不同生長期黃芪無機(jī)元素動態(tài)特征分析

趙 霞，司晶晶，趙鯤鵬，邵士俊，楊扶德,，馮金梁

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅蘭州 730000；3.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅蘭州 730000；4.甘肅康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅蘭州 730000）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪（（Fisch.）Bge.var.（Bge.）Hsiao）或膜莢黃芪（（Fisch.）Bge）的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，含有皂苷、多糖、黃酮等多種化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃芪具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、保護(hù)腎臟等作用，臨床上主要用于治療糖尿病及其并發(fā)癥、心血管疾病等癥。近年來，隨著人們生活水平的提高，養(yǎng)生保健成為人們關(guān)注的焦點，黃芪作為中醫(yī)傳統(tǒng)的補(bǔ)虛藥，其化學(xué)成分多樣，藥理作用顯著，藥性溫和，受到保健行業(yè)一致的青睞。2020 年1 月，國家衛(wèi)生健康委員會、國家市場監(jiān)督總局公布，對黃芪開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)經(jīng)營試點工作，2020 年12 月，歐盟委員會發(fā)布法規(guī)，批準(zhǔn)黃芪提取物作為新型食品投放市場，此類條例的發(fā)布進(jìn)一步推進(jìn)了黃芪在保健方面的開發(fā)與利用。截止2022年3 月17 日，“特殊食品信息查詢平臺”檢索數(shù)據(jù)顯示，以黃芪為原料的膠囊、口服液等保健商品多達(dá)376 種。黃芪在臨床與日常保健方面的廣泛應(yīng)用，使其質(zhì)量問題受到更多人的關(guān)注。

一直以來，黃芪真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒定方法主要為黃芪甲苷、毛蕊異黃酮等主要化學(xué)成分的分析與測定，而無機(jī)元素作為黃芪的重要成分之一，對其產(chǎn)地歸屬，有效成分含量均具有一定的影響。同時，相關(guān)研究表明，無機(jī)元素對作物生長發(fā)育的影響至關(guān)重要，不同生長階段，作物對無機(jī)營養(yǎng)元素的需求有所不同。因此，通過對不同生長期黃芪中的無機(jī)元素進(jìn)行測定，不僅可以進(jìn)一步完善其質(zhì)量評價體系，還可以對其生長過程中的無機(jī)肥料供給以及最佳采收期的確定提供參考。但目前有關(guān)于黃芪在相關(guān)方面的研究報道還較為少見。

甘肅隴西蓮峰鎮(zhèn)是甘肅省黃芪主產(chǎn)區(qū)之一，全鎮(zhèn)中藥材種植約達(dá)4.5 萬畝左右，其中在元明村，楊家咀村和幸福村3 村建成千畝黃芪標(biāo)準(zhǔn)化核心示范基地。故本實驗選擇甘肅省定西市隴西縣蓮峰鎮(zhèn)的栽培黃芪，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）測定不同生長期黃芪中10 種無機(jī)元素含量，通過建立無機(jī)元素圖譜，運用相關(guān)性、主成分等計量方法分析其規(guī)律，探究黃芪生長過程中無機(jī)元素的累積與變化，為黃芪采收期的確定以及質(zhì)量評價提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芪藥材 采自甘肅省定西市渭源縣蓮峰鎮(zhèn)楊家咀村（北緯35.06°，東經(jīng)104.33°）的試驗田，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定均為豆科植物蒙古黃芪（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根；65%硝酸 分析純，德國Meker 公司；鎂（Mg）、鈣（Ca）、釩（V）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鈷（Co）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、鋇（Ba）混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液 10 μg·mL，美國Agilent 公司。

7900 型ICP-MS 質(zhì)譜儀 美國Agilent 公司；Ultra-CLAVELV 型大微波消解儀 德國Milestone 公司；BSA224S-CW 型電子天平 德國Sartorius 公司；IQ 7000 純水凈化系統(tǒng) 美國Millipore；G200 型切割式混合研磨儀 德國Retsch 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采收 2020 年3 月進(jìn)行黃芪的移栽后分別于2020 年6 月27 日、7 月28 日、8 月27 日、9 月26 日、10 月26 日進(jìn)行黃芪樣品的采收。

