基于甲狀腺激素及脫碘酶探討桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)壬基酚所致神經(jīng)行為毒性的干預(yù)效應(yīng)

李中意，柯倩華，劉煥，韓文娜，朱思俞，柳春紅,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

壬基酚（Nonylphenol，NP）是一種重要的工業(yè)原料，常被用于生產(chǎn)表面活性劑、殺蟲(chóng)劑、潤(rùn)濕劑和乳化劑等。國(guó)內(nèi)對(duì)NP 的需求量巨大，是僅次于美國(guó)的第二大消費(fèi)市場(chǎng)。研究顯示，空氣、水體和土壤中的NP 污染情況十分嚴(yán)重，工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活污水是環(huán)境中NP 的主要來(lái)源，我國(guó)大多數(shù)河流均有較高水平的NP 檢出。水體中的NP 污染不僅會(huì)降低魚(yú)類(lèi)的生育能力，造成魚(yú)類(lèi)臟器毒性和胚胎發(fā)育毒性，更重要的是會(huì)對(duì)以魚(yú)類(lèi)為食的人類(lèi)造成威脅，對(duì)人體產(chǎn)生生殖、免疫、神經(jīng)等方面的毒性。有研究發(fā)現(xiàn)NP 在體內(nèi)具有模擬雌激素的作用，影響雌性SD 大鼠仔鼠早期神經(jīng)行為的發(fā)育，降低仔鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。相似地，有研究顯示長(zhǎng)期暴露于NP 會(huì)導(dǎo)致其蓄積在大鼠甲狀腺和血清中，使甲狀腺的組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且會(huì)干擾甲狀腺受體和雌激素受體的表達(dá)，從而影響大鼠的神經(jīng)行為。

桑葚是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的小漿果，在世界各地種植廣泛，果實(shí)可作為水果和中藥食用，葉子可以用于喂養(yǎng)桑蠶。桑葚中除了富含人體必需的多種氨基酸，維生素和礦物質(zhì)，還含有多種活性成分，如花青素、白藜蘆醇等。桑葚已經(jīng)被證實(shí)具有抗氧化和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，改善大鼠的內(nèi)分泌紊亂，影響焦慮行為等。桑葚中主要的多酚類(lèi)物質(zhì)花青素和白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)退行性疾病有明顯的改善效果，如花青素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能改善不溶性淀粉樣蛋白所致的神經(jīng)毒性，提高大鼠在Morris 水迷宮中的空間記憶能力；白藜蘆醇能夠通過(guò)影響細(xì)胞的自噬，提高對(duì)大腦中病理性蛋白的清除能力。目前有研究表明桑葚粗提液對(duì)NP 所致的神經(jīng)毒性有一定的干預(yù)效果，但桑葚粗提液中主要是哪種成分以及通過(guò)哪種途徑對(duì)NP 毒性發(fā)揮干預(yù)作用尚不明晰。

