南瓜皮多糖鋅的制備及生物利用率研究

董淑君，張禧慶，劉旭龍，馬越 ，鄭振佳，姜高飛

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與食品營養(yǎng)研究所，果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜采后處理重點實驗室，北京 100097；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安 271018；3.山東杰諾檢測服務(wù)有限公司，山東煙臺 265200；4.萊陽孟宇食品有限公司，山東煙臺 265200）

多糖是南瓜中的重要活性物質(zhì)，含量約為5.7%，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抑菌、抗腫瘤等多種生物活性。南瓜皮是南瓜加工過程中的副產(chǎn)品，加工過程中產(chǎn)生量約占南瓜總質(zhì)量的10%～40%，通常當(dāng)作廢棄物處理。從南瓜皮中提取南瓜皮多糖可以提高南瓜資源的綜合利用，增加南瓜的附加值。南瓜皮多糖屬于酸性多糖，糖鏈中含有羧基、羥基等配位基團(tuán)，具有表面螯合能力，能與金屬離子以配位鍵結(jié)合生成螯合物。目前對南瓜多糖的研究主要集中在提取、結(jié)構(gòu)解析、改性修飾以及活性評價，其中改性修飾主要包括南瓜多糖的硫酸酯化、磷酸酯化和硒化修飾。

鋅是人體必需的微量元素之一，能夠提高機體免疫力，具有促進(jìn)生長發(fā)育、殺菌抗炎、抗氧化、提高大腦功能、參與酶調(diào)節(jié)和基因表達(dá)等多種生理功能。人體對鋅的儲存能力不高，需要從外界獲取以穩(wěn)定體內(nèi)環(huán)境。無機鋅在人體中的吸收利用率低且對腸胃具有刺激作用，因此開發(fā)高利用率、低刺激性的新型鋅補充劑尤為重要。將多糖與鋅進(jìn)行螯合得到多糖鋅，可解決無機鋅與食物中的植酸、草酸等化合物結(jié)合生成沉淀的問題，且利用率高、穩(wěn)定性好，具有腸道益生作用，在攝入益生元的同時實現(xiàn)補鋅目的?，F(xiàn)報道的多糖鋅研究主要集中在工藝優(yōu)化及其活性評價，涉及的多糖來源主要包括大米胚芽、金針菇、孔石莼、灰樹花、光帽鱗傘菌絲體、肉蓯蓉、豬苓和蛹蟲草基質(zhì)，對南瓜皮多糖與鋅的螯合工藝及生物利用率研究尚未見報道。

本研究以南瓜皮為原料提取多糖，利用金屬螯合法制備南瓜皮多糖鋅，采用響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，并研究產(chǎn)物的生物利用率，開發(fā)具有腸道益生作用的新型補鋅劑，減少南瓜資源的浪費，提高南瓜皮的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜皮 品種為愛碧斯，山東省萊陽市孟宇食品有限公司；七水合硫酸鋅 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鋅標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000 μg/mL）國家檢驗認(rèn)證有限公司；鹽酸（優(yōu)級純）、氫氧化鈉（分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硝酸 優(yōu)級純，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；人工胃液、人工腸液 福州飛凈生物科技有限公司；透析袋 怡康科貿(mào)生物試劑耗材實驗有限公司。

7800 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）美國安捷倫科技公司；SECURA224-ICN 電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；S210 pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司；Multiwave PRO 微波消解儀奧利地安東帕公司；DKZ-2B 水浴恒溫振蕩器 上海一恒科技儀器有限公司；FD-304 冷凍干燥機 濟(jì)南駿德儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜皮多糖的提取 采用熱水浸提法從南瓜皮中提取多糖。取1 kg 鮮南瓜皮切碎，以1:12 的料液比加入去離子水，85 ℃的熱水浸提兩次，過濾，濾液濃縮后用4 倍體積的無水乙醇醇沉，靜置，5000 r/min 離心10 min 得南瓜皮粗多糖。Sevag 溶液（氯仿:正丁醇=4:1）脫蛋白，重復(fù)操作3～4 次至中間無變形蛋白層，濃縮后醇沉，5000 r/min 離心10 min，凍干得到南瓜皮多糖。苯酚-硫酸法測定多糖含量為74.78%。

