響應(yīng)面法優(yōu)化刺葡萄果實花旗松素提取工藝

牛生洋，王鳳軒，張曉利，余林玉，宋姣姣，姜建福

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009）

花旗松素，又稱二氫槲皮素，分子式為CHO，其主要來源于紫衫、黃衫、落葉松等針葉植物根部。花旗松素是一種天然抗氧化劑，能夠保護(hù)人體免受黑色素、輻射等有毒害物質(zhì)的侵害，是多種名貴中草藥的主要藥效成分，可作為生產(chǎn)醫(yī)藥保健品和食品的珍貴原料。2017 年，歐盟食品安全局（EFSA）已正式公布落葉松提取物（花旗松素）為新資源食品，評估認(rèn)為其不會引發(fā)安全風(fēng)險，也無遺傳毒性風(fēng)險。然而提取花旗松素的材料主要在紫杉、黃杉、等珍稀樹種及落葉松，目前還沒有其他材料可替代，全球尚生產(chǎn)總量不足20 t。

刺葡萄（Foex）又名千斤藤、山葡萄，屬于東亞特有的變種葡萄，因其具有果實大、抗性強(qiáng)、富含花色苷等酚類物質(zhì)的特點，廣泛應(yīng)用于釀酒產(chǎn)業(yè)中。刺葡萄主要分布于湘西地區(qū)，生長于高溫高濕的陰濕地帶，具有育種、入藥、釀酒、生食等多種用途，極具開發(fā)利用價值。近年來，研究發(fā)現(xiàn)葡萄中含有豐富的花旗松素，而刺葡萄是原產(chǎn)我國的野生葡萄資源，目前還未見有從刺葡萄提取花旗松素的報道，從刺葡萄中提取花旗松素將為刺葡萄開發(fā)利用增加新的途徑。

有關(guān)花旗松素的提取已有較多的方法，如沸水熱提取法、利用微波輔助提取、利用復(fù)合酶法提取分離等。但這些方法存在或多或少的問題，如微波輔助提取和沸水熱提取法提取率低且容易造成花旗松素?fù)p失，復(fù)合酶法操作復(fù)雜且成本較高。超聲輔助提取因其操作簡單，成本低廉，綠色環(huán)保等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于酚類物質(zhì)的提取。本研究通過HPLCMS/MS 分析技術(shù)對刺葡萄果實不同部位花旗松素的含量進(jìn)行測定，并對其超聲輔助的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為刺葡萄的開發(fā)及其深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺葡萄 采于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家種質(zhì)葡萄資源圃。根據(jù)往年調(diào)查采收期，在葡萄果實采收期內(nèi)監(jiān)測果實可溶性固形物的變化，直至其穩(wěn)定，種子顏色完全變褐時開始進(jìn)行果實采樣。每個品種選取長勢相似，產(chǎn)量相當(dāng)?shù)? 株樹，從3 棵樹上各選擇位置一致的一個果穗，隨機(jī)取30 粒果粒，為一個重復(fù)，共3 組重復(fù)。花旗松素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，色譜純）、甲醇、無水乙醇、甲基腈、甲酸等均為色譜純 美國Sigma 公司。

LC-MS1000 高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀 惠州藍(lán)超科技有限公司；AR1140 分析天平 深圳市時代之峰科技有限公司；H2100R 高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)有限公司；E-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BZM-160 中草藥粉碎機(jī) 河北本辰科技有限公司；超聲波振蕩儀 深圳市科工達(dá)超聲設(shè)備有限公司；UV-1800G 紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺葡萄果實不同組織中花旗松素的含量測定

1.2.1.1 刺葡萄果實花旗松素提取 提取方法參考文獻(xiàn)[26]進(jìn)行實驗。采集成熟期刺葡萄，用蒸餾水清洗后分離果皮、果肉、種子三個部分，加液氮粉碎后，分別稱取各部分樣品5.00 g，加10 倍體積的50%乙醇溶液于30 ℃浸泡1 h，之后在100 W 的超聲波作用下處理0.5 h，然后在50 ℃下回流提取2 h，用乙醇溶液多次洗滌過濾后稀釋至20 倍定容在容量瓶中，過0.22 μm 濾膜后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