本研究用桑葚粗提液和桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)（花青素、白藜蘆醇、花青素和白藜蘆醇聯(lián)合）對(duì)NP 染毒大鼠進(jìn)行干預(yù)，從大鼠體重、食物利用率和臟器系數(shù)評(píng)價(jià)桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 一般毒性的干預(yù)作用。通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open field test,OFT）和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（Elevated plus maze,EPM）對(duì)大鼠的神經(jīng)行為進(jìn)行評(píng)價(jià)，從甲狀腺激素通路和脫碘酶水平分析桑葚及其多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒大鼠的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果有助于深入探討NP 導(dǎo)致大鼠神經(jīng)毒性的機(jī)制，并且對(duì)進(jìn)一步挖掘桑葚及桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)的健康效應(yīng)以及研發(fā)具有抗外源化學(xué)物毒性的保健食品具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮桑葚 國(guó)家桑樹(shù)種植資源華南分圃（廣州）；桑葚花青素（純度≥95%）成都草源康生物科技有限公司；白藜蘆醇（HPLC≥98%）上海源葉生物科技有限公司；壬基酚 上海阿拉丁試劑公司；大鼠脫碘酶（DIO1、DIO2、DIO3）ELISA 檢測(cè)試劑盒、大鼠甲狀腺素（FT3，F(xiàn)T4）ELISA 檢測(cè)試劑盒、大鼠促甲狀腺素（TSH）ELISA 檢測(cè)試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；SPF 級(jí)雄性SD 大鼠 70 只，體重70～90 g，4 周齡，動(dòng)物和飼料購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK（粵）2018-0002），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：44007200078791，通過(guò)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2020b031）。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置和高架十字迷宮裝置 上海移數(shù)信息科技有限公司；Ethovision 8.0 型行為軌跡跟蹤分析系統(tǒng) 荷蘭Noldus 公司；高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備桑葚粗提液 參考楊婕的方法制備桑葚粗提液（MCE），該方法主要提取具有相應(yīng)活性作用的多酚類(lèi)物質(zhì)，又以其中的花青素和白藜蘆醇為代表參與后續(xù)的干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將新鮮桑葚冷凍干燥后粉碎過(guò)篩（60 目），稱(chēng)取500 g 粉末，按照料液比1:15加入乙醇（體積分?jǐn)?shù)80%），超聲輔助提取1.5 h。靜置后取上清液，桑葚果渣按以上步驟重復(fù)提取，將提取液進(jìn)行真空抽濾，得到的濃縮液用超純水定容至500 mL，即為桑葚粗提液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 桑葚粗提液總多酚、總花青素和白藜蘆醇含量的測(cè)定 a.福林-酚法測(cè)定桑葚粗提液總多酚含量。使用80%乙醇溶液配制1 mg/mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用80%乙醇溶液將其稀釋為400、350、300、250、200、150 和50 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取125 μL 各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與福林酚溶液1:1 混合，避光靜置90 min 后測(cè)定760 nm 處吸光值，以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將桑葚粗提液稀釋100 倍，按上述步驟繪制標(biāo)曲計(jì)算總多酚含量。

b.pH 示差法測(cè)定桑葚粗提液中總花青素含量。首先配制pH1.0 的氯化鉀和pH4.5 的乙酸鈉緩沖液。將桑葚粗提液稀釋100 倍后取2 份，每份2.5 mL，分別用pH1.0 的氯化鉀和pH4.5 的乙酸鈉緩沖液定容至25 mL，得到濃度相同的不同樣品緩沖液。將樣品緩沖液進(jìn)行水浴平衡（氯化鉀緩沖液：70 ℃，45 min；乙酸鈉緩沖液：40 ℃，45 min），分別在520 和700 nm處檢測(cè)吸光值，根據(jù)參考文獻(xiàn)中公式計(jì)算花青素含量。

c.參考標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2641-2014《植物源性食品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的測(cè)定 高效液相色譜法》，測(cè)定桑葚粗提液中白藜蘆醇的含量。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將70 只大鼠單籠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，大鼠可自由飲食，室內(nèi)溫度為（22±0.5）℃，相對(duì)濕度為50%～60%，明/暗12 h 循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，通過(guò)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分組，根據(jù)大鼠體重分為7 組：空白對(duì)照組（C 組），桑葚對(duì)照組（MC 組：MCE，以多酚含量計(jì)，120 mg/kg·bw），NP 染毒組（NP 組：NP，270 mg/kg·bw，溶劑為玉米油），桑葚干預(yù)組（M 組，NP+MCE），花青素干預(yù)組（A 組，NP+花青素，按桑葚粗提液中花青素含量計(jì)），白藜蘆醇干預(yù)組（R 組，NP+白藜蘆醇，按桑葚粗提液中白藜蘆醇含量計(jì)），花青素和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)組（AR 組，NP+花青素+白藜蘆醇，按桑葚粗提液中花青素和白藜蘆醇含量混合）。NP 溶于玉米油后按照4 mL/kg·bw 灌胃。干預(yù)組溶劑為生理鹽水，另添加0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液輔助溶解，按照10 mL/kg·bw 灌胃。每天上午9:00 空白對(duì)照組和桑葚對(duì)照組灌胃玉米油，染毒組和干預(yù)組灌胃壬基酚（溶于玉米油）；1 h后，空白對(duì)照組和NP 染毒組灌胃生理鹽水，桑葚對(duì)照組灌胃桑葚粗提液（溶于生理鹽水），干預(yù)組分別灌胃MCE、花青素、白藜蘆醇和花青素與白藜蘆醇的混合液（溶于生理鹽水）。各組大鼠每天具體灌胃設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，連續(xù)灌胃28 d。