1.2.2 南瓜皮多糖鋅的制備工藝 采用硫酸鋅法制備多糖鋅。稱取一定質(zhì)量的南瓜皮多糖溶于去離子水中，與一定濃度的鋅溶液等體積混合，設(shè)計不同的反應(yīng)質(zhì)量比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH 后于恒溫水浴振蕩反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束用4 倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，5000 r/min 離心10 min，上清液保存?zhèn)溆?，將沉淀?fù)溶后用500 Da 的透析袋透析48 h，冷凍干燥得到南瓜皮多糖鋅。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比對螯合率的影響固定鋅的濃度為0.4 g/L，南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比分別為1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1，反應(yīng)時間為100 min，反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)pH7，按“1.2.2”進(jìn)行操作，考察多糖與鋅的質(zhì)量比對螯合率的影響。

1.2.3.2 反應(yīng)時間對螯合率的影響 固定鋅的濃度為0.4 g/L，南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比為5:1，反應(yīng)pH7，反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時間分別為50、100、150、200、250 min，按“1.2.2”進(jìn)行操作，考察反應(yīng)時間對螯合率的影響。

1.2.3.3 反應(yīng)溫度對螯合率的影響 固定鋅的濃度為0.4 g/L，南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比為5:1，反應(yīng)時間為100 min，反應(yīng)pH7，反應(yīng)溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，按“1.2.2”進(jìn)行操作，考察反應(yīng)溫度對螯合率的影響。

1.2.3.4 反應(yīng)pH 對螯合率的影響 固定鋅的濃度為0.4 g/L，南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比為5:1，反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時間為100 min，反應(yīng)pH 分別為5、6、7、8、9、10、11，按“1.2.2”進(jìn)行操作，考察反應(yīng)pH 對螯合率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以南瓜皮多糖螯合鋅的螯合率為響應(yīng)值，以南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH 為自變量，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗。采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計分析軟件建立Box-Behnken 模型，對螯合反應(yīng)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 南瓜皮多糖鋅中鋅元素的測定

1.2.5.1 鋅標(biāo)曲的繪制 利用鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL 的鋅溶液。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定，以鋅元素的濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)信號值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.989X+0.0072，R=0.9998。

ICP-MS 相關(guān)參數(shù)如下：射頻功率1550 W，等離子體氣體流速15 L/min，輔助氣體流速0.9 L/min，蠕動泵轉(zhuǎn)速0.1 rps，霧化室溫度2 ℃，采樣深度8 mm。

1.2.5.2 螯合率的計算 采用2%的硝酸稀釋上清液，ICP-MS 測定鋅離子的含量，按照下式計算南瓜皮多糖鋅的螯合率：

式中：C表示混合液中鋅離子的初始濃度，μg/mL；C表示反應(yīng)后上清液中鋅離子的濃度，μg/mL。

1.2.5.3 鋅含量的測定 稱取南瓜皮多糖鋅0.02 g，按照表2 設(shè)定的升溫程序消解樣品，消解后冷卻至室溫將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶，去離子水定容，保存?zhèn)溆?，ICP-MS 測定鋅含量。

表2 微波消解升溫程序Table 2 Temperature rise procedure of microwave digestion

1.2.6 南瓜皮多糖鋅的生物利用率 參照文獻(xiàn)[32?34]方法并稍作修改，通過體外模擬胃腸道消化法對螯合物南瓜皮多糖鋅的生物利用率進(jìn)行評價。

1.2.6.1 模擬胃液消化 分別配制5 mg/mL 的南瓜皮多糖鋅和8.9 mg/mL 七水合硫酸鋅溶液，添加1 mol/L 的HCl 使pH 達(dá)到2.0 左右，加入等體積的模擬人工胃液，混合均勻，37 ℃振蕩，分別反應(yīng)0、30、60、90、120、150、180、210、240 min 后，在95 ℃水浴中滅酶處理10 min，于4 ℃條件下保存，備用。

