響應面優(yōu)化雞油菌多酚的超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性

胡棟寶 ，黃淑佩，祝曉慧，施偉兵

（1.玉溪師范學院化學生物與環(huán)境學院，云南玉溪 653100；2.玉溪市食品藥品檢驗所，云南玉溪 653100）

雞油菌（）又名黃絲菌、杏菌，是一種外生菌根真菌，屬真菌界擔子菌綱雞油菌科雞油菌屬真菌。雞油菌富含多糖、酚類、揮發(fā)油、氨基酸、抗真菌蛋白等多種生理活性成分，是全球六大菌根性食用菌之一。雞油菌的食用與藥用價值都很高，具有明目、抗腫瘤、治療心血管疾病、抗病毒、抗氧化、抗菌等作用。多酚類化合物含有酚羥基，是雞油菌抗氧化活性的主要成分之一。

一般來說，多酚的提取方法主要有傳統(tǒng)提取法和現(xiàn)代提取法兩種。傳統(tǒng)的提取方法有索氏提取、熱回流提取和浸漬提取，現(xiàn)代提取技術主要有微波輔助、超聲輔助和加速溶劑提取。傳統(tǒng)提取法具有耗時長、能耗大、提取率低等缺點，超聲波輔助提取技術（ultrasound-assisted extraction，UAE）因其具有提取時間短、有機溶劑用量少、目標成分提取率高等優(yōu)點而越來越多地受到人們的關注。目前，關于雞油菌多酚的響應面優(yōu)化提取分析的研究還鮮有報道。

本研究通過響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取雞油菌中的多酚，并將結果與傳統(tǒng)的浸提法與索氏提取法作比較，通過超高效液相色譜質譜技術UPLC-MS 分析鑒定雞油菌中所包含的單體多酚，采用體外DPPH自由基清除等三種試驗進一步探究了雞油菌體外抗氧化活性，旨在為該種食用菌資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞油菌 云南省玉溪市；福林酚試劑 國藥集團；兒茶素、迷迭香酸、丁香酸、槲皮素、綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸標準品 北京盛世康普化工技術研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國Sigma 公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）成都艾科達化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純 西隴科學股份有限公司。

4500 QTRAP LC-MS 三重四級桿液質聯(lián)用儀美國AB SCIEX 公司；TGL-10B 高速臺式離心機上海安亭科學儀器廠；電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；臺式加熱超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司；UV-2700 紫外分光光度計 日本島津；TG16-WS 臺式高速離心機 湘儀集團；pH838 酸度計 ?，攦x器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞油菌多酚的提取工藝流程及操作要點 在室溫下，將干燥粉碎至恒重的雞油菌樣品過20 目篩，放置?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。稱取一定量的雞油菌粉末，加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液，在超聲功率150 W 條件下，在不同的料液比、溫度、時間下進行提取，在高速離心機中以6000 r/min 的速度離心10 min，從離心管上端取出無沉淀的上清液，即為雞油菌多酚提取液。

1.2.2 單因素實驗 準確稱取0.5000 g 雞油菌粉末，固定條件料液比1:30 g/mL，超聲溫度，乙醇濃度50%，超聲時間20 min，分別考察料液比（1:20、1:25、1:30、1:35、1:40（g/mL））、超聲溫度（30、35、40、45、50 ℃）、乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）對雞油菌多酚含量的影響，以上實驗每組平行三次。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗基礎上，采用Design-Expert.12 軟件中的Box-Behnken 設計四因素三水平試驗。以雞油菌多酚含量為響應值，對實驗結果進行回歸優(yōu)化，找到最佳提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors levels design of Box-Behnken test

1.2.4 雞油菌多酚含量的測定 精密稱取沒食子酸標準品0.0050 g，溶解定容，得濃度0.01 mg/mL 的標準溶液。分別移取上述標液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL 于25 mL 的比色管中，加入去離子水15.00 mL，分別加入0.3 mL 福林酚試劑，搖勻，靜置10 min，加入10%的NaCO溶液2.0 mL，定容，室溫下避光放置1 h，以不加標液的去離子水15.00 mL 為空白對照，在760 nm 下測定吸光值，平行三次取平均值；以標液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=88.156x+0.0038，=0.9994。取雞油菌多酚提取液0.3 mL于25 mL 比色管，分別加入10 mL 去離子水、0.3 mL福林酚試劑，靜置10 min，加入2.0 mL10%的碳酸鈉溶液，定容，避光靜置1 h，于760 nm 處測定吸光度值，計算雞油菌多酚含量。

雞油菌多酚含量(mg/g)=(C×V×N)/(M×1000)

