顏廷宇,林潔鑫,朱建新,葉乃興,金珊,黃建鋒,王鵬杰,3,吳芹瑤,鄭德勇,楊江帆,
(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建福州 350002;2.茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350002;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所,廣東深圳 518120;4.福建商學(xué)院旅游與休閑管理學(xué)院,福建福州 350012;5.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院,福建福州 350002)
紅茶屬于全發(fā)酵茶,具有獨(dú)特風(fēng)味,已發(fā)現(xiàn)含有600 余種揮發(fā)性物質(zhì),使紅茶呈現(xiàn)出豐富的香氣。由于品種、加工過程和地理等的差異,紅茶可呈現(xiàn)花香、果香、甜香和薯香等香氣特征。民間有“花因香而‘活’,茶因香而‘貴’”之說,因此香氣品質(zhì)是評價(jià)紅茶質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。明確紅茶香氣成分和特征對紅茶的生產(chǎn)和銷售具有重要意義。
當(dāng)前,茶葉感官審評仍是當(dāng)前茶葉質(zhì)量評價(jià)的主要手段,但感官審評具有較強(qiáng)的主觀性,易引起爭議。電子鼻(Electronic nose,E-nose)是茶葉客觀審評領(lǐng)域中很有前景的工具,具有操作簡單、快速的優(yōu)點(diǎn),但不能準(zhǔn)確定量樣品中每一種具體揮發(fā)性物質(zhì)。而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)是最常用的分離和鑒定復(fù)雜樣品成分的方法,具有準(zhǔn)確定性和定量的特點(diǎn),與電子鼻結(jié)合可以取長補(bǔ)短、發(fā)揮兩種儀器的優(yōu)勢。敖存采用電子鼻和GC-MS 分析技術(shù),并運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法研究龍井茶中的芳香物質(zhì),篩選出不同龍井茶的重要呈香物質(zhì),發(fā)現(xiàn)不同品種龍井茶的香氣成分含量和香氣特征存在顯著差異。王鵬杰等采用GC-MS 和電子鼻研究了巖茶的香氣特征,篩選出能區(qū)分不同巖茶品種的關(guān)鍵電子鼻傳感器,并通過GC-MS 明確了巖茶的品種特征香氣物質(zhì),為巖茶的品種鑒別和質(zhì)量控制提供參考。王淑燕等運(yùn)用GC-MS 和電子鼻技術(shù),有效區(qū)分了茉莉花茶的產(chǎn)地。
傳統(tǒng)工夫紅茶常用福云6 號、福安大白茶、福鼎大白茶等早生、多毫的品種。近年來,越來越多茶區(qū)采用黃觀音、金牡丹、金觀音等高香品種制作紅茶,其香氣呈獨(dú)特的花果香特征。為探究高香紅茶與傳統(tǒng)工夫紅茶在香氣特征方面的差異,收集高香品種(金觀音)和傳統(tǒng)工夫紅茶品種(福云6 號)的紅茶樣品,在感官審評基礎(chǔ)上,采用GC-MS 與E-nose 檢測茶樣的香氣成分和香氣特征,并通過正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)、聚類分析(Heatmap cluster analysis,HCA)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法比較不同風(fēng)味紅茶在香氣特征方面的差異,以期為紅茶產(chǎn)品的分類鑒別和風(fēng)味品質(zhì)評價(jià)提供參考,提高紅茶品質(zhì),更好打造區(qū)域公共品牌。
