正丁醇處理對(duì)‘粉紅女士’蘋果貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的影響

田林平，張琪，李瑞，任小林

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

蘋果（Borkh）因其脆甜多汁的口感以及豐富的維生素和礦物質(zhì)深受大眾喜愛。一個(gè)綜合品質(zhì)優(yōu)良的蘋果不僅能夠提高消費(fèi)者的食欲及購買欲，同時(shí)能夠增強(qiáng)其市場競爭力，提高果農(nóng)的收益。蘋果果實(shí)品質(zhì)不僅受質(zhì)地、色澤、固酸比、成熟度和果形指數(shù)的影響，而且與其揮發(fā)性物質(zhì)密切相關(guān)。現(xiàn)已有大量水果的揮發(fā)性物質(zhì)被鑒定，其中草莓中鑒定出100 余種，葡萄中99 種，梨中300余種，香蕉中44 種，蘋果中350 多種。

水果果實(shí)中的揮發(fā)性物質(zhì)包括：酯類、醇類、醛類、酮類、酸類、萜烯類、含硫化合物和酚類。蘋果果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)以酯、醇、醛類物質(zhì)為主，其中酯類物質(zhì)是主要的呈香物質(zhì)，如丁酸酯、丁酯、2-甲基丁酸酯、2-甲基丁酯、己酯、己酸酯等，此外，不同品種蘋果主要呈香物質(zhì)不同，如‘蜜脆’蘋果以2-甲基-丁酸乙酯和丁酸乙酯為主；‘紅玉’蘋果以己醇、3-甲基丁醇為主；嘎啦系蘋果以乙酸己酯、乙酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯為主；富士系蘋果以2-甲基乙酸丁酯和2-甲基丁酸乙酯為主。其中呈甜香的乙酸丁酯、呈蘋果香的2-甲基丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、丁酸乙酯對(duì)它們的香氣貢獻(xiàn)起了重要作用。

此外乙烯處理、1-MCP 處理、氣調(diào)貯藏、冷藏以及相關(guān)前體的添加均會(huì)影響蘋果果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生。蘋果果實(shí)中的揮發(fā)性酯類物質(zhì)主要來自于脂肪酸代謝途徑和氨基酸代謝途徑，其中醇類物質(zhì)和?；?輔酶A 在醇?；D(zhuǎn)移酶的作用發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯是關(guān)鍵的一步。已有報(bào)道表明蘋果整果可以吸收外源醇，并將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酯類物質(zhì)，Harb用丁醇，己醇，戊醇作為香氣前體處理‘金冠’蘋果，在超低氧環(huán)境下貯藏6 個(gè)月，發(fā)現(xiàn)其乙酸己酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯的含量顯著增加。Lee 等用正丁醇、2-甲基丁醇、正己醇處理‘富士’蘋果，發(fā)現(xiàn)乙酸丁酯、丁酸丁酯、丙酸丁酯、己酸丁酯、辛酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯含量均顯著增加。丁醇作為蘋果中主要的揮發(fā)性醇類物質(zhì)以及酯類合成的重要前體物質(zhì)，已受到廣泛關(guān)注，本研究通過不同濃度的外源正丁醇處理‘粉紅女士’蘋果果實(shí)，分析其對(duì)蘋果果實(shí)貯藏期間內(nèi)源揮發(fā)性酯類物質(zhì)的影響，旨在為揮發(fā)性物質(zhì)合成及代謝途徑的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘粉紅女士’蘋果 陜西省扶風(fēng)縣天度鎮(zhèn)一商業(yè)果園；正丁醇 色譜級(jí)（濃度≥99.5%），Sigma-Aldrich公司；3-壬酮 HPLC 級(jí)（濃度≥99.7%），Alfa Aesar公司；乙醇 分析級(jí)（濃度≥99.7%），四川西隴科學(xué)有限公司；甲基叔丁基醚 色譜級(jí)（濃度≥99.9%），阿拉丁試劑有限公司。