表1 大鼠每天灌胃設(shè)計(jì)表Table 1 Operation table of rats by intragastric administration every day

1.2.4 大鼠體重和食物利用率的測(cè)定 每4 d 為一個(gè)灌胃期，每個(gè)灌胃期結(jié)束當(dāng)天的同一時(shí)間稱(chēng)量體重和飼料剩余量，記錄數(shù)據(jù)，食物利用率=（體重增量/飼料消耗量）×100

1.2.5 大鼠臟器系數(shù)的測(cè)定 大鼠在斷頸處死前稱(chēng)量其體重，處死后在冰上進(jìn)行解剖，將大鼠肝臟、腎臟、睪丸和大腦完整的剝離后稱(chēng)重，臟器系數(shù)=（臟器重量/大鼠體重）×100

1.2.6 行為學(xué)測(cè)試 行為學(xué)裝置在徹底清潔后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 h 將大鼠轉(zhuǎn)移到行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室讓其適應(yīng)環(huán)境，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，從大鼠背后輕柔地將其取出鼠籠，放入OFT 和EPM 行為學(xué)裝置中，然后立即離開(kāi)實(shí)驗(yàn)區(qū)域，并通過(guò)行為學(xué)裝置配套軟件自動(dòng)記錄大鼠在5 min 內(nèi)產(chǎn)生的行為學(xué)數(shù)據(jù)（OFT：總路程，進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)、時(shí)間和路程，直立次數(shù)、修飾次數(shù)；EPM：入臂總次數(shù)和總時(shí)間，進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和時(shí)間），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將行為學(xué)裝置中大鼠的排泄物清理干凈，并用75%的乙醇消除氣味再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 甲狀腺激素水平的測(cè)定 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶取血，采血后常溫靜置30 min，然后3000 r/min 離心15 min，得到的上清液即為血清，用相應(yīng)的ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中的FT3、FT4 和TSH。

1.2.8 脫碘酶水平的測(cè)定 大鼠斷頸處死后，在冰上解剖分離肝臟。切取同一部位的適量肝臟組織并稱(chēng)重記錄，按1:9 的質(zhì)量比例加入PBS 緩沖液，在冷凍研磨儀中重復(fù)研磨，得到的勻漿液在4 ℃，3000 r/min離心20 min，取上清液用相應(yīng)的ELISA 試劑盒檢測(cè)DIO1、DIO2 和DIO3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理后以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，使用SPSS20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較組間差異。若方差齊則采用LSD 檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Games-Howell 檢驗(yàn)。<0.05 表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚粗提液多酚類(lèi)物質(zhì)含量

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到，桑葚粗提液中總多酚含量為24.21 mg/mL，花青素含量為14.08 mg/mL，白藜蘆醇含量為129.67 mg/mL。

2.2 大鼠體重和食物利用率變化

由圖1 可知，在28 d 的灌胃期間各組大鼠的平均體重均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，C 組平均體重增長(zhǎng)速度最快，MC 組和R 組次之。但隨著灌胃天數(shù)的增加，各組大鼠體重的增長(zhǎng)速率逐漸減緩，其中NP 組在28 d灌胃期后期體重增長(zhǎng)速度最慢。

圖1 桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒大鼠體重增長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of mulberry polyphenols on body weight gain of rats exposed to NP

由表2 可知，灌胃前各組間大鼠體重?zé)o顯著性差異（>0.05）。經(jīng)過(guò)28 d 的灌胃后，與C 組相比，各組大鼠體重和體重增量均顯著或極顯著低于C 組（<0.05 或<0.01）。與NP 染毒組相比，四個(gè)干預(yù)組除R 組體重顯著增加（<0.05）、體重增量極顯著提高（<0.01）外，M、A 和AR 組大鼠體重和體重增量均無(wú)顯著性差異（>0.05）。