紅茶樣品 20 份,取于尤溪縣光興茶業(yè)有限公司和尤溪縣云富茶業(yè)有限公司,包括10 份傳統(tǒng)工夫紅茶和10 份高香紅茶,具體產(chǎn)地為福建省尤溪縣的臺溪鄉(xiāng)、坂面鎮(zhèn)、新陽鎮(zhèn)和西城鎮(zhèn)等地,全部茶樣均是單一品種制成的成品紅茶(2020 年春茶,等級相似)。按照中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 35810-2018 制備。茶葉樣品經(jīng)研磨后過40 目篩,并儲存在黑暗、干燥處備用。
Clarus SQ8T GC-MS、TurboMatrix HS 頂空自動(dòng)進(jìn)樣器、Elite-FFAP 色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)美國Perkin Elmer;電子鼻 上海昂申智能科技有限公司。
1.2.1 感官評估 樣品由5 位有相關(guān)資質(zhì)的感官審評員(3 名女性、2 名男性,均高級評茶員)按照GB/T 23776-2018 審評方法中的的紅茶感官審評方法,從外觀、顏色、香氣、滋味和葉底等方面進(jìn)行評價(jià)和描述。
1.2.2 電子鼻檢測條件 參照Wang 等的電子鼻方法測定紅茶的香氣風(fēng)味特征,每個(gè)樣品做3 次重復(fù)。
3 g 樣品置于60 mL 頂空瓶中,用50 ℃水浴加熱50 min,流量為800 mL/min;采樣時(shí)間為5 min;等待時(shí)間10 s;樣品清洗時(shí)間為120 s。室內(nèi)濕度控制在36%±1%,溫度控制在25±1 ℃。
1.2.3 頂空進(jìn)樣和GC-MS 檢測條件 HS-GC/MS檢測條件在王蔚等的方法上進(jìn)行調(diào)整。每個(gè)樣品做3 次重復(fù)。
頂空條件:取研磨樣0.50 g,置于30 mL 頂空瓶中,加入NaCl 飽和溶液1 mL,用配有聚四氟乙烯墊的密封蓋密封,放入頂空自動(dòng)進(jìn)樣器。頂空爐溫75 ℃,取樣針溫度100 ℃,傳輸線溫度120 ℃,樣品平衡時(shí)間50 min,捕集阱Hi 280 ℃、Lo 40 ℃,保持5 min,干吹1 min,解析0.5 min,頂空瓶壓力40 psi,色譜柱壓力12 psi,解析壓力15 psi,頂空出口分流。
GC 條件:50 ℃保持5 min,以3 ℃/min 升至125 ℃,保持2 min,以5 ℃/min 升至180 ℃,保持3 min,以15 ℃/min 升至230 ℃,保持5 min。載氣(He),純度>99.999%。
MS 條件:電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃,質(zhì)譜傳輸線溫度250 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z 45~500。
1.2.4 定性分析 在GC-MS 條件下,測得紅茶香氣成分GC-MS 總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖。通過NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫對總離子流量圖的各峰質(zhì)譜圖依照保留時(shí)間、相關(guān)特征離子、相對豐度等匹配檢索。以匹配度大于800 為鑒定依據(jù),并參照每種香氣成分的CAS 編號,再與相關(guān)文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,最終確定化合物。揮發(fā)物含量采用峰面積歸一化法計(jì)算。
