jìn)行絞碎、脫脂、滅酶、過濾、熱處理等操作。蛋白水解后獲得不同分子量的復(fù)雜的小肽段，一般使用超濾或納濾、微濾、離子交換色譜等方法對(duì)肽組分進(jìn)行初步分離，得到具有多種生理活性的蛋白肽。圖1 總結(jié)了魚內(nèi)臟蛋白水解物的制備工藝步驟。

圖1 魚內(nèi)臟蛋白水解物制備流程Fig.1 Preparation process of fish viscera protein hydrolysate

2.2 魚內(nèi)臟蛋白水解物的制備方法

蛋白水解物的制備方法分為化學(xué)法（包括酸水解、堿水解和熱水解）和生物法（包括自溶、微生物發(fā)酵和酶解法）?；瘜W(xué)法適用于非特定性的水解，其主要優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)單且成本低廉，因此在工業(yè)上的應(yīng)用較為廣泛，但反應(yīng)過程難以控制，且會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失和水解產(chǎn)物的生物活性較低。酶解法由于具有條件溫和、易于控制、無副作用且產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高等優(yōu)點(diǎn)，因此，是接受程度最高、最適合用于生產(chǎn)FPH 的方法。

近年來，越來越多的學(xué)者采用酶法水解魚內(nèi)臟蛋白制備活性肽。表2 詳細(xì)總結(jié)了國(guó)內(nèi)外不同魚內(nèi)臟制備蛋白水解物的工藝條件及部分產(chǎn)物的生理活性。在國(guó)內(nèi)，孫一瑋等以復(fù)合酶酶解鱈魚內(nèi)臟得到氨基酸含量為16.33 mg/mL 的魚內(nèi)臟蛋白水解物。林慧敏等以脫脂鮟鱇魚肝為原料制備的抗氧化肽，水解度為69.52%，羥自由基清除能力76.74%。褚晨艷等用胰蛋白酶對(duì)草魚內(nèi)臟進(jìn)行水解，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化水解條件，最佳條件下水解度可達(dá)37.87%。李致瑜等用Alcalase 蛋白酶酶解大黃魚內(nèi)臟制備抗氧化肽，在最佳工藝下此內(nèi)臟多肽具有較高的抗氧化活性，水解度為30.66%。在國(guó)外，Gómez 等確定了羅非魚內(nèi)臟制備蛋白水解物的最佳酶解時(shí)間、溫度以及pH 等工藝條件，水解度為42.5%。Motamedzadegan 等用中性蛋白酶水解黃鰭金槍魚內(nèi)臟，其水解度相較其他酶制備蛋白水解物，水解度較低為30%。以上研究都以水解度為指標(biāo)，確定了不同魚內(nèi)臟的水解條件，從中可知，不同條件下的水解度是不同的，這取決于所選擇的酶、底物以及溫度、酸堿度、酶解時(shí)間等，其中蛋白酶的特異性影響分子量和疏水性，可以用來系統(tǒng)地從N 末端或C 末端清除氨基酸，從而影響蛋白質(zhì)的水解。較長(zhǎng)的水解時(shí)間產(chǎn)生分子量較小的蛋白質(zhì)和肽，在蛋白質(zhì)表面產(chǎn)生更多暴露的可電離和極性基團(tuán)，使其與水形成氫鍵的能力提高，則溶解性高，具有較高水解度。溫度和酸堿度都會(huì)對(duì)酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生很大影響，極端的溫度和酸堿度會(huì)使酶變性而失活，從而導(dǎo)致水解程度降低。研究發(fā)現(xiàn)，一般堿性條件下的底物蛋白和水解物蛋白的可溶性肽含量高于酸性條件下的可溶性肽含量；pH 接近中性的酶，如中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味酶應(yīng)用更加廣泛。綜合文獻(xiàn)來看，使用堿性蛋白酶、延長(zhǎng)酶解時(shí)間及在中性或堿性條件下，魚內(nèi)臟蛋白水解物的水解度更高，且大多數(shù)小分子肽段具有更高的抗氧化活性，從而提高魚內(nèi)臟蛋白水解物的生理活性。此外，酶解法受多種因素的調(diào)控，它對(duì)環(huán)境污染較小，是目前具有發(fā)展前景的一種技術(shù)。