表2 各組大鼠體重變化Table 2 Changes of body weight of rats in each group

由表3 可知，在28 d 灌胃期間，各組大鼠的食物利用率均逐漸下降。在灌胃前期，各組大鼠食物利用率沒(méi)有明顯差異。與C 組相比，NP 組食物利用率從第4 個(gè)灌胃期開(kāi)始出現(xiàn)極顯著下降（<0.01）；M 組食物利用率從第3 個(gè)灌胃期開(kāi)始顯著下降（<0.05），但從第6 個(gè)灌胃期開(kāi)始有所恢復(fù)，與C 組無(wú)顯著性差異（>0.05）；A、R 和AR 組食物利用率僅在第4個(gè)灌胃期有顯著降低（<0.05）。與NP 組相比，四個(gè)干預(yù)組食物利用率均從第6 個(gè)灌胃期開(kāi)始顯著或極顯著上升（<0.05 或<0.01）。從總食物利用率來(lái)看，四個(gè)干預(yù)組與NP 染毒組相比只有M 組食物利用率有極顯著提升（<0.01）。

表3 各組大鼠食物利用率的變化Table 3 Changes of food utilization rate of rats in each group

綜上所述，連續(xù)28 d 的NP 暴露后，大鼠體重和食物利用率會(huì)明顯降低，說(shuō)明NP 會(huì)影響大鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育。四個(gè)干預(yù)組對(duì)NP 導(dǎo)致的大鼠體重和食物利用率的下降都有恢復(fù)作用，白藜蘆醇對(duì)體重變化的改善最明顯，而桑葚粗提液可以更好地改善NP 導(dǎo)致的食物利用率降低。

2.3 大鼠臟器系數(shù)的變化

由圖2 可知，與C 和MC 組相比，NP 組大鼠的腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)均有顯著或極顯著增加（<0.05或<0.01），說(shuō)明NP 染毒后大鼠的腎臟和肝臟產(chǎn)生了形態(tài)學(xué)變化；與NP 組相比，四個(gè)干預(yù)組的腎臟系數(shù)都有降低但無(wú)顯著性差異（>0.05），肝臟系數(shù)也都有下降，并且A 組的肝臟系數(shù)顯著下降（<0.05），這可能是因?yàn)榛ㄇ嗨啬軌蛘{(diào)節(jié)促凋亡蛋白和促炎因子的表達(dá)，從而抑制肝臟細(xì)胞凋亡。就大腦系數(shù)而言，與C 組相比，除MC 組和R 組，其余4 組大鼠大腦系數(shù)均顯著或極顯著增加（<0.05 或<0.01），說(shuō)明NP 染毒可能使大鼠大腦產(chǎn)生了形態(tài)學(xué)變化；與NP 組相比，M、R、AR 組大腦系數(shù)都有下降趨勢(shì)，其中R 組下降最明顯，但沒(méi)有顯著降低，說(shuō)明桑葚粗提液、白藜蘆醇和聯(lián)合干預(yù)組對(duì)大腦系數(shù)的有干預(yù)效果但不是很明顯。就睪丸系數(shù)而言，各組大鼠間沒(méi)有顯著性差異（>0.05）。

圖2 桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒大鼠臟器系數(shù)的影響Fig.2 Effects of mulberry polyphenols on organ coefficient of rats exposed to NP