1.2.2 樣品前處理 采收后的黃芪樣品用清水沖洗干凈后，分別用去離子水沖洗、陰干、粉碎、過篩（100 目），恒重后置于干燥器中備用。

1.2.3 ICP-MS 檢測條件 載氣為氬氣，等離子體射頻功率為1550 W，等離子體流速為15.0 L·min，霧化室溫度為2 ℃，采樣深度為8.0 mm，重復(fù)次數(shù)為3 次。微波消解條件程序如表1 所示。

表1 微波消解條件Table 1 Microwave digestion procedure

1.2.4 溶液制備

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液 將10 種混合元素標(biāo)準(zhǔn)液加2%硝酸逐級稀釋成不同質(zhì)量系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體濃度見表2。

表2 10 種無機(jī)元素標(biāo)準(zhǔn)系列濃度Table 2 Standard series concentrations of ten inorganic elements

1.2.4.2 供試品溶液 精密稱取不同月份采收的黃芪樣品0.3000 g 置于消解罐中，每個樣品平行稱取3 份，加入3 mL 硝酸溶液靜置30 min 后，按照表1所示微波消解條件進(jìn)行消解，消解完成后將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用少量超純水沖洗消解罐，定容，同時做試劑空白。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本論文中的數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)處理結(jié)果的平均值，利用Microsoft Excel 2010、SPSS 26.0 與SIMCA 14.1 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。熱圖采用Hiplot（https://hiplot.com.cn）網(wǎng)絡(luò)平臺繪制，數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，統(tǒng)計差異水平利用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的Duncan 多重比較檢驗，相關(guān)性分析采用皮爾遜（Pearson）相關(guān)分析法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，取相對原子質(zhì)量相近的元素為內(nèi)標(biāo)溶液，在1.2.3 所示條件下進(jìn)樣進(jìn)行含量測定，結(jié)果如表3 所示，各元素值均大于0.999，表明其線性關(guān)系良好。

表3 10 種無機(jī)元素線性關(guān)系考察結(jié)果Table 3 Results of linear relationship investigation of ten inorganic elements

2.1.2 精密度 取同一黃芪樣品消解液在1.2.2 所示條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，根據(jù)測量值計算各元素質(zhì)量濃度響應(yīng)值RSD 值。各元素RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性 精密稱取同一黃芪樣品6 份，每份各0.3000 g，分別按照表1 和1.2.2 所示條件進(jìn)行消解和測定，根據(jù)測量值計算各元素質(zhì)量濃度響應(yīng)RSD 值。各元素RSD<4%，表明實驗的重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性 取同一黃芪樣品消解液在1.2.2 所示條件下分別于0、2、4、8、10、12、24 h 時進(jìn)樣測定，根據(jù)測量值計算各元素質(zhì)量濃度響應(yīng)值的RSD值。結(jié)果表明各元素RSD<4%，表明儀器的穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率 精密稱取已知各元素含量的黃芪樣品0.3000 g，每份樣品平行3 份，加入各元素標(biāo)準(zhǔn)液適量，分別按照1.2.2 所示條件進(jìn)行消解和測定。結(jié)果顯示，各元素加樣回收率在90.10%～108.33%之間，回收率良好，且RSD<4%，表明該方法穩(wěn)定可行。