表2 魚內(nèi)臟水解制備蛋白肽的工藝Table 2 Preparation of protein peptides from fish viscera by hydrolysis

從表2 可以看出，魚內(nèi)臟蛋白水解物的相關(guān)研究比較多，雖然它們有潛在的生理功效，但大多數(shù)關(guān)于魚內(nèi)臟蛋白水解生物活性的實(shí)驗(yàn)都是在體外進(jìn)行的，尚未進(jìn)行體內(nèi)研究和臨床證實(shí)，導(dǎo)致其工業(yè)化制備和應(yīng)用也尚未實(shí)現(xiàn)。如果能進(jìn)一步完善相關(guān)研究，并充分開發(fā)利用其生理活性物質(zhì)，則可為淡水魚加工副產(chǎn)物的合理利用提供方向，提高水產(chǎn)行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

3 魚內(nèi)臟蛋白肽的氨基酸組成

蛋白及多肽的理化特性和生理活性與它的氨基酸組成有著直接或間接的關(guān)系。表3 總結(jié)了部分魚內(nèi)臟蛋白肽的氨基酸組成?？梢钥闯鲆螋~類種類不同，氨基酸組成有較大差異，且同一種魚內(nèi)臟，不同水解處理?xiàng)l件得到的內(nèi)臟蛋白水解物的氨基酸組成也是不一樣的。其中大多數(shù)魚內(nèi)臟含有較高的谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸。

表3 魚內(nèi)臟蛋白酶解物中活性肽的氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences of active peptides in the hydrolysates of fish viscera

4 魚內(nèi)臟蛋白水解物的生理活性研究

4.1 魚內(nèi)臟蛋白的抗氧化性

自由基是通過身體內(nèi)的正常生理反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)，但過量的自由基生成易導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞或組織損傷。天然蛋白水解物在抑制氧化和清除自由基方面起著重要作用，可防止衰老、抗高血壓、抗癌癥、心血管疾病等慢性病，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

目前，研究表明魚類加工副產(chǎn)物的蛋白水解物是潛在的食品抗氧化劑的天然來源，許多抗氧化肽已在魚內(nèi)臟蛋白水解物中被鑒定出來。Ganesh 等用胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合水解烏鯧魚內(nèi)臟，經(jīng)分離純化得到分子量為701.9 Da，結(jié)構(gòu)為Ala-Met-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala 的高抗氧化性肽段，在1 mg/mL 濃度下，DPPH 達(dá)到54%、金屬螯合能力達(dá)到78.6%，隨著酶解液濃度的增加，還原力也加強(qiáng)。Hassan等研究了用化學(xué)法和酶法制備得到的鰱魚內(nèi)臟蛋白水解液的噴霧干燥產(chǎn)物的抗氧化性能。結(jié)果表明，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶制備的鰱魚內(nèi)臟蛋白水解液具有良好的抗氧化性能和綜合品質(zhì)。Je 等用不同蛋白酶對(duì)金槍魚肝臟進(jìn)行酶解得到的蛋白水解物，其還原力、DPPH 清除能力等都較高，具有較好的抗氧化活性。李娜等對(duì)鱈魚魚鰾用六種酶進(jìn)行酶解，其產(chǎn)物DPPH 清除能力達(dá)到61.1%，同時(shí)有較好的亞鐵離子螯合能力。Bougatef 等對(duì)沙丁魚內(nèi)臟蛋白水解產(chǎn)物中的新型抗氧化肽進(jìn)行純化與鑒定，分離出七個(gè)抗氧化劑肽，其結(jié)構(gòu)分別為L(zhǎng)eu-His-Tyr、Leu-Ala-Arg-Leu、Gly-Gly-Glu、Gly-Ala-His、Gly-Ala-Trp-Ala、Pro-His-Tyr-Leu 和Gly-Ala -Leu-Ala-Ala-His，第一個(gè)肽表現(xiàn)出最高的DPPH 自由基清除活性，達(dá)63%±1.57%。研究表明，低分子量的肽段抗氧化活性更高。