2.4 桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒后大鼠神經(jīng)行為的影響

各組大鼠在28 d 灌胃期前后的OFT 結(jié)果如表4和表5 所示。由表4 可知，各組大鼠的OFT 行為指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（>0.05）。由表5 可知，與C 組、MC 組相比，NP 組大鼠活動(dòng)總距離極顯著下降（<0.01）。NP 組大鼠進(jìn)入中心區(qū)的次數(shù)和時(shí)間顯著低于C 組（<0.05），且在中心區(qū)活動(dòng)距離和直立次數(shù)顯著低于MC 組（<0.05）。大鼠進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)和時(shí)間越少，焦慮程度越高，這說(shuō)明NP 染毒造模成功。與NP 染毒組相比，四個(gè)干預(yù)組的大鼠活動(dòng)總路程都顯著增加（<0.05），M 組、R 組和AR 組大鼠進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)顯著或極顯著增加（<0.05 或<0.01），R 組大鼠在中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間顯著上升（<0.05），M 組和AR 組大鼠在中心區(qū)域活動(dòng)距離顯著增加（<0.05），AR 組大鼠直立次數(shù)極顯著增加（<0.01），這些結(jié)果說(shuō)明M 組、R 組和AR 組對(duì)大鼠焦慮均有一定的干預(yù)效果，而A 組的干預(yù)效果不明顯。

表4 灌胃前OFT 行為指標(biāo)分析Table 4 Analysis of behavioral indexes of OFT before intragastric administration

表5 灌胃后OFT 行為指標(biāo)分析Table 5 Analysis of behavioral indexes of OFT after intragastric administration

由表6 可知，各組間大鼠在28 d 灌胃期前的EPM 行為指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（>0.05），28 d 灌胃期后各組大鼠在EPM 的行為指標(biāo)分析如表7 所示。與C 組和MC 組相比，NP 組大鼠入臂總次數(shù)、進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和時(shí)間均顯著或極顯著減少（<0.05或<0.01），說(shuō)明NP 染毒使大鼠產(chǎn)生了焦慮情緒，造模成功。與NP 組相比，M 組、A 組和R 組大鼠入臂總次數(shù)、進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和時(shí)間均有顯著或極顯著提高（<0.05 或<0.01），AR 組的入臂總次數(shù)和進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)也顯著提高（<0.05），這些結(jié)果說(shuō)明四個(gè)干預(yù)組對(duì)大鼠焦慮均有一定的干預(yù)效果。

表6 灌胃前EPM 行為指標(biāo)分析Table 6 Analysis of behavioral indexes of EPM before intragastric administration

表7 灌胃后EPM 行為指標(biāo)分析Table 7 Analysis of behavioral indexes of EPM after intragastric administration

綜上所述，OFT 和EPM 測(cè)試結(jié)果同時(shí)說(shuō)明NP 暴露會(huì)導(dǎo)致大鼠的焦慮行為。NP 暴露后可能會(huì)在蓄積大腦中并導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂和胞核固縮，隨著暴露濃度越高，腦組織中NP 蓄積濃度越高。結(jié)合本研究中NP 暴露后大腦系數(shù)顯著增加的結(jié)果，推測(cè)NP 可能通過(guò)蓄積在大腦中對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷，從而產(chǎn)生神經(jīng)行為毒性。楊婕發(fā)現(xiàn)桑葚粗提液能夠顯著增加大鼠在OFT 測(cè)試中進(jìn)入曠場(chǎng)中心區(qū)域次數(shù)，還可以顯著提高EPM 測(cè)試中進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和時(shí)間，說(shuō)明桑葚粗提液能夠改善焦慮程度，本研究結(jié)果與之一致。

2.5 桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒后大鼠甲狀腺激素的影響

桑葚粗提液、花青素及白藜蘆醇對(duì)各組大鼠血清中FT3、FT4 和TSH 水平的影響如圖3 所示。與C 組和MC 組相比，NP 組大鼠血清中的FT3、FT4和TSH 都有極顯著降低（<0.01），說(shuō)明NP 對(duì)甲狀腺激素和促甲狀腺激素的分泌產(chǎn)生了干擾。干預(yù)組中，M 組和AR 組與NP 組大鼠相比，血清中FT3、FT4 和TSH 水平都有顯著回升（<0.05 或<0.01），R 組大鼠血清中的FT3 水平有極顯著的上升（<0.01），說(shuō)明桑葚粗提液干預(yù)和聯(lián)合干預(yù)能夠在一定程度上緩解NP 對(duì)甲狀腺激素和促甲狀腺激素的影響。