7890B-5977B 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱（HP-5MS）美國Agilent；SB25-12DTD 型超聲清洗機(jī) 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；D-37520 型離心機(jī) 美國Thermo Fisher 公司；氮吹儀杭州奧盛儀器有限公司；QT-1 渦旋儀 上海琪特分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 本試驗(yàn)所用材料‘粉紅女士’蘋果（Borkh‘Pink Lady’）果實(shí)于2017 年10 月30 日采自陜西省扶風(fēng)縣天度鎮(zhèn)一管理良好的商業(yè)果園。挑選大小一致，著色均勻，成熟度一致，無機(jī)械損傷，無病蟲害的570 個(gè)果實(shí)，采收后立即運(yùn)往西北農(nóng)林科技大學(xué)采后生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，室溫放置24 h 散去田間熱。根據(jù)先前的預(yù)實(shí)驗(yàn)（處理濃度分別為25、50 和100 μL·L），確定本實(shí)驗(yàn)的處理濃度為10 和25 μL·L。實(shí)驗(yàn)分為3 組，對(duì)照組培養(yǎng)皿中僅放置濾紙，不添加任何溶劑，處理組培養(yǎng)皿中放入濾紙后分別添加3.6 和9 mL 的正丁醇（濃度分別為10 和25 μL·L）。將蘋果和裝有濾紙的培養(yǎng)皿放置于容量為360 L 的氣調(diào)箱內(nèi)密閉熏蒸，熏蒸時(shí)間為24 h，溫度為20±0.5 ℃。處理結(jié)束后用聚氯乙烯（PVC）保鮮袋包裝后放入紙箱內(nèi)室溫（溫度：20±0.5 ℃，相對(duì)濕度：85%～90%）貯藏42 d，每隔7 d 每組隨機(jī)挑選9 個(gè)果實(shí)取樣，每3 個(gè)果實(shí)為一個(gè)重復(fù)，于?80 ℃冰箱保存。

1.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)的提取 本試驗(yàn)揮發(fā)性物質(zhì)的提取采用有機(jī)溶劑萃取法，提取方法參考石金瑞等。用液氮研磨儀將從?80 ℃冰箱中取出的待測(cè)樣品研磨成粉末；稱取2 g 樣品于10 mL 離心管中，并加入3 mL 的蒸餾水，3 mL 的甲基叔丁基醚（Methyl tertbutyl ether，MTBE）和10 μL 的內(nèi)標(biāo)[V（3-壬酮）:V（甲醇）=5:30000]，渦旋儀充分混勻。將混勻后的樣品放入超聲清洗機(jī)中，20 ℃超聲萃取30 min，然后11000 r/min、4 ℃條件下離心15 min。吸取上清液1.5 mL，利用氮吹儀濃縮至500 μL，過濾后進(jìn)行GC-MS 分析。

1.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)的定性定量分析 采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)分析。分析條件：a.升溫程序：起始溫度40 ℃保持3 min，然后以每分鐘5 ℃升溫至180 ℃，再以每分鐘8 ℃升溫至300 ℃，保持2 min；b.色譜條件：色譜柱為HP-5MS，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣，載氣：流速為1 mL/min 的氦氣（濃度99.999%）；c.質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電離能量70 eV，傳輸線和離子源溫度均為240 ℃；質(zhì)量掃描m/z 33～380。

揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析是根據(jù)GC-MS 得到譜圖，利用Qualitative Analysis B.07.00 進(jìn)行分析，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間、質(zhì)譜圖、保留指數(shù)RI 以及NIST庫比對(duì)確定。定量分析參照李瑞等的方法，由各標(biāo)準(zhǔn)品的校正因子（CF）計(jì)算得到各揮發(fā)性物質(zhì)的含量，矯正因子計(jì)算過程如下：

式中：C是標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/kg）；A是離子模式下標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；C是內(nèi)標(biāo)（3-壬酮）的濃度（μg/kg）；A是內(nèi)標(biāo)（3-壬酮）的峰面積。

被測(cè)物質(zhì)濃度C的數(shù)值基于CF 的計(jì)算結(jié)果得來，具體計(jì)算過程如下：

式中：A是被測(cè)物質(zhì)的峰面積；C是被測(cè)樣品的內(nèi)標(biāo)濃度（μg/kg）；A是被測(cè)樣品的內(nèi)標(biāo)面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；使用IBM SPSS Statistics 25 進(jìn)行顯著性差異分析；采用R 軟件進(jìn)行主成分分析并作圖；采用Origin 2021b 繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 正丁醇處理對(duì)‘粉紅女士’蘋果揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量的影響