式中C：雞油菌多酚的質量濃度，mg/mL；V：提取液體積，mL；N：稀釋倍數(shù)；M：雞油菌粉末質量，g。

1.2.5 不同方法提取雞油菌多酚的比較

1.2.5.1 超聲輔助提取法 在料液比1:32（g/mL）、提取溫度40 ℃、乙醇濃度40 %、超聲時間21 min優(yōu)化條件下提取雞油菌多酚，計算多酚含量。

1.2.5.2 浸泡提取法 分別稱取5.0000 g 雞油菌3 份，置于三個錐形瓶中，分別加入40%的乙醇溶液200 mL，搖勻，置于暗處，封上保鮮膜，反應24 h，將混合液離心20 min 得到提取液，計算多酚含量。

1.2.5.3 索式熱回流提取 準確稱取雞油菌3.0000 g，定性濾紙包好放入索式提取器中，加入120 mL 40%的乙醇溶液，加熱至95 ℃，加熱回流4 h 得提取液，計算多酚含量。

1.2.6 雞油菌多酚提取物成分分析 以沒食子酸、咖啡酸、槲皮素、迷迭香酸、原兒茶酸、綠原酸、丁香酸、兒茶素為標準品，以甲醇溶解配成濃度分別為0.515、0.510、0.515、0.520、0.515、0.530、0.520、0.500 mg/mL 的標準溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，8 種酚類化合物在線性范圍內線性關系良好（>0.99）。利用4500 QTRAP 三重四級桿液質聯(lián)用儀（AB SCIEX）對上述超聲輔助提取法優(yōu)化得到的雞油菌多酚提取物進行分析測定，計算樣品中各種酚類化合物的含量。

1.2.7 雞油菌多酚抗氧化性測定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除活性測定 準確稱取0.0200 g DPPH，定容，搖勻，得100 mmol∕L 溶液。將雞油菌多酚提取液干燥后的樣品分別在不同濃度（0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20 mg/mL）條件下，加入2.0 mL DPPH 溶液，避光靜置30 min，于517 nm 測定吸光度值A。分別移取剩余樣液2.0 mL，加入2.0 mL 40%的乙醇溶液，于517 nm 測定吸光度值A，以V作為陽性對照，平行測定3 次。

DPPH自由基清除率(%)=[1?(A?A)/A]×100

1.2.7.2 ABTS自由基清除活性測定 將雞油菌多酚提取液干燥后的樣品分別在不同樣品濃度（0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175 mg/mL）條件下，加入3.0 mL ABTS溶液，避光靜置6 min，于734 nm測定吸光度值A。分別移取剩余樣液2.0 mL，加入3.0 mL 40%的乙醇溶液，于734 nm 測定吸光度值A。以V作為陽性對照，平行測定3 次。

ABTS自由基清除率(%)=[1?(A?A)/A]×100

1.2.7.3 鐵離子還原能力 將雞油菌多酚提取液干燥后的樣品于不同濃度（0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20 mg/mL）條件下分別加入2.0 mL pH6.6 磷酸緩沖溶液和2.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴中加熱20 min，加入2.0 mL10%三氯乙酸溶液，加氯化鐵0.5 mL 溶液，避光靜置6 min 后于700 nm 處測定吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 料液比對雞油菌多酚含量的影響 由圖1 可知，在料液比1:20～1:40（g/mL）范圍內，雞油菌多酚含量隨料液比增大而逐漸增大，當料液比為1:30（g/mL）時，多酚含量達到最大，可能由于溶劑增多導致傳質推動力變大，雞油菌粉末與溶劑接觸面積增大，多酚溶出速率高。隨著料液比的增大，雞油菌多酚含量逐漸下降，可能由于多酚成分已大部分溶出，倘若繼續(xù)增加溶劑比例，會導致雜質增多從而抑制了多酚的析出，使其含量減少。因此，選擇最佳料液比為1:30（g/mL）。

圖1 料液比對雞油菌多酚含量的影響Fig.1 Effect of ratio of solid-liquid on polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.1.2 超聲溫度對雞油菌多酚含量的影響 由圖2可知，在超聲溫度30～50℃范圍內，雞油菌多酚含量隨超聲溫度的升高而逐漸增大，當溫度達到40 ℃，多酚含量達到最大，隨后多酚含量逐漸下降，可能在一定范圍內溫度的升高會加快分子間的運動程度，同時軟化樣品的細胞壁，繼而破壞其結構組成，使細胞內的多酚物質析出，但是溫度太高會破壞多酚結構從而影響其含量。因此，最佳超聲溫度選擇40 ℃。