1.2.6.2 模擬腸液消化 分別將“1.2.6.1”中模擬胃消化120 min 的樣品混合物和無機鋅混合物取出，用1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，加入等體積的模擬人工腸液，混合均勻，將混合物轉(zhuǎn)移到透析袋中，37 ℃振蕩，分別反應(yīng)1、2、4、6、8 h 后，在95 ℃水浴中滅酶處理10 min，于4 ℃條件下保存，備用。

1.2.6.3 溶解率的測定 分別取胃液、腸液的消化液來測定南瓜皮多糖鋅的溶解率。在“1.2.6.1”和“1.2.6.2”的消化液中加入4 倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，5000 r/min 離心10 min 后取上清液，ICPMS 測定鋅含量，按照下式計算溶解率：

式中：C表示反應(yīng)后上清液中鋅離子的濃度，μg/mL；F 表示樣品中鋅的含量，μg/mL。

1.2.6.4 透析率的測定 在腸液消化的過程中，按照1、2、4、6、8 h 時間段依次取樣，ICP-MS 測定，按照下式計算鋅離子的透析率：

式中：E 表示透析液中鋅的濃度，μg/mL；V 表示透析液的體積，mL；F 表示樣品中鋅的含量，μg/g；M 表示樣品的質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均重復(fù)3 次，利用Design Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；采用Origin 2017 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比對螯合能力的影響由圖1 可知，隨著多糖與鋅質(zhì)量比的增加，螯合能力不斷上升。當(dāng)質(zhì)量比超過20:1 后，螯合率的增勢趨于平緩，可達(dá)到98%左右，原因可能是隨多糖比例的增加，為Zn提供了足夠的結(jié)合位點，螯合率逐漸上升。隨著多糖濃度的提高，體系粘度增加，不利于結(jié)合位點的暴露，螯合率下降。

圖1 質(zhì)量比對螯合率的影響（n=3）Fig.1 Effect of the mass ratio on the chelation rate (n=3)

2.1.2 反應(yīng)時間對螯合能力的影響 由圖2 可知，隨著反應(yīng)時間的增加，螯合率逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時間為100 min 時達(dá)到最大值79.28%，之后螯合率迅速下降。這可能是因為隨著反應(yīng)時間的延長，體系穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致部分螯合物出現(xiàn)了解離的現(xiàn)象。

圖2 反應(yīng)時間對螯合率的影響（n=3）Fig.2 Effect of the reaction time on the chelation rate (n=3)

2.1.3 反應(yīng)溫度對螯合能力的影響 由圖3 可知，反應(yīng)溫度對螯合率的影響較小。隨著溫度的升高，螯合率逐漸上升，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時，螯合率達(dá)到最大值79%。當(dāng)反應(yīng)溫度超過60 ℃以后螯合率開始下降。推測因為溫度的升高會促進(jìn)分子的運動，雖然有利于結(jié)合位點的暴露，但是溫度過高時，解離速度高于螯合速度，不利于多糖與Zn的螯合。結(jié)果顯示，溫度對螯合率的影響較小，因此可作為次要考慮因素，不作為響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)。

圖3 反應(yīng)溫度對螯合率的影響（n=3）Fig.3 Effect of the reaction temperature on the chelation rate (n=3)

2.1.4 反應(yīng)pH 對螯合能力的影響 由圖4 可知，隨著pH 的增加，螯合率不斷上升。當(dāng)pH 為9 時達(dá)到最大值99.4%，之后螯合率開始下降。推測因在偏酸性條件下，Zn與多糖解析速度高于螯合速度；隨著pH 的增加，螯合率提高；pH 超過11 后反應(yīng)體系有略渾濁現(xiàn)象，可能因為部分Zn會和OH生成沉淀，導(dǎo)致Zn損失。

圖4 反應(yīng)pH 對螯合率的影響（n=3）Fig.4 Effect of the reaction pH on the chelation rate (n=3)

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析 采用Design Expert 8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到螯合率（Y）對南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比（A）、反應(yīng)時間（B）和反應(yīng)pH（C）的三元二次回歸方程為Y=99.49?0.46A+0.13B+0.18C+0.078AB?0.2AC+0.19BC?1.31A?0.77B?1.39C。響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Response surface test results