利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析對(duì)照、10 和25 μL·L正丁醇處理后‘粉紅女士’蘋果貯藏42 d 內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量的變化。在貯藏第0 d 共檢測(cè)到25 種揮發(fā)性化合物（表1），包括酯類、醇類、醛類和其他類；其中酯類物質(zhì)最豐富，包括乙酸丁酯、乙酸-2-甲基丁酯、丁酸丙酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、丙酸己酯、2-甲基丙酸己酯、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、辛酸丁酯以及辛酸己酯。隨著貯藏時(shí)間的增加，揮發(fā)性物質(zhì)種類逐漸減少，在對(duì)照組以及兩種濃度的正丁醇處理組，第7、14、21、28、35、42 d 均分別檢測(cè)出25、24、24、22、20、20、20 種揮發(fā)性物質(zhì)。此外，貯藏初期與貯藏末期相較，特有的物質(zhì)有乙酸戊酯、丁酸丁酯、2-甲基-丙酸己酯、法尼醇和2-甲基丁酸。綜上可知，正丁醇處理不會(huì)影響‘粉紅女士’蘋果揮發(fā)性化合物的種類，但隨著貯藏時(shí)間的延長揮發(fā)性物質(zhì)的種類逐漸減少。

表1 正丁醇處理對(duì)‘粉紅女士’蘋果貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的影響Table 1 Volatile substance content in ‘Pink Lady' apple treated with n-butanol

正丁醇處理能夠影響貯藏前期‘粉紅女士’蘋果揮發(fā)性物質(zhì)的含量，在對(duì)照及兩種不同濃度的正丁醇處理后的整個(gè)貯藏過程中大部分揮發(fā)性物質(zhì)呈現(xiàn)先升高后降低最后保持基本穩(wěn)定的趨勢(shì)。正丁醇處理組貯藏前期與對(duì)照相比，其揮發(fā)性物質(zhì)含量上升顯著（<0.05）（圖1），尤其是25 μL·L處理組，此外，含量變化較大的物質(zhì)有乙酸丁酯、丁酸丙酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯。在貯藏第7 d 時(shí)，25 μL·L處理組的乙酸丁酯含量為1836.37 μg/kg，是10 μL·L處理組的2 倍，對(duì)照組的3.6 倍；25 μL·L處理組的丁酸丁酯含量為703.12 μg/kg，是10 μL·L處理組的2.39 倍，對(duì)照組的3 倍，在貯藏14 d 時(shí)，25 μL·L處理組的丁酸丙酯含量為566.61 μg/kg，是10 μL·L處理組的1.5 倍，是對(duì)照組的1.6 倍；25 μL·L處理組的丁酸丁酯含量為219.67 μg/kg，是10 μL·L處理組的1.7 倍，處理組的1.5 倍。隨著貯藏時(shí)間的延長，丁酯和丁酸酯類物質(zhì)含量逐漸趨于穩(wěn)定，可能是正丁醇的添加使得底物提前消耗完畢果實(shí)達(dá)到穩(wěn)態(tài)，這與Harb 的研究一致，即醇類的添加僅影響了貯藏前期揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生。乙酸-2 甲基丁酯呈現(xiàn)出與其他酯類物質(zhì)不同的情況，在貯藏前期其處理組揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著（<0.05）低于對(duì)照組，并隨著貯藏時(shí)間的延長不斷降低，直至貯藏后期二者無顯著差異（>0.05）。乙酸-2-甲基丁酯特異的表現(xiàn)，可能是由于前期2-甲基丁醇和丁醇競爭乙酰CoA，而乙酰CoA 優(yōu)先與丁醇生成乙酸丁酯，當(dāng)丁醇被消耗完畢，再與2-甲基丁醇結(jié)合生成2-甲基乙酸丁酯，在Harb的研究中，在‘金冠’蘋果中添加丁醇，并在超低氧條件下貯藏，乙酸己酯含量顯著降低，而乙酸丁酯的合成增加，是因?yàn)橐宜岫□サ暮铣上牧艘宜峒乎サ暮铣汕绑w乙酸。貯藏前期揮發(fā)性物質(zhì)總和為78662.89～131940.18 μg/kg，貯藏后期僅為51779.72～110114.45 μg/kg，比貯藏前期揮發(fā)性物質(zhì)總量減少，并且25 μL·L處理組揮發(fā)性物質(zhì)含量下降幅度大于10 μL·L處理組和對(duì)照組。綜上所述，25 μL·L正丁醇的處理在貯藏前期對(duì)促進(jìn)香氣釋放的效果要明顯優(yōu)于10 μL·L的正丁醇處理，并且在相同處理?xiàng)l件下隨著貯藏時(shí)間的增加，揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量大都不斷減少，尤其是25 μL·L處理組。