圖2 超聲溫度對雞油菌多酚含量的影響Fig.2 Effect ofultrasonic temperature on polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.1.3 乙醇濃度對雞油菌多酚含量的影響 由圖3可知，在乙醇濃度20%～60%范圍內，雞油菌多酚含量隨乙醇濃度增大而逐漸增大，當乙醇濃度達到40%時，其多酚含量達到最大,可能原因是不同濃度的乙醇溶液所具有的極性存在差異，對多酚的溶解度不同，因而濃度在20%～40%范圍內多酚含量隨乙醇濃度的增大而增大，但如果濃度過高，會使脂溶性雜質變多從而抑制多酚的溶出，導致其含量降低。因此，最佳乙醇提取濃度選擇40%。

圖3 乙醇濃度對雞油菌多酚含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.1.4 超聲時間對雞油菌多酚含量的影響 由圖4可知，在超聲時間10～50 min 范圍內，雞油菌多酚含量隨超聲時間的延長而逐漸增大，并在20 min 時達到最大，20 min 后其含量逐漸下降，可能由于時間過長會使氧氣有更多機會與多酚物質發(fā)生氧化反應從而使多酚含量減少。因此，選擇最優(yōu)超聲時間為20 min。

圖4 超聲時間對雞油菌多酚含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.2 響應面優(yōu)化結果分析

2.2.1 響應面模型設計與分析 依據(jù)單因素實驗，由Box-Behnken 試驗設計原理，以料液比、超聲溫度、乙醇濃度及超聲時間4 個因素，共29 個試驗點進行分析，結果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

對Design-Expert.12 軟件表中數(shù)據(jù)進分析，建構出提取條件和多酚含量間的二次多項式模型為Y=12.25+0.1308A+0.1358B?0.0250C+0.1817D+0.0275 AB+0.0.0275AC+0.0275AD?0.1550BC+0.0400BD?0.0225CD?1.98A?0.8131B?0.7918C?0.9843D。各因素對響應值的影響程度可由上式各系數(shù)絕對值大小反映：模型的二次項系數(shù)均是負數(shù)，其拋面開口朝下，有極大值點，因此可對其優(yōu)化評價。對上述模型展開方差分析，結果見表3。

通常情況下，回歸方程各因素的顯著性可通過值和值進行檢驗，以揭示各變量間的相互作用，<0.05 說明建模成功。表3 表明，該模型呈極顯著（此時<0.0001），說明該模型有統(tǒng)計學意義；失擬項0.1971>0.05，呈不顯著，說明模型合適說明該模型擬合度好、實驗誤差?。粵Q定系數(shù)=0.9797，表明試驗研究的自變量（4 個單因素條件）與因變量（雞油菌多酚含量）的關系顯著；校正決定系數(shù)=0.9595，表明模型與試驗較為可靠，可解釋95.95%響應值變化。顯著性分析表明，一次項D 和二次項A、B、C、D對因變量影響極顯著（<0.01），一次項A、B 影響顯著（<0.05），其他交互項都無顯著影響（>0.05）。由值大小可知，各因素對樣液多酚含量的影響大致為：超聲時間（D）>溫度（B）>液料比（A）>乙醇濃度（C）。

表3 超聲提取法回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the constructed regression model by ultrasonic-assisted extraction

2.2.2 響應曲面分析 三維響應面圖是響應值對各影響因子所構成的曲面圖，可以直觀地判斷出不同影響因子交互作用對響應值的影響趨勢以及響應值的變化范圍。根據(jù)多元回歸方程做出不同處理因素對雞油菌多酚含量的影響相應三維響應面圖。如圖5所示，響應曲面均為開口向下的凸形曲面，說明含量存在最大值。由圖5a 與圖5c 可知，時間與溫度曲面彎曲程度較大，說明該因素對雞油菌中多酚的含量影響顯著。

圖5 兩因素交互作用對多酚含量影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of two factors on the content of polyphenols

2.2.3 最優(yōu)提取工藝驗證 由Design-Expert.12 求解回歸方程，得出最優(yōu)的雞油菌提取方案為：料液比1:32.48（g/mL）、提取溫度40.49 ℃、乙醇濃度39.64%、超聲時間21.02 min，在此條件下雞油菌多酚含量可達11.80 mg/g?？紤]實際操作的局限性，確定實驗方案為料液比1:32.48（g/mL）、提取溫度40 ℃、乙醇濃度40%、超聲時間21 min。在此條件平行測定三次，驗證性試驗結果的多酚含量為11.80 mg/g，與預測值接近，偏差較小，證實此模型可用來對雞油菌多酚成分進行進一步的提取及優(yōu)化。