4.2 魚內(nèi)臟蛋白水解物的抑制血管緊張素I 轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性

人體腎素-血管緊張素生化系統(tǒng)（RAS）和激肽釋放酶-激酶系統(tǒng)（KKS）對(duì)人體內(nèi)的血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)。RAS 是升壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，腎素先將血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素I，再通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，導(dǎo)致血壓升高（高血壓）。KKS能使毛細(xì)血管舒張，增加通透性，使血壓下降，是降壓調(diào)節(jié)。ACE 抑制劑作用于抗高血壓治療靶點(diǎn)，對(duì)于高血壓人群，如果服用ACE 抑制劑，則降低血管緊張素Ⅱ的生成，血壓下降，從而達(dá)到治療高血壓的目的。楊曉軍等以斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟為原料，用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解，制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制產(chǎn)物，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率為72.34%。Bougatef等研究了不同蛋白酶處理的沙丁魚副產(chǎn)物（魚頭和魚內(nèi)臟）所制的蛋白水解物的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，結(jié)果表明所有水解產(chǎn)物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶都有抑制活性，而堿性蛋白酶處理內(nèi)臟產(chǎn)生的水解產(chǎn)物具有最高的抑制活性（63.2%±1.5%）。Je 等使用不同的酶對(duì)金槍魚肝進(jìn)行水解，結(jié)果表明所有水解產(chǎn)物都具有ACE 抑制特性。目前，大多數(shù)具有ACE 抑制活性的蛋白肽都是化學(xué)合成的，具有一定的副作用，因此，制備天然的具有ACE 抑制活性的蛋白水解物是值得研究的熱點(diǎn)。

4.3 抗菌性

抗菌肽（AMPs）是由10～60 個(gè)氨基酸組成的具有生物活性的小分子多肽，已發(fā)現(xiàn)植物、動(dòng)物和微生物等多種來源。其中魚蛋白水解物中的抗菌肽，不僅能消除入侵的微生物，還能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。LEAP-2和Hepcidins（鐵調(diào)素）都是由魚肝臟合成的抗菌多肽。有報(bào)道指出魚蛋白水解物對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌都有一定的抑制作用。目前用魚內(nèi)臟提取抗菌肽的研究相對(duì)較少，Pezeshk 等用魚精蛋白復(fù)合酶對(duì)黃鰭金槍魚內(nèi)臟進(jìn)行水解，獲得的水解物通過超濾分離得到四個(gè)不同分子量的肽段，其中，最低分子量即<3 kDa 的抗菌肽段對(duì)革蘭氏陽(yáng)性（李斯特菌和葡萄球菌）和革蘭氏陰性（大腸桿菌和假單胞菌）致病菌和與魚腐敗相關(guān)的微生物具有最高的抑菌率，對(duì)DPPH和ABTS自由基具有清除活性，且鐵離子還原能力較強(qiáng)。這些結(jié)果表明，從黃鰭金槍魚內(nèi)臟中提取的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物及其肽段可用作營(yíng)養(yǎng)制品和功能性食品中的抗菌成分和抗氧化成分。

Ennaas 等使用復(fù)合蛋白酶水解鯖魚（）內(nèi)臟，獲得的水解物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（）和革蘭氏陰性菌均有抑制作用。Robert等用復(fù)合蛋白酶將羅非魚內(nèi)臟水解，水解產(chǎn)物的必需氨基酸含量較高，且氨基酸組成平衡，并對(duì)魯氏耶爾森菌（）、愛德華氏菌（）和巨大芽孢桿菌（）有明顯抗菌作用。

抗菌肽除可直接殺滅微生物外，還可通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制改善其免疫功能，增強(qiáng)抗病能力，具有無污染、無殘留、廣譜抗菌及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，是水產(chǎn)動(dòng)物自身免疫系統(tǒng)的重要組成部分，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，有望成為制藥領(lǐng)域新抗生素以及食品工業(yè)中抗菌劑的潛在替代物。