2.2 不同生長期黃芪無機(jī)元素含量測定結(jié)果

10 種元素含量測定結(jié)果如表4 所示。不同生長期黃芪樣品中測得的10 種元素含量差異較大，其中Mg、Ca、V、Mn、Fe、Ni 和Cu 元素含量均在10 月份時顯著高于其他生長時期（<0.05），8 月時其含量均顯著低于其他時期（<0.05）；Co 元素含量在10 月份時達(dá)到最大值，但與7 月與9 月時的樣品無顯著性差異，Zn 元素在9 月時其含量顯著高于其他采收期（<0.05），7 月時含量顯著低于其他生長期（<0.05），Ba 元素在6 月時含量顯著高于其他生長期（<0.05），8 月為其含量最小的生長期。Mg、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ba10 種元素10 月份含量相較于6 月份分別增加了26.18%、34.15%、40.97%、8.33%、92.36%、77.45%、?19.27%、10.95%、32.49%、?6.66%，結(jié)果表明，除Ni 元素與Ba 元素外，黃芪對其他元素均有富集作用，對Fe 元素的富集效果最為明顯。為了更直觀的表示不同生長期黃芪中無機(jī)元素含量的差異，對10 種元素含量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后繪制熱圖，結(jié)果如圖1 所示，同種元素在不同生長期內(nèi)含量具有較大的差異，基于歐式距離對其進(jìn)行聚類后發(fā)現(xiàn)，7、8 月樣品可以聚為一類，6、9 月樣品可以聚為一類，10 月份樣品單獨為一類，聚為同一類的樣品所在生長期在元素含量上具有一定的相似性。

圖1 10 種無機(jī)元素?zé)釄DFig.1 Heat map of ten inorganic elements in Astragalus membranaceus

表4 不同生長期黃芪樣品中10 種無機(jī)元素含量（mg·kg?1）Table 4 Contents of ten inorganic elements in Astragalus membranaceus samples at different growth stages (mg·kg?1)

2.3 元素特征圖譜的繪制

為了進(jìn)一步觀察10 種元素累積過程，將Mg、Ca、Fe 含量縮小1000 倍，Mn、Cu、Zn、Ba 含量縮小10 倍，其他元素保持不變后制作特征圖譜圖，結(jié)果如圖2 所示，10 種元素含量的累積均為先降后升的動態(tài)變化趨勢，6 月份元素含量均處于較高的水平，然后開始下降，除Cu 元素在7 月份有最低含量外，其他元素均在8 月份時元素含量最低，9 月份開始回升，10 月份又達(dá)到一個高峰。結(jié)果表明，黃芪根部在不同生長時期對無機(jī)元素的富集效果不同，9～10 月為黃芪根部無機(jī)元素大量累積的生長期。

圖2 不同生長期黃芪無機(jī)元素含量變化Fig.2 Changes of inorganic elements in Astragalus membranaceus at different growth stages

2.4 10 種無機(jī)元素間的相關(guān)性分析

植物的生長發(fā)育是多種營養(yǎng)元素相互作用的結(jié)果，各類無機(jī)營養(yǎng)元素也會在植物體內(nèi)相互協(xié)助與制約幫助植物健康的生長，如植物金屬鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)鎘元素的累積過程中起關(guān)鍵作用，避免植物遭受鎘元素毒害。本實驗對10 種元素進(jìn)行相關(guān)系分析，結(jié)果如表5 所示，Mg 與Ca、Mn；Ca 與Mn、Fe、Ba；V 與Mn、Ba；Ni 與Ba 元素之間均存在顯著性相關(guān)關(guān)系，V 與Ca、Fe；Ni 與Ba 元素均存在極顯著性相關(guān)關(guān)系，無機(jī)元素的相關(guān)性強(qiáng)表明一種元素含量因某種因素發(fā)生變化時與其相關(guān)的元素含量也會發(fā)生相應(yīng)的變化。因此，在調(diào)節(jié)有益元素含量增長的同時也要注意一些重金屬元素對身體造成的危害。

表5 不同生長期黃芪樣品10 種無機(jī)元素相關(guān)性分析結(jié)果Table 5 Correlation analysis results of ten inorganic elements in Astragalus membranaceus samples at different growth stages

2.5 不同生長期黃芪的綜合評價

為了對不同生長期黃芪中所含無機(jī)元素進(jìn)行綜合性評價，對不同生長期樣品中10 種無機(jī)元素進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表6 所示，前兩個成分特征值均大于1，且其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了92.132%，表明這兩個成分具有較強(qiáng)的代表性。由各生長期樣品得分與成分累積方差貢獻(xiàn)率和計算其綜合得分F，結(jié)果如表6 所示，10 月份樣品綜合得分排名為第一。結(jié)果表明，從無機(jī)元素層面來說，10 月份黃芪藥材質(zhì)量較優(yōu)。