使用軟件SIMCA 和Metaboanalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行OPLS-DA、HCA 等多元統(tǒng)計(jì)分析。使用Metware Cloud(https://cloud.metware.cn/)進(jìn)行箱線圖分析。使用SPSS 26 進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析不同茶葉樣品的差異。采用Excel 計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
從外形上看,傳統(tǒng)工夫紅茶身披金毫并且條索松散,而高香紅茶無金毫、外觀更油潤。香氣上,傳統(tǒng)工夫紅茶有焦糖香、甜而持久,而高香紅茶則有更明顯的花香。在湯色方面,這兩種紅茶也有明顯的區(qū)別,高香紅茶的湯色更亮。在滋味上,工夫紅茶更甜更醇厚,而高香紅茶則較為收斂。葉底則相似,均為肥厚柔軟。
2.2.1 電子鼻傳感器響應(yīng)值的差異顯著性分析 電子鼻通過10 個(gè)傳感器對范圍廣泛的揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng),可獲得茶葉樣品較全面的香氣特征信息。傳統(tǒng)工夫紅茶和高香紅茶的電子鼻10 個(gè)傳感器響應(yīng)值的顯著性分析(表1)可見,傳統(tǒng)工夫紅茶所有傳感器響應(yīng)值均高于高香紅茶,其中S1、S2、S6、S9、S10 傳感器在不同風(fēng)味紅茶具有顯著性差異(<0.05),而S3、S4、S5、S7、S8 傳感器則不具有顯著性差異(>0.05)。兩種紅茶的E-nose 響應(yīng)值總和也具有顯著性差異。
表1 高香紅茶與傳統(tǒng)工夫紅茶的電子鼻傳感器響應(yīng)值的顯著性分析Table 1 Significance analysis of E-nose sensor response values of high aroma black tea and traditional congou black tea
2.2.2 電子鼻的OPLS-DA 分析 為進(jìn)一步研究不同風(fēng)味紅茶電子鼻各傳感器響應(yīng)值差異,進(jìn)行了OPLS-DA 多元統(tǒng)計(jì)分析(圖1A)。由圖1A 可見,高香紅茶和傳統(tǒng)工夫紅茶可以更清楚地區(qū)分開來,除HA-10-1 外高香紅茶主要集中在坐標(biāo)軸的第一、四象限,除TK-10-3 外傳統(tǒng)紅茶主要集中在坐標(biāo)軸的二、三象限。圖1B 為OPLS-DA 排列檢驗(yàn)200 次的交叉驗(yàn)證模型,證明了OPLS-DA 分析的合理性,其擬合參數(shù)X 為0.767,Y 為0.713,Q為0.641。Q回歸直線與Y 軸的截距均小于0,表明該OPLSDA 判別模型不存在過度擬合現(xiàn)象,模型較為可靠(=0.0262,Q=?0.187)。圖1C 所示為OPLS-DA的變量權(quán)重值(Variable important in projection,VIP),表明S5、S6、S7、S8、S10(VIP>1)對不同風(fēng)味紅茶區(qū)分起作用,S1、S2、S3、S4、S9(VIP<1)則相反。將電子鼻顯著性分析與VIP 值分析相結(jié)合,可以得出S6 和S10 傳感器在區(qū)分不同風(fēng)味紅茶中起到了關(guān)鍵作用(<0.05 且VIP>1)。
圖1 高香紅茶與傳統(tǒng)工夫紅茶揮發(fā)物電子鼻數(shù)據(jù)正交偏最小二乘判別分析Fig.1 OPLS-DA of volatile matter E-nose data of high aroma black tea and traditional congou black tea