2.2.4 超聲提取法與浸泡、索式熱回流兩種提取法的效率比較 為了比較超聲波輔助提取雞油菌多酚含量的優(yōu)勢，采取浸泡提取法與索式熱回流提取法作為對比。將雞油菌粉末在室溫下浸泡24 h 后，測定多酚含量為8.60 mg/g，此方法較為安全，不需控制溫度，缺點是所需時間較長、多酚提取含量較低，可能是由于室溫浸取，溫度較低，分子熱運動較為緩慢，導致多酚溶出減少，提取率較低。在95 ℃條件下，采用索氏提取法提取4 h 后，測得多酚含量為3.60 mg/g，此方法的缺點是溫度過高，會導致酚類物質的分解或者引起其他雜質的溶解，間接導致酚類含量減低。因此，超聲輔助提取雞油菌多酚是一種高效的提取方法。

2.2.5 雞油菌多酚成分的質譜分析 多酚類化合物分子結構中一般都含有酚羥基，具有抗氧化活性，為了進一步研究云南雞油菌中的多酚的種類及含量，本研究通過超高效液相色譜質譜技術UPLC-MS 雞油菌種8 種多酚單體。如圖6、圖7 及表4 所示，雞油菌多酚提取物中質譜分析鑒定出的6 種單體多酚有原兒茶酸、丁香酸、迷迭香酸、沒食子酸、咖啡酸、槲皮素。由表4 可知，雞油菌多酚提取物中沒食子酸含量最高，其次是咖啡酸，然后是丁香酸和原兒茶酸，分析所得到的這六種多酚化合物可能是雞油菌多酚提取物具有抗氧化活性的主要物質。

表4 雞油菌樣品中酚類化合物含量測定結果（μg·g?1）Table 4 Polyphenols content in Cantharelles cibarius (μg·g?1)

圖6 8 種酚類標準品的XIC 圖Fig.6 XIC of 8 kinds of phenolic compounds

圖7 雞油菌多酚提取物中8 種酚類化合物的XIC 圖Fig.7 XIC of 8 kinds of phenolic compounds from Cantharelles cibarius

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 雞油菌多酚對DPPH 自由基的清除作用 由圖8 可知，在實驗濃度范圍內，隨著樣品濃度的增加，雞油菌多酚提取液對DPPH 自由基的清除率逐漸增加，當清除率到77.7%時達到最大，說明雞油菌多酚對DPPH 自由基具有良好的清除效果。

圖8 雞油菌多酚對DPPH 自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on DPPH free radical

2.3.2 雞油菌多酚對ABTS自由基的清除作用 如圖9 所示，在實驗濃度范圍內，雞油菌多酚提取液對ABTS自由基的清除率也具有明顯的量效關系，在濃度0.13（mg/mL）時，清除率為98.8%時達到最大，說明雞油菌多酚樣液具有較強的清除ABTS自由基的能力。

圖9 雞油菌多酚對ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on ABTS+ free radical

2.3.3 雞油菌多酚的Fe還原能力 多酚能使反應體系中Fe還原成Fe，溶液由黃色變成不同程度的藍色，還原能力越強，吸光度越大。由圖10 可知，在0.05～0.20 mg/mL 質量濃度范圍內，隨著樣品質量濃度的增大，雞油菌多酚提取物和抗壞血酸吸光度逐漸增大，表現(xiàn)出良好的還原能力。還原能力可延緩或終止自由基反應，實驗結果提示雞油菌多酚提取物的抗氧化活性良好，多酚質量濃度越高還原能力越強。

圖10 雞油菌多酚的Fe3+還原能力Fig.10 Fe3+ reduction ability of polyphenols from Cantharelles cibarius

3 結論

本文通過超聲乙醇提取法得出雞油菌中多酚的最佳提取條件：料液比1:32（g/mL）、超聲溫度40℃、乙醇濃度40%、超聲時間21 min，多酚的含量為11.80 mg/g，各因素對樣液多酚含量的影響順序為：超聲時間（D）>超聲溫度（B）>料液比（A）>乙醇濃度（C）。通過超高效液相色譜UPLC-MS 質譜技術分析鑒定出雞油菌中包含6 種單體多酚原兒茶酸、丁香酸、迷迭香酸、沒食子酸、咖啡酸、槲皮素。體外抗氧化活性研究表明，雞油菌多酚對DPPH 自由基、ABTS自由基具有較強的清除活性，對Fe還原能力也較強。研究結果表明超聲波輔助提取方法一種簡單快速高效的雞油菌多酚提取方法。