圖3 桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒大鼠血清中甲狀腺激素的影響Fig.3 Effects of mulberry polyphenols on thyroid hormone in serum of rats exposed to NP

2.6 桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒后大鼠脫碘酶的影響

桑葚粗提液、花青素及白藜蘆醇對(duì)各組大鼠肝臟中脫碘酶DIO1、DIO2 和DIO3 水平的影響如圖4所示。與C 組相比，NP 組、R 組和AR 組大鼠肝臟內(nèi)的DIO1、DIO2 和DIO3 水平均顯著或極顯著增加（<0.05 或<0.01），說(shuō)明NP 暴露引起了大鼠肝臟中脫碘酶表達(dá)異常，花青素及聯(lián)合干預(yù)沒(méi)能逆轉(zhuǎn)NP 誘導(dǎo)的脫碘酶升高。M 組和A 組大鼠肝臟中DIO1、DIO2 和DIO3 水平與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（>0.05），與NP 組相比均有下降的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（>0.05），說(shuō)明桑葚粗提液和花青素對(duì)大鼠肝臟脫碘酶的干預(yù)有一定效果，但不是很明顯。

圖4 桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)NP 染毒大鼠脫碘酶的影響Fig.4 Effects of mulberry polyphenols on deiodinase in rats exposed to NP

3 討論與結(jié)論

本研究中，連續(xù)28 d 的NP 暴露導(dǎo)致大鼠體重和食物利用率明顯降低，而四組干預(yù)組中白藜蘆醇組對(duì)體重變化的改善最明顯，其他三個(gè)干預(yù)組也有所改善，但程度不大。另外，桑葚干預(yù)組的食物利用率明顯高于NP 組且恢復(fù)到與C 組相當(dāng)?shù)乃?，而其余三組恢復(fù)程度不明顯。結(jié)果說(shuō)明桑葚粗提液可以改善NP 導(dǎo)致的食物利用率降低，而白藜蘆醇的干預(yù)作用更好地體現(xiàn)在了體重的恢復(fù)上，先前的研究亦顯示，白藜蘆醇能夠在一定程度上改善環(huán)磷酰胺引起的免疫力低下導(dǎo)致的小鼠體重下降。

臟器系數(shù)是評(píng)價(jià)毒性作用的常用指標(biāo)，能夠在一定程度上反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的機(jī)能狀態(tài)和內(nèi)臟器官的病理變化。從本實(shí)驗(yàn)的臟器系數(shù)結(jié)果來(lái)看，NP 暴露后的大鼠肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)和大腦系數(shù)均顯著增加，這可能是因?yàn)镹P 是脂溶性物質(zhì)，容易蓄積于臟器，從而導(dǎo)致臟器出現(xiàn)充血、水腫或肥大等變化。A 組肝臟系數(shù)的干預(yù)效果最明顯，可能是花青素發(fā)揮了調(diào)節(jié)促凋亡蛋白和促炎因子的作用，從而減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。然而，四組干預(yù)物質(zhì)對(duì)NP 導(dǎo)致的腎臟和大腦系數(shù)的增加無(wú)顯著的逆轉(zhuǎn)效果，這表明在一定程度上，桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)未能有效緩解NP 所致腎臟和大腦的形態(tài)學(xué)變化。