1.2.1.2 刺葡萄果實花旗松素色譜檢測分析 刺葡萄果實不同部位花旗松素含量檢測采用HPLC-MS/MS 技術(shù)。檢測電位設(shè)為正0.7 V，充裝氣體為高純氮氣。流動相A、B、C 分別設(shè)定為甲基腈、甲醇、1%甲酸溶液。色譜柱為ZORBAX SB-C小柱（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）。霧化氣體壓力40 psi，氣體環(huán)境溫度350 ℃，使用之前必須用孔徑為0.4 μm的纖維混合微孔膜過濾流動相，梯度洗脫條件為0 min，10% A，90% B；30 min，15% A，85% B；100 min，30% A，70% B。在280 nm 的紫外檢測波長條件下檢測流動相B、C（即甲醇、1%甲酸溶液），實驗樣品以最后一次抽濾所得液體為主。色譜柱的電位溫度30 ℃、樣品進(jìn)樣量10 μL、樣品流速0.7 mL/min，改變甲醇、1%甲酸溶液的體積分?jǐn)?shù)并進(jìn)行梯度洗脫。檢測方式采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式。定量檢測為多反應(yīng)檢測（multi reaction montior，MRM），數(shù)據(jù)收集為MassHunter 工作平臺（Agilent，USA）。

1.2.2 花旗松素提取工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗設(shè)計 根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果，取刺葡萄果實中花旗松素含量最高的部位進(jìn)行花旗松素提取。提取條件為固定浸泡時間1 h、超聲功率100 W、液料比20:1、超聲時間0.5 h、回流提取時間2 h，分別考察液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g），乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%），提取時間（1、2、3、4、5 h），提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）4 個單因素對花旗松素提取量的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗，主要考察乙醇溶液濃度、提取時間、提取溫度（表1）在花旗松素含量提取過程中三者之間的相互關(guān)系。設(shè)定響應(yīng)面為花旗松素提取量，選取乙醇濃度、提取溫度、提取時間為自變量。用乙醇濃度、溫度和提取時間三因素做花旗松素的函數(shù)。最后，回歸分析試驗結(jié)果的二次響應(yīng)面。三個影響因素與花旗松素提取量之間以及不同影響因素之間的關(guān)系用多元線性回歸方程表示，結(jié)果用圖表直觀顯示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Response surface experimental design

1.2.2.3 花旗松素提取量的測定 確定用于優(yōu)化提取工藝的刺葡萄果實部位后，利用前述方法將花旗松素提取物用甲醇稀釋10 倍，用紫外可見分光光度計在288 nm 處測定其吸光值，并用花旗松素標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后依據(jù)公式（1）進(jìn)行花旗松素提取量計算：

式中：W 表示花旗松素提取量，mg/g；c 表示根據(jù)吸光度值計算出的溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；D 表示溶液稀釋倍數(shù)；V 表示供試品溶液體積，mL；m 表示取樣量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進(jìn)行三次重復(fù)試驗。數(shù)據(jù)采用Designexpert8.06 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。不同處理間的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 軟件中多重比較方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺葡萄果實不同組織中花旗松素含量測定