表6 不同生長時期黃芪主成分分析綜合排名Table 6 Comprehensive ranking of principal component analysis of Astragalus membranaceus at different growth stages

2.6 不同生長期黃芪樣品差異性元素篩選

為分析不同生長期黃芪樣品的主要影響元素，在主成分分析的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行正偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），根據(jù)變量重要性投影（VIP），篩選不同生長期黃芪差異性元素，其中VIP 值越大表明其對分類的貢獻(xiàn)率越大，當(dāng)VIP>1 時，說明該變量為分類的關(guān)鍵因素，分析結(jié)果如圖3 所示。10 種元素中Zn、Ni、Cu、V 四種元素VIP>1，表明此4 種元素可作為特征元素對黃芪的生長進(jìn)行鑒別。

圖3 不同生長期黃芪樣品 OPLS-DA 得分圖Fig.3 OPLS-DA score of Astragalus membranaceus samples at different growth stages

3 結(jié)論與討論

不同時期各無機(jī)營養(yǎng)元素的積累與黃芪生長發(fā)育密切相關(guān)，由相關(guān)研究可知，從移栽期到6 月，為黃芪的移栽出苗期，此階段黃芪根部會吸收土壤中大量養(yǎng)分以滿足其快速生長發(fā)育，故在6 月份時，各無機(jī)營養(yǎng)元素會達(dá)到一個高峰；6～8 月為花果期，植株的快速生長，根部吸收的各類營養(yǎng)成分需要供應(yīng)地上部分開花、結(jié)果，無機(jī)營養(yǎng)元素也隨之下降，8 月份時，各營養(yǎng)元素含量最低；隨著花期的結(jié)束，8 月中旬至10 月中旬，為黃芪的根莖增粗期，主要營養(yǎng)元素又向根部積累，無機(jī)營養(yǎng)元素也又一次達(dá)到了一個高峰，本研究中無機(jī)元素含量在其生長期中的變化符合黃芪的生長的供應(yīng)需求，主成分綜合排名表明，10 月下旬時，黃芪根部各類營養(yǎng)元素含量累積到了最大值，且根據(jù)相關(guān)報道可知，黃芪產(chǎn)量、皂苷等有效成分也在相同時期達(dá)到其最大積累量，綜合考慮各方面因素，10 月中旬，可以作為栽培黃芪的最佳采收期。正偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）發(fā)現(xiàn)，Zn、Ni、Cu、V 四種元素與黃芪的生長密切相關(guān)，Zn、Ni、Cu 元素均為植物生長發(fā)育必需的礦質(zhì)元素，Zn 作為植物多種酶和重要蛋白結(jié)構(gòu)的輔助因子和活化劑，缺鋅會導(dǎo)致其生長素含量下降，進(jìn)而造成植株矮小、生長緩慢等一系列生理問題，施用Zn 肥不僅可以促進(jìn)作物生長，還可以通過Zn-Cd 拮抗作用緩解Cd 毒害。Ni 是脲酶所必需的元素，脲酶的缺乏將導(dǎo)致植物葉片壞死損傷，營養(yǎng)生長期鎳主要分布于葉和芽中，生殖生長期絕大部分鎳會從葉和芽轉(zhuǎn)移到生殖器官；Cu 是植物葉綠體中質(zhì)體藍(lán)素的組成成分，參與光合電子傳遞過程，不同物種地上部和地下部的Cu 含量及轉(zhuǎn)移能力存在較大差異；V 元素作為為人體必需元素之一，盡管目前還沒有確定是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，但相關(guān)研究表明，適量的V 元素可以促進(jìn)作物生長，促進(jìn)植物的固氮、固氯作用，針對此4 種元素與黃芪生長發(fā)育的密切關(guān)系與其在植物體內(nèi)的重要作用，可以為黃芪無機(jī)肥料的配比與供給提供參考。