4.4 魚內(nèi)臟蛋白水解物的其他生理活性

據(jù)報(bào)道魚副產(chǎn)物蛋白水解物具有抗壓、預(yù)防糖尿病、抗衰老、抗炎和抗癌等潛在活性，且在制藥領(lǐng)域已有應(yīng)用，例如魚骨具有降血糖作用；羅非魚皮對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有保護(hù)作用、對(duì)抗衰老具有好的發(fā)展?jié)摿?。目前，有少量關(guān)于利用魚的消化酶生產(chǎn)生物活性肽的報(bào)道。Gómez 等在羅非魚內(nèi)臟的水解產(chǎn)物研究中，用HO應(yīng)激的人腸分化Caco-2 細(xì)胞評(píng)價(jià)水解產(chǎn)物對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，得到的兩個(gè)餾分RTVH-A 和FRTVH-V，在≤0.5 mg/mL 的濃度下，可防止細(xì)胞活力的降低，并抑制HO誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，表明RTVH-A 和FRTVH-V 是具有抗氧化特性的成分，并且對(duì)ROS介導(dǎo)的腸損傷具有保護(hù)作用。Giannetto 等從鳀魚內(nèi)臟中獲得的蛋白質(zhì)水解物（APH）對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞炎癥有顯著的保護(hù)作用，降低了促炎介質(zhì)（即環(huán)氧化酶-2）的蛋白表達(dá)。同時(shí)對(duì)敲除基因的小鼠飲食中補(bǔ)充APH，發(fā)現(xiàn)其對(duì)主動(dòng)脈和心臟組織中的促炎細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激相關(guān)基因（/、、、和）的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，表明APH 可發(fā)揮有益作用，具有抗炎性。Xu 等對(duì)鮟鱇魚肝臟進(jìn)行水解得到魚內(nèi)臟蛋白肽，再利用實(shí)驗(yàn)小鼠爬升耐力試驗(yàn)證明了該蛋白肽是一種抗疲勞肽，有明顯的抗疲勞作用。現(xiàn)有的研究表明魚內(nèi)臟蛋白水解物具有一定的疾病預(yù)防和治療作用，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但距離實(shí)際應(yīng)用還有很長(zhǎng)的一段路要走，需要圍繞制備工藝條件、活性成分作用機(jī)制等方面進(jìn)行更廣泛和深入的基礎(chǔ)研究。

5 展望

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)魚內(nèi)臟的研究比較多，但這些研究還停留在較低水平的重復(fù)上，且基本上都還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，深度研究和高值化綜合利用較少。魚內(nèi)臟蛋白水解物具有抗氧化、ACE 抑制、免疫調(diào)節(jié)、金屬離子螯合、抑菌、抗糖尿病等多種生理活性，如何進(jìn)一步提高水解產(chǎn)物的生理活性，并加快對(duì)其生理活性的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究，使之盡早用于營(yíng)養(yǎng)保健品或功能性食品的生產(chǎn)開發(fā)，盡快走上產(chǎn)業(yè)化的道路是值得期待的。

蛋白水解物的生物活性與其氨基酸組成和序列有關(guān)，大多數(shù)具有免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性的食源性蛋白水解物的活性都是通過細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型進(jìn)行測(cè)試的，僅有少數(shù)涉及臨床實(shí)驗(yàn)。另一方面，利用魚內(nèi)臟蛋白水解物制備功能性食品還未見報(bào)道，大多是加入到魚飼料，還需要進(jìn)一步研究其在食品基質(zhì)中的性能和穩(wěn)定性。

此外，F(xiàn)VPH 的生產(chǎn)和使用，正成為一種受歡迎的可持續(xù)替代物，如天然抗氧化劑、蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑、飲料中的穩(wěn)定劑和糖果產(chǎn)品中的風(fēng)味增強(qiáng)劑等，但在原料和產(chǎn)品質(zhì)量保證、低成本工藝的開發(fā)以及活性成分的分離和剩余組分回收方面存在挑戰(zhàn)。另外，魚內(nèi)臟蛋白水解工藝若控制不當(dāng)，可能會(huì)產(chǎn)生苦味，從而影響食品基質(zhì)的感官特性，因此，如何控制水解工藝條件以避免產(chǎn)生苦味，以及對(duì)蛋白水解物進(jìn)行有效的脫苦脫臭是值得研究的。