2.3.1 揮發(fā)性香氣物質(zhì)鑒定和分析 由GC-MS 檢測出兩種紅茶樣品中含有78 種揮發(fā)性香氣物質(zhì),其中有22 種醇類、20 種醛類、7 種酯類、3 種酸類、3 種酮類、3 種呋喃類、19 種碳?xì)浠衔锖? 種含氮物質(zhì)(表2)。高香紅茶中含有72 種揮發(fā)性香氣物質(zhì),傳統(tǒng)工夫紅茶含有70 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)。僅存在于高香紅茶的8 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)為3-庚炔-1-醇、甲酸戊酯、反式-2-壬烯醛、乙酸葉醇酯、己酸己酯、古蕓烯、Δ-杜松烯和去氫白菖烯等,其中甲酸戊酯、古蕓烯和乙酸葉醇酯為果味,反式-2-壬烯醛、己酸己酯和去氫白菖烯為花味,3-庚炔-1-醇為青草味,Δ-杜松烯為木香;僅存在傳統(tǒng)工夫紅茶的6 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)為2-甲基戊醛、桃金娘醇、甜瓜醛、2-壬炔-1-醇、(Z)-6-壬烯醛、2-丁基辛酸等,其中2-甲基戊醛、甜瓜醛和(Z)-6-壬烯醛呈果香氣味,桃金娘醇為木香氣味;上述14 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)分別是高香紅茶和傳統(tǒng)工夫紅茶所特有的,推測這些揮發(fā)性香氣物質(zhì)對不同風(fēng)味紅茶香味差異有重要作用。
表2 GC-MS 鑒定出紅茶中的揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Volatile substances in black tea identified by GC-MS
由表3 可見,醇類、醛類、酯類和含氮物質(zhì)在不同風(fēng)味紅茶具有顯著性差異(<0.05),酸類、酮類、呋喃類和碳?xì)漕愇镔|(zhì)在不同風(fēng)味紅茶沒有顯著性差異(>0.05)。醇類是高香紅茶中最豐富的物質(zhì),占香氣質(zhì)量比例的41.12%;而醛類是傳統(tǒng)紅茶中最豐富的物質(zhì),占總物質(zhì)的37.38%(表3)。同時(shí),高香紅茶的揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量高于傳統(tǒng)紅茶(<0.05)。預(yù)測高香紅茶與傳統(tǒng)工夫紅茶呈現(xiàn)不同香型可能與醇類、醛類含量比例差異相關(guān)。
表3 紅茶揮發(fā)性香氣物質(zhì)的類別Table 3 Categories of volatile aroma substances of black tea
醇類揮發(fā)性香氣物質(zhì)多呈花果香,芳香閾值低,并常與其他成分產(chǎn)生倍增效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)檢測出22 種醇類揮發(fā)性化合物,高香紅茶、傳統(tǒng)工夫紅茶中醇類揮發(fā)性化合物分別占總揮發(fā)性物質(zhì)41.12%與19.07%。前人研究表明芳樟醇、芳樟醇氧化物是紅茶的花香的主要原因;正戊醇為氣味閾值較高的飽和醇,可能對風(fēng)味貢獻(xiàn)不大;葉醇與3-庚炔-1-醇有強(qiáng)烈的新鮮草葉的綠色草香味,給紅茶帶來青香;香芹醇也有類似于留蘭香氣味,給高香紅茶帶來花香。因此,推測醇類揮發(fā)性化合物對高香紅茶香氣特征的形成起到了關(guān)鍵作用。
醛類揮發(fā)性香氣物質(zhì)主要由脂肪氧化產(chǎn)生,其氣味閾值較低,多呈果香和花香,并可與其它成分間產(chǎn)生倍增效應(yīng),在賦予紅茶香氣中的作用較大。實(shí)驗(yàn)檢測出20 種醛類揮發(fā)性化合物,高香紅茶、傳統(tǒng)工夫紅茶中醛類揮發(fā)性香氣物質(zhì)分別占總揮發(fā)性物質(zhì)21.59%與37.38%。傳統(tǒng)工夫紅茶中醛類權(quán)重最大,這與高香紅茶有明顯區(qū)分,因此推測醛類物質(zhì)對傳統(tǒng)工夫紅茶香氣特征形成起到了關(guān)鍵作用。許鵬麗等認(rèn)為5~9 個(gè)碳原子的醛具有油脂香,分子量較高的醛具有橙皮味,支鏈醛具有愉快的甜味或果味特征;(E,E)-2,4-庚二烯醛由亞麻酸氧化形成,呈青香,是兩種風(fēng)味紅茶的關(guān)鍵呈香成分;甜瓜醛、-環(huán)檸檬醛為茶葉提供清爽的果香;苯甲醛的呈香特性一般為典型的杏仁香;正戊醛、正己醛、庚醛、正辛醛、癸醛和反-2-辛烯醛等脂肪醛類是茶葉中呈現(xiàn)花果香的主要物質(zhì)。