根據(jù)花旗松素標(biāo)樣質(zhì)譜條件，將刺葡萄果皮、種子及果肉中花旗松素提取物經(jīng)過HPLC-MS/MS 檢測（圖1），結(jié)果表明刺葡萄果皮中的花旗松素含量為3.63±0.18 mg/kg，顯著高于果肉（0.35±0.02 mg/kg）、種子（1.74±0.13 mg/kg）中的花旗松素含量（圖2）（<0.05），說明刺葡萄果實中的花旗松素主要存在于果皮中，這是因為果肉中營養(yǎng)物質(zhì)多以水分及糖酸組分為主，這從圖2 色譜圖中果肉（C）出峰明顯果皮（B）和種子（D）少也能看出，而酚類物質(zhì)多存在于果皮及種子中，與其他酚類物質(zhì)在葡萄果實中的分布規(guī)律一致。由于刺葡萄果皮中花旗松素含量最高，后續(xù)取刺葡萄果皮進(jìn)行花旗松素提取工藝優(yōu)化。由于考慮到質(zhì)譜檢測不僅成本高，而且耗時長，同時對比發(fā)現(xiàn)用分光光度計測量的刺葡萄果實提取物花旗松素含量與HPLC-MS/MS 檢測結(jié)果并無明顯差異，因此選用分光光度法進(jìn)行優(yōu)化提取工藝時花旗松素含量的測定。

圖1 花旗松素標(biāo)樣及果實不同部位樣品HPLC-MS/MS 色譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS analysis of taxifolin standard and different parts of fruit

圖2 刺葡萄果實不同組織中花旗松素的含量Fig.2 Content of taxifolin in different tissues of Vitis davidii

2.2 花旗松素提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素結(jié)果

2.2.1.1 花旗松素提取過程中液料比的影響 當(dāng)其他的試驗條件不變的情況下，增加刺葡萄果皮提取物用量能保證花旗松素的濃度處于高值，增加其提取量。如圖3 所示，花旗松素提取量隨著液料比增大而顯著增加（<0.05）。提取量在液料比為20:1 mL/g時，花旗松素提取量的相對濃度達(dá)到峰值時，之后繼續(xù)提升液料比的提取量也幾乎不會再有增加。由此可以得到提取刺葡萄中花旗松素的最佳液料比是20:1 mL/g。另外，根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果，在提取工藝優(yōu)化時，液料比基本都是20:1 mL/g，因此對液料比不再進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖3 花旗松素提取過程中液料比的影響Fig.3 Influence of extraction temperature during the extraction oftaxifolin

2.2.1.2 花旗松素提取過程中時間的影響 隨著提取時間增加花旗松素提取量也隨之增大，尤其是在1～2 h 之間，隨提取時間的延長，刺葡萄中花旗松素提取量增幅明顯增大（圖4）；而超過4 h 之后，花旗松素的提取量基本不變，說明此時乙醇溶解花旗松素的量到達(dá)飽和，因此選取花旗松素的提取時間為4 h。

圖4 花旗松素提取過程中提取時間的影響Fig.4 Influence of extraction time in the extraction process of taxifolin

2.2.1.3 花旗松素提取過程中溫度的影響 從圖5可知，在其他的試驗條件不變的情況下，花旗松素的提取量隨溫度升高而增大，而在50 ℃之后，溫度的升高花旗松素的提取量并無顯著影響，說明此時乙醇溶解花旗松素的能力達(dá)到最大，而且過高的溫度也會使得花旗松素穩(wěn)定性降低，由此確定最佳提取溫度是50 ℃。

圖5 花旗松素提取過程中提取溫度的影響Fig.5 Influence of extraction temperature during the extraction of taxifolin

2.2.1.4 花旗松素提取過程中乙醇濃度的影響 由圖6 可知，花旗松素的提取量隨乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時，對刺葡萄果皮中花旗松素的提取效率最好，此時花旗松素的提取量為3.47 mg/kg；當(dāng)乙醇濃度超過50%后，花旗松素提取量隨著乙醇濃度增加而呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢。這是因為花旗松素是多羥基化合物，其極性比無水乙醇強(qiáng)比水，由于相似相溶原理，隨著乙醇濃度的增加，對花旗松素的溶解能力也增加，而花旗松素的極性與50%的乙醇溶液的極性相似，因此使用50%的乙醇溶液能最大限度提取葡萄皮渣中的花旗松素，因此花旗松素提取時的乙醇濃度為50%。