由表4 可知，該模型差異性顯著（<0.0001），失擬項不顯著（>0.05），說明此模型的擬合度較好；決定系數(shù)為0.9875，說明螯合率的試驗值和模擬回歸值具有很好的一致性；校正后決定系數(shù)為0.9713，說明該回歸方程可信度較高，能夠反應(yīng)97.13%的響應(yīng)值變化。因此該模型的可信度和擬合度均較高，可以利用該模型對南瓜皮多糖鋅的螯合能力進(jìn)行預(yù)測和分析。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

回歸模擬一次項A，二次項A、B、C對螯合作用影響顯著（<0.0001），一次項C 對螯合作用影響顯著（<0.05），一次項B，交互項AB、AC 和BC對螯合率的影響不顯著，可將其從回歸模型中刪除。最終確定回歸模型為Y=99.49?0.46A+0.18C?1.31A?0.77B?1.39C。因此，各因素對響應(yīng)面的影響并不是簡單的線性關(guān)系，值可以反映出各個因素對螯合率的影響程度。本試驗中螯合率的影響因素排序為多糖與鋅質(zhì)量比>反應(yīng)pH>反應(yīng)時間。

2.2.2 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)曲面圖可以形象地描述各因素之間的交互作用，各因素交互作用對螯合率的影響見圖5。圖5A 為固定反應(yīng)pH 的編碼水平為零，考察南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比和反應(yīng)時間的交互作用對螯合率的影響。此條件下，等高線形狀呈圓形，等高線稀疏，說明反應(yīng)質(zhì)量比和反應(yīng)時間的交互作用對螯合率的影響較弱。當(dāng)反應(yīng)質(zhì)量比達(dá)到最優(yōu)時，隨著反應(yīng)時間的增加，螯合率趨于穩(wěn)定。當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到最優(yōu)時，螯合率隨著反應(yīng)質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明反應(yīng)質(zhì)量比對螯合率的影響大于反應(yīng)時間。圖5B 為固定反應(yīng)時間的編碼水平為零，考察南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比和反應(yīng)pH 的交互作用對螯合率的影響。對應(yīng)的等高線形狀呈橢圓形，三維圖傾斜面大，說明兩者的交互作用對螯合率影響較大。隨著反應(yīng)質(zhì)量比和反應(yīng)pH 的增加，螯合率逐漸上升，當(dāng)反應(yīng)質(zhì)量比超過20:1，反應(yīng)pH 超過9 后，螯合率開始下降。圖5C 為固定南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比的編碼水平為零，考察反應(yīng)時間和反應(yīng)pH 交互作用對螯合率的影響。等高線形狀呈橢圓形，說明兩者的交互作用對螯合率影響較大。當(dāng)反應(yīng)pH 達(dá)到最優(yōu)時，隨著反應(yīng)時間的增加，螯合率趨于穩(wěn)定。當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到最優(yōu)時，螯合率隨著反應(yīng)pH 的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明反應(yīng)pH 對螯合率的影響大于反應(yīng)時間。

圖5 各因素交互作用對南瓜皮多糖鋅螯合能力影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the effects of each factor interaction on polysaccharide zinc chelation ability in pumpkin skin

2.2.3 回歸模型驗證 結(jié)合Design Expert 8.0.6 軟件分析可得最佳的螯合條件為：南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比為18.19:1，反應(yīng)時間為104.29 min，反應(yīng)pH 為9.09 時，螯合率達(dá)到最大值為99.55%。為考慮實際生產(chǎn)需要，選擇以下條件進(jìn)行驗證：南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比為18:1，反應(yīng)時間為104 min，反應(yīng)pH 為9，在此條件下實際得到的南瓜皮多糖鋅螯合率為99.37%±0.12%，與預(yù)測值相差較小為0.18%，說明該工藝穩(wěn)定可靠，可用于生產(chǎn)，ICP-MS 測定南瓜皮多糖鋅中鋅含量約為23.17±0.05 mg/g。