酯類揮發(fā)性香氣物質(zhì)主要與茶葉發(fā)酵和脂肪酸代謝相關(guān),酯類大多呈持久強(qiáng)烈的果香。實(shí)驗(yàn)檢測出7 種酯類揮發(fā)性香氣物質(zhì),其中甲酸戊酯、乙酸葉醇酯、己酸己酯是高香紅茶特有的香氣化合物,具有花香與果香。水楊酸甲酯具有獨(dú)特的花香,被認(rèn)為是茶葉中的一個(gè)重要的芳香化合物。茶葉中酯類揮發(fā)性香氣物質(zhì)相對含量較少,但可能與其他揮發(fā)性化合物共同構(gòu)成了紅茶特有的花果香。
實(shí)驗(yàn)檢測出19 種碳?xì)漕悡]發(fā)性香氣物質(zhì),其中包括為烷烴、烯烴以及芳香烴類等。蘇東民等認(rèn)為烴類化合物具有較高的芳香閾值,對風(fēng)味幾乎沒有貢獻(xiàn);而檸檬烯是形成清香型茶葉的主要揮發(fā)物之一;葡萄糖的熱降解、類胡蘿卜素的熱降解,以及受到環(huán)境污染均可能導(dǎo)致茶葉含有甲苯;雪松烯、Δ-杜松烯為紅茶提供木質(zhì)味。實(shí)驗(yàn)檢測出酸類揮發(fā)性香氣物質(zhì)共3 種,含量較低,而酸類物質(zhì)可呈現(xiàn)出一種不愉快的氣味,在加工過程中應(yīng)盡量降低這類物質(zhì)的含量。檢測出3 種酮類物質(zhì),但其含量低,對茶葉的香氣影響較小。檢測出3 種呋喃類化合物,可能是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物,多數(shù)呈現(xiàn)強(qiáng)烈的甜香和焦香。傳統(tǒng)工夫紅茶中2-戊基呋喃和其他呋喃類物質(zhì)的含量均高于高香紅茶,可能是傳統(tǒng)工夫紅茶呈現(xiàn)甜香特征的香氣物質(zhì)。只檢測出1 個(gè)含氮化合物,其香氣特征未知,因含量甚低,其對紅茶香氣影響可不予考慮。
2.3.2 不同風(fēng)味紅茶共有揮發(fā)性香氣物質(zhì)顯著性分析 從78 種揮發(fā)性香味物質(zhì)中選出31 種共有的揮發(fā)性香味物質(zhì)(表4)。其中23 種在兩類紅茶中具有顯著性差異(<0.05),包括8 種醇類、2 種醛類、1 種酯類、2 種酮類、1 種呋喃類、8 種碳?xì)浠衔锖? 種含氮化合物等。推測紅茶呈現(xiàn)不同香型可能與醇類、醛類和碳?xì)漕惢衔锵嚓P(guān)。
表4 紅茶中共有31 種揮發(fā)性物質(zhì)顯著性Table 4 Significance of 31 volatile compounds in black tea
2.3.3 不同風(fēng)味紅茶共有揮發(fā)性香氣物質(zhì)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析 為全面了解揮發(fā)性香氣物質(zhì)對區(qū)分不同風(fēng)味紅茶的作用,以及揮發(fā)性化合物的分布差異,對不同風(fēng)味紅茶共有揮發(fā)性香氣物質(zhì)的組成進(jìn)行OPLSDA 分析(圖2A)。由圖2A 可見,樣品可被很好地識別,表明不同風(fēng)味紅茶的揮發(fā)性物質(zhì)的組成有明顯差異。圖2B 是基于不同風(fēng)味紅茶31 種共有揮發(fā)性物質(zhì) OPLS-DA 交叉驗(yàn)證結(jié)果,Q為0.902 以及RY 為0.91 且兩者<0.05,表明該OPLS-DA 判別模型可靠。圖2C 所示為OPLS-DA 的VIP 值,揮發(fā)性香氣物質(zhì)VIP 值大于1 對紅茶的鑒別起作用,可見,有11 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)(VIP>1)對不同風(fēng)味紅茶區(qū)分起作用。