圖6 花旗松素提取過程中乙醇濃度的影響Fig.6 Influence of ethanol concentration during the extraction of taxifolin

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.2.1 模型建立 采用BBD 設(shè)計方法，以乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）三個因素為自變量，花旗松素提取量為響應(yīng)值R，進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗結(jié)果見表2。結(jié)果經(jīng)Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到花旗松素提取量為響應(yīng)值的函數(shù)二次回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Response surface test design results

2.2.2.2 方差分析 方差分析表明（表3）所得模型極顯著（=151.86，<0.0001），且方程的失擬誤差不顯著（=2.45，>0.5），表明該模型回歸極為顯著，說明響應(yīng)面所得的結(jié)果是可靠的。比較各個因素值可以看出，其對于花旗松素提取量的影響順序為A>B>C。提取時間（B）與乙醇濃度（A）對花旗松素提取量影響顯著（<0.05），提取溫度（C）對花旗松素提取量影響不顯著；提取時間、乙醇濃度與提取溫度之間相互作用對花旗松素提取量影響均不顯著，但平方項均達(dá)到極顯著水平（<0.01）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

2.2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面的坡度越陡峭則響應(yīng)值對因素的改變越敏感。等高線是表示兩個因素的交互規(guī)律，等高線密集的地方表示二者主要共同作用的方向。應(yīng)用Design-Expert.8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到花旗松素提取量與提取溫度、提取時間、乙醇濃度等之間交互作用的三維效應(yīng)曲面圖。由圖7 所示，乙醇濃度和提取時間、乙醇濃度和提取溫度、提取時間和提取溫度表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線陡峭，說明二者相互作用對花旗松素的提取量均有一定影響。

圖7 響應(yīng)面分析三維效應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface analysis 3D effect surface diagram

2.2.3 優(yōu)化提取參數(shù)與試驗驗證 通過建立的數(shù)學(xué)模型分析，可預(yù)測得到葡萄果皮花旗松素提取量的最佳提取條件為：乙醇含量48.97%、浸泡溫度30 ℃、浸泡時間1 h、超聲功率100 W、超聲時間0.5 h、提取時間4.02 h、提取溫度50.51℃，在此條件下花旗松素理論提取量為3.630 mg/kg。考慮實際操作因素，因此對花旗松素提取工藝的最佳條件進(jìn)行簡化；即簡化工藝條件為：乙醇含量49%、浸泡溫度30 ℃、浸泡時間1 h、超聲功率100 W、超聲時間0.5 h、提取時間4 h、提取溫度51 ℃，重復(fù)三次實驗，此時花旗松素的提取量為（3.587±0.021）mg/kg，與理論值誤差為1.18%，這與已有研究結(jié)果類似，說明該模型真實可靠，可以較準(zhǔn)確的優(yōu)化花旗松素提取工藝。

3 結(jié)論

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以刺葡萄果實為原料，通過HPLC-MS/MS 檢測其不同組織中花旗松素含量，結(jié)果表明刺葡萄果皮中的花旗松素含量為3.63 mg/kg，顯著高于種子（1.74 mg/kg）及果肉（0.35 mg/kg）（<0.05），因此選用刺葡萄果皮作為優(yōu)化花旗松素提取工藝的原料。利用超聲波輔助提取刺葡萄果皮花旗松素，并通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗進(jìn)行的提取工藝優(yōu)化，結(jié)果表明在固定浸泡溫度30 ℃、浸泡時間1 h、液料比20:1 mg/L 的條件下，通過優(yōu)化乙醇含量49%、提取時間4 h、提取溫度51 ℃時花旗松素的提取量達(dá)到3.587 mg/kg，說明花旗松素提取可以在常規(guī)條件下進(jìn)行，為花旗松素的工業(yè)化制備提供了依據(jù)。