圖1 不同濃度正丁醇處理對(duì)‘粉紅女士’貯藏期酯類物質(zhì)變化的影響Fig.1 Effects of different concentrations of n-butanol on changes of esters in ‘Pink Lady’ during storage

2.2 主成分分析

主成分分析是一種考察多個(gè)變量間相關(guān)性一種多元統(tǒng)計(jì)方法，研究如何通過少數(shù)幾個(gè)主成分來揭示多個(gè)變量間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。為探究不同貯藏時(shí)間及正丁醇處理對(duì)‘粉紅女士’蘋果揮發(fā)性物質(zhì)的影響，基于各樣本香氣物質(zhì)的含量，進(jìn)行了主成分分析，并制作得分圖和載荷圖（圖2）。結(jié)果顯示，當(dāng)提取兩個(gè)主成分時(shí)可解釋原始變量總方差的63.6%，其中第一主成分（PC1）解釋了總方差的48.7%，是區(qū)分不同貯藏時(shí)間以及不同處理揮發(fā)性物質(zhì)差異的主要成分，第二主成分（PC2）解釋了總方差的14.9%。根據(jù)得分圖（圖2A）可知，不同貯藏時(shí)期的‘粉紅女士’蘋果樣本在PC1 方向被顯著區(qū)分（三個(gè)處理貯藏0、7、14 d均位于PC1 的正半軸），說明引起不同貯藏時(shí)間蘋果香氣差異因素主要是PC1。在貯藏前期（0、7、14 d），同一貯藏時(shí)期不同處理組間的樣本在PC2 方向被顯著區(qū)分（對(duì)照組位于PC2 的正半軸，10 和25 μL·L處理組位于PC2 的負(fù)半軸）；而在貯藏后期，對(duì)照與兩種處理組聚在一起。結(jié)合載荷圖（圖2B）結(jié)果可知每種揮發(fā)性物質(zhì)的貢獻(xiàn)率以及揮發(fā)性化合物和各樣品之間的關(guān)系。在三個(gè)處理的整個(gè)貯藏期，使第0、7、14 以及21 d 的對(duì)照組位于PC1 正半軸的物質(zhì)主要有：乙酸-2-甲基丁酯、乙酸戊酯、丙酸己酯、2-甲基丁醇、E-2-己烯醛、壬醛、2-甲基丁酸，使得第28、35、42 d 位于PC1 負(fù)半軸的主要物質(zhì)有：丁酸丙酯、己酸己酯、辛酸己酯、己醛。在貯藏前期（0、7、14 d），導(dǎo)致對(duì)照組位于PC2 的正半軸的揮發(fā)性物質(zhì)主要為2-甲基丙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、3-己烯醛、壬醛、法尼醇，其中法尼醇僅在貯藏0 d 時(shí)被檢測(cè)到；導(dǎo)致其他兩個(gè)處理組位于PC2 的負(fù)半軸的揮發(fā)性物質(zhì)主要為乙酸丁酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸丁酯。

圖2 正丁醇處理后不同貯藏時(shí)間25 種香氣的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of 25 fragrances treated with n-butanol during storage