2.3 生物利用率分析

2.3.1 南瓜皮多糖鋅在胃中的釋放情況 多糖鋅的溶解率隨時間的增加呈現(xiàn)出上升趨勢，溶解率最高為12.76%，無機鋅在胃中的溶解率比較穩(wěn)定，結(jié)果見圖6。在消化初期（0～60 min），無機鋅中鋅離子的溶解率為48.4%，多糖鋅中鋅離子的溶解率為9.22%，在消化中后期，無機鋅的溶解率為50.52%遠(yuǎn)高于多糖鋅的溶解率12.76%，說明多糖鋅對Zn釋放效果平緩，刺激性可能小于無機鋅。這與闞文翰對螯合鋅在胃中Zn的溶解率結(jié)論相似，說明多糖鋅受胃液的酸化環(huán)境影響不大。整個消化過程中，無機鋅的溶解率維持在50%左右，推測可能是因為無機鋅與胃中的蛋白類物質(zhì)結(jié)合，部分鋅以結(jié)合態(tài)存在，導(dǎo)致游離鋅離子濃度下降。

圖6 體外模擬胃腸道消化中鋅離子溶解率的比較Fig.6 Comparison of zinc release rate in simulated gastrointestinal digestion in vitro

2.3.2 南瓜皮多糖鋅在腸中的釋放情況 多糖鋅在腸中溶解率比較穩(wěn)定，維持在2%左右，無機鋅在腸中的溶解率隨著時間的延長呈現(xiàn)出降低的趨勢，結(jié)果見圖7。在消化后期，南瓜皮多糖鋅和無機鋅的溶解率分別為2.18%和0.13%。腸液環(huán)境中無機鋅的溶解率明顯降低，推測可能是腸道的弱堿性環(huán)境使釋放出的Zn易生成沉淀，導(dǎo)致兩者的溶解率下降，多糖鋅中由于具有多糖的保護(hù)作用，使其在腸道中的溶解率高于無機鋅。這與柯梟等研究的螯合鋅在腸道中Zn的溶解率結(jié)論相似。

圖7 體外模擬腸道消化中鋅離子溶解率的比較Fig.7 Comparison of zinc release rate in simulated intestinal digestion in vitro

2.3.3 南瓜皮多糖鋅的透析率 多糖鋅和無機鋅在胃中的透析率均隨著時間的增加而增加，8 h 后南瓜皮多糖鋅及無機鋅的透析率分別為16.59%和0.56%，無機鋅的透析率趨于穩(wěn)定，南瓜皮多糖鋅的透析率增幅較大，結(jié)果見圖8。推測可能是因為鋅的主要吸收部位在腸道，在弱堿性的環(huán)境下，釋放出的Zn容易生成Zn（OH）或者其它沉淀，無法透過透析袋；多糖環(huán)境對鋅具有一定保護(hù)作用，不容易生成沉淀，因此多糖鋅的生物利用率高于無機鋅。綜上表明，與無機鋅相比，南瓜皮多糖鋅的生物利用率和穩(wěn)定性更高。

圖8 體外模擬腸道消化中鋅離子透析率的比較Fig.8 Comparison of zinc ion dialysis rate in simulated intestinal digestion in vitro

3 結(jié)論

在南瓜皮多糖鋅的制備過程中，各因素對螯合率的影響大小為：反應(yīng)質(zhì)量比>反應(yīng)pH>反應(yīng)時間。通過響應(yīng)面法優(yōu)化后得到最佳制備工藝為：南瓜皮多糖與鋅質(zhì)量比18:1，反應(yīng)時間104 min，反應(yīng)pH9，此時螯合率能達(dá)到99.37%±0.12%，在此條件下制備的南瓜皮多糖鋅的鋅含量約為23.17±0.05 mg/g。體外消化模擬試驗表明：南瓜皮多糖鋅受胃的酸化環(huán)境影響較小，在胃中的溶解率較低，但在腸道中的溶解率和透析率均明顯高于無機鋅，可以證明多糖鋅具有較好的生物利用率和穩(wěn)定性。本研究為開發(fā)兼具補鋅和腸道益生作用的新型補鋅劑提供了理論依據(jù)。