OFT 和EPM 實(shí)驗(yàn)是評(píng)估大鼠神經(jīng)行為狀態(tài)的經(jīng)典手段，可以通過(guò)大鼠在OFT 中進(jìn)入中心區(qū)活動(dòng)的時(shí)間和距離或在EPM 中進(jìn)入的開(kāi)臂次數(shù)和停留時(shí)間等指標(biāo)來(lái)評(píng)估其焦慮狀態(tài)，在OFT 中心區(qū)活動(dòng)越少，或進(jìn)入EPM 開(kāi)臂次數(shù)越少，說(shuō)明大鼠的焦慮程度越高。本研究中，NP 組大鼠與C 組和MC 組相比，在OFT 中活動(dòng)的總路程、直立次數(shù)和進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)明顯減少，在EPM 中進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和停留時(shí)間也明顯降低，表明NP 暴露可引起大鼠焦慮情緒。而在桑葚粗提液和多酚類(lèi)物質(zhì)干預(yù)后，上述指標(biāo)均有一定程度的提高，并恢復(fù)到對(duì)照組水平，說(shuō)明干預(yù)組大鼠的焦慮水平被有效緩解。多酚類(lèi)物質(zhì)能夠?qū)箲]抑郁情緒有一定的緩解作用，例如富含多酚的黑果?？軌蝻@著增加大鼠在EPM 中進(jìn)入開(kāi)臂的時(shí)間和次數(shù)，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，對(duì)大鼠具有明顯的抗焦慮作用；黑莓汁中的花青素對(duì)大鼠也有鎮(zhèn)定和抗焦慮的作用，而且在一定劑量下可達(dá)到抗焦慮藥物相似的效果；白藜蘆醇也具有多種治療作用，如抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等。

甲狀腺激素對(duì)于大腦發(fā)揮正常功能有著重要的作用，而內(nèi)分泌干擾物會(huì)影響甲狀腺激素的水平，進(jìn)而影響大腦的神經(jīng)系統(tǒng)。有報(bào)道稱(chēng)甲狀腺激素的降低會(huì)導(dǎo)致海馬體神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)緩慢，造成記憶力下降和認(rèn)知障礙。本研究結(jié)果顯示，與C 組和MC 組相比，大鼠在暴露于NP 后血清中FT3、FT4和TSH 水平極顯著下降，說(shuō)明NP 可能對(duì)大鼠的甲狀腺造成了一定的損傷。與NP 組相比，桑葚粗提液干預(yù)、花青素和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)都能顯著或極顯著提高FT3、FT4 和TSH 的水平（<0.05 或<0.01），白藜蘆醇單獨(dú)處理也能顯著提高FT3 的水平（<0.05），而花青素單獨(dú)處理后，F(xiàn)T3、FT4 和TSH 均沒(méi)有明顯回升。研究顯示，白藜蘆醇能夠通過(guò)改善甲狀腺功能減退大鼠血漿TSH水平和下丘腦促甲狀腺激素釋放激素（TRH）水平，從而改善其學(xué)習(xí)記憶能力。因此，推測(cè)桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)可能是通過(guò)調(diào)控大鼠體內(nèi)甲狀腺激素和TSH 水平等，減少NP 導(dǎo)致的神經(jīng)毒性，從而緩解焦慮情緒。

脫碘酶的作用在于維持甲狀腺激素水平的穩(wěn)定。本研究結(jié)果顯示，NP 染毒后大鼠肝臟中的脫碘酶DIO1、DIO2 和DIO3 水平與對(duì)照組相比均顯著升高（<0.05）。經(jīng)過(guò)桑葚粗提液和花青素干預(yù)后，三種脫碘酶的水平均有下降趨勢(shì)，且與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，而白藜蘆醇和聯(lián)合干預(yù)后三種脫碘酶水平還是顯著高于對(duì)照組。結(jié)果提示桑葚粗提液和花青素對(duì)肝臟脫碘酶水平有一定的調(diào)節(jié)作用，其對(duì)NP 染毒大鼠的干預(yù)效應(yīng)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺激素和脫碘酶水平的穩(wěn)態(tài)、改善大鼠的焦慮情緒，從而達(dá)到減輕神經(jīng)行為毒性的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，NP 短期重復(fù)染毒可導(dǎo)致大鼠體重和食物利用率下降，部分臟器損傷，焦慮行為，血清FT3、FT4 和TSH 水平的降低和肝臟DIO1、DIO2和DIO3 水平的升高。桑葚粗提液及其主要多酚成分花青素和白藜蘆醇可以有效緩解NP 所致的有害作用，推測(cè)其中的機(jī)制可能是桑葚多酚類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺激素水平穩(wěn)態(tài)達(dá)到減輕神經(jīng)行為毒性的干預(yù)效果。