圖2 紅茶揮發(fā)物31 種共有揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS 數(shù)據(jù)正交偏最小二乘判別分析Fig.2 OPLS-DA of 31 common volatile substances of GC-MS data for volatiles of black tea|
基于紅茶31 種共有揮發(fā)物香氣物質(zhì)的層次聚類結(jié)果(圖3)顯示,20 份樣品聚集為兩類。說明共有揮發(fā)物香氣物質(zhì)對區(qū)分不同風(fēng)味紅茶起到了重要作用。A 區(qū)化合物常表現(xiàn)為花香、果香和芳香,但HA-2、HA-6 和HA-10 樣品在A 區(qū)中相對含量比其他高香紅茶樣品低。B 區(qū)化合物主要表現(xiàn)為青草味、果香、甜香和焦香,在傳統(tǒng)工夫紅茶中相對含量較高,TK-3、TK-5 和TK-6 樣品中3-甲基-4-戊醇、3-庚炔-1-醇、2-已烯醛、庚醛等的相對含量較低;TK-5 和K-6 樣品中的2,5,5-三甲基-1-己烯-3-炔、正己醛、庚醛、O-癸基羥胺、2-丁基辛醇和2-(2E)-2-戊基呋喃等的相對含量較低,這導(dǎo)致茶葉香氣淡薄。綜上分析,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)的同類風(fēng)味紅茶香氣成分有顯著的差異,可能由于茶樣地理分布不同所導(dǎo)致的,說明除品種外,產(chǎn)區(qū)也是影響茶葉香氣形成的因素。
圖3 紅茶31 種共有揮發(fā)性物質(zhì)的熱圖及層次聚類圖Fig.3 Heatmap and HCA of 31 common volatile substances of black tea
2.3.4 紅茶關(guān)鍵揮發(fā)性香氣物質(zhì)篩選與分析 將揮發(fā)性香氣物質(zhì)顯著性分析與VIP 值分析相結(jié)合后,可篩選出的10 種關(guān)鍵揮發(fā)性香氣物質(zhì)(<0.05 且VIP 值>1)的箱線圖(圖4),包括正戊醇、2-環(huán)丙基乙醇、氧化芳樟醇、芳樟醇、香芹醇、β-環(huán)檸檬醛、水楊酸甲酯、2-戊基呋喃、對薄荷-1,3,8-三烯和1,4-戊二烯等。由圖4 可見,高香紅茶有9 個(gè)化合物的相對含量高于傳統(tǒng)工夫紅茶,僅2-乙基呋喃相反;2-乙基呋喃可能是高溫干燥階段產(chǎn)生的,其在傳統(tǒng)工夫紅茶的含量遠(yuǎn)高于高香紅茶,這可能與工夫紅茶發(fā)酵程度比高香紅茶更重有關(guān),這也為傳統(tǒng)工夫紅茶提供甜香和焦香的物質(zhì)基礎(chǔ);芳樟醇、氧化芳樟醇和水楊酸甲酯是紅茶中重要的香氣物質(zhì),為紅茶提供花香的特征。由感官審評可知,高香紅茶呈花香、傳統(tǒng)工夫紅茶呈甜香,與本研究結(jié)果一致。
圖4 10 種顯著揮發(fā)性物質(zhì)箱線圖Fig.4 Boxplot of 10 significant volatile substances
高香紅茶呈花香、傳統(tǒng)工夫紅茶呈甜香。兩類紅茶檢測出香氣物質(zhì)的相對含量和比例存在差異,但均以醇類和醛類化合物為主;高香紅茶醇類含量顯著高于醛類,而傳統(tǒng)工夫紅茶醛類含量顯著(<0.05)高于醇類,推測醇類與醛類是紅茶香氣特征的重要因素。本研究檢測獲得的香氣物質(zhì)特征與感官審評一致。因受樣本數(shù)量、地域限制,不同風(fēng)味紅茶識別模型構(gòu)建尚存不足。今后可通過擴(kuò)大樣品范圍、構(gòu)建紅茶香氣指紋圖譜模型,判斷不同風(fēng)味紅茶香氣物質(zhì)的差異程度,而本次研究獲得的紅茶香氣物質(zhì)有助于今后不同風(fēng)味紅茶識別模型的建立。