不同貯藏時(shí)期‘粉紅女士’蘋果果實(shí)香氣構(gòu)成存在很大差異，正丁醇處理可能是通過影響丁酯的含量從而影響果實(shí)的香氣構(gòu)成。不同處理和貯藏方式對(duì)果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響已有報(bào)道，乙烯和低溫處理富士蘋果后與對(duì)照相比，揮發(fā)性物質(zhì)種類先升后降，其中差異物質(zhì)包括2-甲基-丁酸酯、己酸丙酯、己酸-2-甲基丁酯等。1-MCP 處理鴨梨果實(shí)后在不同程度上降低了其果皮果肉揮發(fā)性物質(zhì)的含量和種類，其差異物質(zhì)在主要有E-2-己烯醛、己醛、乙酸己酯等。張敏將富士蘋果和寒富蘋果分別貯藏10 個(gè)月和12 個(gè)月，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時(shí)間的增加，其貨架期揮發(fā)性化合物不斷減少，尤其是寒富蘋果的酯類物質(zhì)。

2.3 正丁醇處理對(duì)‘粉紅女士’蘋果氣味活性值的影響

氣味活性值（odor activity value，OAV）是鑒別氣味活性化合物的一種常用的方法，由物質(zhì)的含量與其香氣閾值的比值決定；當(dāng)OAV≥1 時(shí)可認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)整體香氣有貢獻(xiàn)作用，并且這個(gè)值越大，對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)越大?！奂t女士’蘋果各處理整個(gè)貯藏期間的OAV 見表2，共檢測(cè)出19 種氣味活性化合物，主要是酯類、醛類物質(zhì)，如己醛、（E）-2 己烯醛、壬醛，乙酸己酯、2-甲基丙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸己酯、辛酸己酯。在包括不同處理的整個(gè)貯藏時(shí)期，乙酸己酯的氣味活性值占到了全部物質(zhì)的40%～53%，是‘粉紅女士’蘋果主要的呈香物質(zhì)。包括乙酸己酯在內(nèi)的許多C6 酯類已被證實(shí)對(duì)許多蘋果品種（如‘McIntosh’和‘Cortland’）的香氣有重要作用。果實(shí)的香氣不僅僅依靠某一種，或某幾種芳香活性化合物，還有化合物之間相互作用的影響。

表2 ‘粉紅女士’蘋果貯藏期間OAV 活性值Table 2 OAV activity of 'Pink Lady' apple during storage

正丁醇的添加明顯增加了貯藏前期乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯的OAV，并且從對(duì)照組到10 以及25 μL·L正丁醇處理組的OAV是遞增的。在整個(gè)貯藏期間，大部分醛類隨著貯藏時(shí)間的增加，OAV 不斷減小，而酯類物質(zhì)隨著貯藏時(shí)間的增加，OAV 不斷增加，說明在貯藏初期醛類是主要的呈香物質(zhì)，隨著貯藏時(shí)間的延長，酯類物質(zhì)尤其是己酯類物質(zhì)成了主要的呈香物質(zhì)。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于不同揮發(fā)性化合物氣味閾值以及含量的不同導(dǎo)致的。其中酯類物質(zhì)的產(chǎn)量通常是隨著乙烯的釋放而逐漸升高，在果實(shí)成熟過程中還伴隨著各種香氣合成相關(guān)酶含量和活性的變化，它們也在影響著揮發(fā)性物質(zhì)的種類和產(chǎn)量。

3 結(jié)論

‘粉紅女士’蘋果果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)主要為酯類和醛類物質(zhì)，具有甜香果香的乙酸己酯是其特征香氣物質(zhì)。揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量在貯藏期間均發(fā)生了變化，在貯藏前期和后期種類差異較大的揮發(fā)性物質(zhì)有法尼醇、2-甲基丁酸；含量差異較大的物質(zhì)有丁酸丙酯、己酸己酯、辛酸己酯和己醛。正丁醇作為蘋果果實(shí)中揮發(fā)性酯類物質(zhì)合成主要前體物質(zhì)，采用10 和25 μL·L正丁醇處理均刺激了貯藏初期果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生，且25 μL·L正丁醇處理后對(duì)貯藏初期揮發(fā)性物質(zhì)含量和OAV 的影響更顯著。該研究為后續(xù)酯類物質(zhì)的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。